2. 716000 陕西 延安,延安大学医学院:预防医学教研室
2. Department of Preventive Medicine, Medical College, Yan'an University, Yan'an, Shaanxi Province, 716000, China
宫颈癌是一种女性常见的恶性肿瘤,在发展中国家的发病率约为发达国家的6倍。早期宫颈癌经过治疗后5年内的生存率高达90%,但是由于大多数宫颈癌患者在确诊时已经处于癌症晚期,加上宫颈癌易转移、易复发,仍然严重威胁着女性的生命健康[1]。癌细胞的增殖、凋亡等与肿瘤生长有关,肿瘤细胞生物学特性的维持需要能量,肿瘤细胞以糖酵解为主要能量代谢途径[2]。整合素连接激酶(integrin-linked kinase, ILK)是一种蛋白激酶,在正常细胞中活性较低,在生长因子、整合素信号转导过程中发挥关键作用[3]。有研究表明,ILK在肿瘤组织中表达水平升高,并且与肿瘤的恶性程度和预后等有关,下调ILK表达后肿瘤细胞的生长受到抑制,凋亡增加[4]。ILK在宫颈癌组织中表达升高[5],而ILK对宫颈癌细胞增殖凋亡及糖酵解的影响尚不清楚。本研究以宫颈癌细胞为研究对象,通过siRNA下调细胞中的ILK,研究ILK在宫颈癌细胞增殖凋亡及糖酵解中的作用,为明确ILK在宫颈癌发生中的作用奠定基础。
1 材料与方法 1.1 主要材料宫颈癌细胞CaSki购自上海酶联生物;己糖激酶(hexokinase,HK)含量检测试剂盒、丙酮酸激酶(pyruvate kinase,PK)含量检测试剂盒、乳酸含量检测试剂盒购自美国Sigma公司;三磷腺苷(adenosine triphosphate, ATP)含量检测试剂盒购自北京Solarbio公司;RNA提取试剂盒购自德国QIAGEN公司;qRT-PCR试剂盒购自美国Bio-Rad公司;二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量试剂盒购自美国Thermo公司;Lipofectamine 2000购自美国Invitrogen公司;ILK siRNA、siRNA control购自美国Cell Signaling公司;ILK、β肌动蛋白(β-actin)引物由南京金斯瑞合成;膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)/碘化丙啶(Propidium Iodide,PI)细胞凋亡检测试剂盒购自上海Bogoo公司;鼠抗ILK单克隆抗体购自美国Stanta Cruz公司;鼠抗β-连环蛋白(β-catenin)单克隆抗体、鼠抗c-myc单克隆抗体购自北京普利莱公司;兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶3(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 3,cleaved Caspase-3)单克隆抗体、兔抗活化的含半胱氨酸的天冬氨酸蛋白水解酶9(cleaved cysteinyl aspartate specific proteinase 9,cleaved Caspase-9)单克隆抗体、兔抗β-actin单克隆抗体购自美国Cell Signaling公司;辣根过氧化物酶标记的IgG购自北京中杉金桥公司。
1.2 细胞转染宫颈癌细胞CaSki培养至对数期以后,以每孔2×105个细胞接种到6孔细胞培养板中,观察细胞浓度为70%时进行细胞转染。将细胞培养液吸除后,加入不含血清的DMEM培养液。取EP管记为A管和B管。在A管中分别添加ILK siRNA和siRNA control,加入不含血清的DMEM混合后,在室温条件下孵育5 min。在B管中添加Lipofectamine 2000和不含血清的DMEM,放置室温中孵育5 min。把A管和B管中的混合液混合后,在37℃,5% CO2培养箱中孵育4 h,更换成含有10%血清的DMEM继续培养。细胞分3组,CaSki细胞转染ILK siRNA和siRNA control分别为干扰组和阴性组,同时以未做转染的细胞作为对照组。
1.3 ILK mRNA水平检测对照组、阴性组、干扰组细胞培养48 h后,按照细胞RNA提取试剂盒提取细胞中的RNA,分光光度计检测RNA的光密度值,D(260)/D(280)比值介于1.8~ 2.0。用cDNA合成试剂盒进行反转录,qRT-PCR检测ILK mRNA水平,内参基因为β肌动蛋白(β-actin),2-△△Ct法计算目的基因的表达水平。qRT-PCR程序为:95 ℃,30 s;95 ℃,5 s;60 ℃,60 s。β-actin上游引物为5′-GAGAAGAGCTATGAGCTG-3′,下游引物5′-ATGATGGAATTGAATGTA-3′。ILK上游引物为5′-TG-AAGACACAAACAGACG-3′,下游引物5′-TCAAGGATAGGCACAATC-3′。
1.4 ILK蛋白水平检测对照组、阴性组、干扰组细胞培养48 h后,取出细胞,加入胰蛋白酶消化后,3 000×g离心5 min,把培养液上清吸除以后,加入细胞裂解液,放在冰上裂解30 min,12 000×g,4 ℃离心10 min,取上清液保存在-80 ℃。用二喹啉甲酸(bicinchoninic acid,BCA)蛋白定量检测试剂盒检测细胞蛋白浓度。将蛋白样品与5×Loading Buffer混合后,放在100 ℃煮沸5 min。蛋白电泳:5%的浓缩胶、10%分离胶,每个泳道添加50 μL的蛋白,在分离胶中用120 V电泳,在浓缩胶中用100 V电泳,观察溴酚蓝进入到电泳槽的底部时,关闭电源,停止电泳。转膜:将聚偏二氟乙烯(polyvinylidene fluoride,PVDF)膜放在甲醇中浸泡2 min,在转移缓冲液中浸泡10 min,200 mA转膜2 h。把PVDF膜放在5%脱脂奶粉中,室温,摇床孵育2 h。结合抗体:PVDF膜放在1 :500稀释的ILK一抗、1 :1 000稀释的β-actin一抗中,在4 ℃孵育过夜,再把膜放在1 :2 000稀释的含有辣根过氧化物标记的IgG中,室温,摇床孵育2 h。ECL发光后,Bio-Rad拍照,用Quantity one分析条带灰度值,以β-actin灰度值为内参,计算目的条带灰度值与β-actin灰度值的比值作为目的蛋白表达水平。
1.5 糖酵解相关指标测定对照组、阴性组、干扰组细胞培养48 h以后,收集各组细胞,检测PK、HK、ATP水平。同时收集各组培养液上清,检测乳酸水平。步骤均参照试剂盒说明书。
1.6 细胞增殖检测对照组、阴性组、干扰组细胞以每孔4 000个细胞接种到96孔细胞培养板中,放在37 ℃,5% CO2培养箱中孵育48 h以后,在每孔中添加20 μL的噻唑蓝(methylthiazolyldiphenyl-tetrazolium bromide,MTT)溶液,在37 ℃条件下孵育4 h。把上清液吸除以后,在每孔中添加二甲基亚砜(dimethyl sulphoxide, DMSO)溶液150 μL,摇床孵育10 min,放在酶标仪上检测570 nm的光密度值[D(570)]。每组设置5个复孔,同时以不加细胞的孔为空白组,计算细胞存活率。
细胞存活率= [实验组D(570)-空白组D(570)]÷ [对照组D(570)-空白组D(570)] ×100%
1.7 细胞凋亡检测对照组、阴性组、干扰组细胞培养48 h以后,取约2×106个细胞,用磷酸缓冲盐溶液(phosphate buffered saline,PBS)将细胞洗涤3次后,1 000×g离心10 min。加入200 μL的结合缓冲液,再加入碘化丙啶(propidium iodide,PI)和膜联蛋白V-FITC(Annexin V-FITC)各5 μL,避光混合反应后,用流式细胞仪检测细胞凋亡水平。
1.8 Cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平测定对照组、阴性组、干扰组细胞培养48 h以后,收集各组细胞,Western blot检测细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平,步骤同1.5。
1.9 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件分析,数据以x±s表示,多组之间数据比较采用单因素方差分析,两两之间的比较用LSD-t检验。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 各组细胞中ILK表达水平阴性组细胞中ILK mRNA和蛋白水平与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞中ILK mRNA和蛋白水平较对照组显著降低(P < 0.05,图 1,表 1)。
组别 | mRNA水平 | 蛋白水平 |
对照组 | 1.00±0.00 | 0.75±0.05 |
阴性组 | 0.97±0.11 | 0.73±0.09 |
干扰组 | 0.32±0.02a | 0.13±0.02a |
a:P < 0.05,与对照组比较 |
2.2 各组细胞中HK、PK、ATP水平及细胞分泌乳酸水平
阴性组细胞中HK、PK、ATP水平和培养液中乳酸含量与对照组相比,差异没有统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞中HK、PK、ATP水平和培养液中乳酸含量较对照组明显降低(P < 0.05,表 2)。表明下调ILK降低宫颈癌细胞糖酵解水平。
组别 | HK /U·mg-1 |
PK /U·mg-1 |
ATP /mmol·L-1 |
乳酸 /mmol·L-1 |
对照组 | 6.31±0.53 | 0.92±0.07 | 30.98±0.32 | 18.46±0.15 |
阴性组 | 6.42±0.61 | 0.95±0.10 | 31.24±0.41 | 17.64±0.18 |
干扰组 | 4.53±0.44a | 0.54±0.06a | 22.75±0.21a | 10.77±0.13a |
a:P < 0.05,与对照组比较 |
2.3 各组细胞增殖、凋亡情况
阴性组细胞存活率、凋亡率与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。与对照组比较,干扰组细胞存活率明显降低,细胞凋亡率明显升高,差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 2, 表 3)。表明下调ILK诱导宫颈癌细胞凋亡,抑制宫颈癌细胞增殖。
组别 | 存活率/% | 凋亡率/% |
对照组 | 100.00±0.00 | 9.33±0.84 |
阴性组 | 99.81±0.89 | 9.71±0.93 |
干扰组 | 61.23±0.52a | 28.47±2.17a |
a:P < 0.05,与对照组比较 |
2.4 各组细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc蛋白水平
阴性组细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9、β-catenin、c-myc水平与对照组相比,差异无统计学意义(P>0.05)。干扰组细胞中cleaved Caspase-3、cleaved Caspase-9水平较对照组明显升高,β-catenin、c-myc水平较对照组明显降低,差异均有统计学意义(P < 0.05, 图 3, 表 4)。提示下调ILK诱导宫颈癌细胞中Caspase-3、Caspase-9活化,抑制宫颈癌细胞中β-catenin、c-myc表达。
组别 | cleaved Caspase-3 | cleaved Caspase-9 | β-catenin | c-myc |
对照组 | 0.78±0.09 | 0.86±0.05 | 1.22±0.13 | 0.74±0.06 |
阴性组 | 0.80±0.06 | 0.84±0.09 | 1.24±0.14 | 0.71±0.10 |
干扰组 | 1.41±0.12a | 1.35±0.15a | 0.63±0.05a | 0.10±0.02a |
a:P < 0.05,与对照组比较 |
3 讨论
ILK参与细胞外基质及细胞信号途径传导过程,是一种丝氨酸/苏氨酸蛋白酶,其可以作用于细胞内的多种相关蛋白,影响细胞的生长、分化等过程,在多种不同的细胞中均有表达[6-7]。目前认为,ILK过度表达似乎是恶性肿瘤的基本特征,其表达水平的高低与肿瘤的预后、病理分期等有关,ILK在膀胱癌、舌鳞癌、胶质瘤等肿瘤组织中表达异常升高,基因敲除膀胱癌、舌鳞癌、胶质瘤等肿瘤细胞中ILK后,肿瘤细胞的恶性程度降低[8-10]。朱向阳等[5]的研究发现,ILK在宫颈癌组织中的表达水平明显高于癌旁组织,并且与宫颈癌的淋巴结转移、浸润程度、分化程度等有关。本实验结果显示,ILK表达下调后的宫颈癌细胞存活率明显降低,细胞凋亡率升高,说明ILK表达下调具有抗宫颈癌的作用。
Caspase是一类与细胞凋亡有关的蛋白家族。Caspase-3是Caspase级联“瀑布”反应的凋亡执行因子,受到多种因素作用后在最后的凋亡程序中起关键作用[11]。Caspase-3在正常情况下以没有活性的酶原状态存在,在受到蛋白酶切割后活化形成cleaved Caspase-3诱导细胞凋亡,Caspase-3是凋亡的效应因子,在凋亡中发挥极其重要的作用,又称死亡蛋白酶[12-15]。Caspase-9是Caspase级联反应的起始因子,活化后可以引起并放大凋亡反应[16]。Caspase-9、Caspase-3在肿瘤组织中表达水平下降,与肿瘤细胞的凋亡有关[17]。本实验结果显示,ILK表达下调后的宫颈癌细胞中Caspase-3、Caspase-9活化水平升高,说明ILK下调可以通过促进Caspase-3、Caspase-9活化诱导宫颈癌细胞凋亡。
肿瘤细胞与正常细胞能量代谢方式不同,其无论是在缺氧还是氧气充足的情况下均以糖酵解为主要供能方式,这种供能方式又称为“有氧糖酵解”[18]。HK、PK是糖酵解中的关键限速酶,其活性的高低可以反映细胞内糖酵解的水平[19]。乳酸是糖酵解的产物之一,糖酵解水平越高,细胞分泌的乳酸水平也就越高[20]。ILK能够调控多种肿瘤细胞的生长,而肿瘤细胞的生长需要能量。本研究发现,ILK下调后的宫颈癌细胞中HK、PK活性明显降低,细胞中ATP水平也明显下降,细胞分泌的乳酸含量也明显下调,说明抑制ILK表达后可以下调宫颈癌细胞糖酵解水平,发挥抗肿瘤的作用。
肿瘤的发生和发展与细胞内多种信号通路及基因的调控有关,是一个极为复杂的过程。Wnt/β-catenin在宫颈癌组织中异常激活,抑制其激活后可以诱导肿瘤凋亡,降低肿瘤细胞的糖酵解水平,Wnt/β-catenin信号通路中β-catenin蛋白水平可以通过影响糖酵解过程中关键酶的活性调控糖酵解过程[21-23]。研究表明,ILK表达下调后可以降低β-catenin的表达水平,影响细胞分化、生长等生物学特性,ILK与Wnt/β-catenin可能具有潜在联系[23]。本研究发现,宫颈癌细胞中下调ILK表达后,细胞中的β-catenin水平表达下降,c-myc水平也下降,Wnt/β-catenin信号通路激活水平下调。这提示ILK下调可能通过抑制Wnt/ β-catenin信号通路的激活影响宫颈癌细胞的增殖、凋亡和糖酵解水平。
综上所述,ILK可能是治疗宫颈癌的潜在靶点,下调ILK表达可能通过抑制Wnt/β-catenin信号通路降低宫颈癌细胞的糖酵解水平,诱导Caspase-3、Caspase-9介导的宫颈癌细胞凋亡,从而抑制宫颈癌细胞增殖,其具体的作用机制需要在后续实验中进行验证。本实验结果明确了下调ILK对宫颈癌细胞增殖凋亡及糖酵解的影响,为研究ILK在宫颈癌发生中的作用奠定了基础,为靶向ILK治疗宫颈癌提供了参考依据。
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