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牛磺熊去氧胆酸抑制Kupffer细胞减轻大鼠肝移植后缺血再灌注损伤
徐雪松, 王孟皓, 白赫, 龚建平     
400010 重庆,重庆医科大学附属第二医院肝胆外科
[摘要] 目的 探讨牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)减轻大鼠肝移植后肝脏缺血再灌注损伤的机制。方法 分离雄性SD大鼠Kupffer细胞并培养,按不同浓度梯度给予TUDCA体外处理24 h,收集细胞上清液并提取蛋白和mRNA。共分为4组:①非活化组;②活化+0 μmol/L组;③活化+50 μmol/L组;④活化+100 μmol/L组。检测炎症因子、IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性、P65入核程度。雄性SD大鼠于术前3 d经腹腔注射TUDCA 400 mg·kg-1·d-1或者等量生理盐水后,建立大鼠肝移植模型,分为3组:①假手术组;②缺血再灌注组(IR组);③IR+TUDCA组。各组大鼠分别于再灌注3、6、24 h后收取肝组织标本以及血液标本,并提取Kupffer细胞中蛋白。检测肝脏病理改变、肝功能、肝细胞凋亡程度、肝脏炎症因子、Kupffer细胞中IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性。结果 TUDCA处理活化的Kupffer细胞后,IL-1β、IL-6、TNF-α分泌减少(P < 0.05),并且IRE1α、TRAF2、p-IKKα、p-IκB、p-P65表达降低(P < 0.05),P65细胞核相对表达程度降低。TUDCA干预大鼠肝移植模型后,肝组织中气球样变性、点灶坏死,汇管区大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润,肝血窦变窄等病理改变显著减轻,IR+TUDCA组Suzuk’s评分(2.95±0.15)较IR组(4.78±0.36)明显降低,肝功能标志物水平下降(P < 0.05),肝实质细胞凋亡数量减少(P < 0.05),IR+TUDCA组凋亡指数(29.1±12.3)较IR组(56.3±17.5)明显降低(P < 0.05),并且IL-1β、IL-6、TNF-α分泌减少(P < 0.05),Kupffer细胞中IRE1α、TRAF2、p-IKKα、p-IκB、p-P65表达降低(P < 0.05)。结论 牛磺熊去氧胆酸能够减轻大鼠肝移植后肝脏缺血再灌注损伤程度,其机制可能是下调IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性抑制Kupffer细胞功能。
[关键词] 牛磺熊去氧胆酸     内质网应激     肝脏缺血再灌注损伤     Kupffer细胞    
Tauroursodeoxycholic acid alleviates ischemia-reperfusion injury in liver graft following transplantation by suppressing Kupffer cell function in rats
XU Xuesong , WANG Menghao , BAI He , GONG Jianping     
Department of Hepatobiliary Surgery, Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010, China
Supported by the National Natural Science Foundation for Young Scholars of China (81500497)
Corresponding author: GONG Jianping, E-mail: gongjianping11@126.com
[Abstract] Objective To investigate the protective effect of tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) against ischemia-reperfusion (IR) injury in the liver graft after transplantation and explore the possible mechanism. Methods Cultured Kupffer cells from male SD rats were activated by stimulation with lipopolysaccharide (LPS) followed by treatment with TUDCA (50 or 100 μmol/L) or PBS for 24 h, and the inflammatory factors and the activity of the IRE1α/TRAF2/NF-κB pathway activity in the supernatant were detected. Male SD rats were divided into sham-operation group, IR group, and IR+TUDCA group (n=15), and in the latter 2 groups, the rats were subjected to daily intraperitoneal injection of normal saline and TUDCA (400 mg/kg) for 3 consecutive days, respectively, before orthotopic liver transplantation was performed. Blood and liver graft samples were collected from the recipient rats at 3, 6, and 24 h after the operation for assessing the graft pathologies, liver function, hepatocyte apoptosis and the proinflammatory factors, and Kupffer cells were isolated to detect the activity of the IRE1α/TRAF2/NF-κB pathway. Results Treatment with TUDCA significantly decreased the secretion of IL-1β, IL-6 and TNF-α (P < 0.05), lowered the expression levels of IRE1α, TRAF2, p-IKKα, p-IκB, and p-P65 (P < 0.05), and reduced intranuclear expression of P65 in LPS-activated Kupffer cells. In the rat models of orthotopic liver transplantation, compared with saline treatment, TUDCA treatment obviously alleviated IR-induced pathologies (including ballooning degeneration, spotted and focal necrosis, massive accumalation of neutrophils in portal area, lymphocyte infiltration, and narrowing of hepatic sinuses) in the liver graft, significantly lowered the Suzuk's score from 4.78±0.36 to 2.95±0.15 (P < 0.05), and reduced the levels of alanine aminotransferase and aspartate transaminase (P < 0.05) and hepatocyte apoptosis (P < 0.05). TUDCA treatment significantly lowered the apoptotic index of the graft from 56.3±17.5 (in saline-treated IR rats) to 29.1±12.3 (P < 0.05), and obviously suppressed the secretion of IL-1β, IL-6, and TNF-α (P < 0.05) and the expression levels of IRE1α, TRAF2, p-IKKα, p-IκB, and p-P65 (P < 0.05) in the Kupffer cells from the recipient rats. Conclusion TUDCA can effectively alleviate IR injury in the liver graft possibly by down-regulating the activity of IRE1α/TRAF2/NF-κB pathway to suppress the function of the Kupffer cells.
[Key words] tauroursodeoxycholic acid     endoplasmic reticulum stress     hepatic ischemia-reperfusion injury     Kupffer cells    

肝移植是终末期肝病患者最有效的治疗手段,近年来肝移植术后生存率也不断提高。但是,肝移植中造成的肝脏缺血再灌注损伤依然是导致移植物失功的主要原因之一。因此,找寻有效的减轻肝移植后肝脏缺血再灌注损伤的方法对于提高肝移植后患者远期生存率十分重要。肝移植缺血再灌注损伤是一个涉及多种因素的复杂过程,包括氧自由基释放、炎症细胞激活、细胞凋亡等。前期研究表明,Kupffer细胞在肝脏缺血再灌注损伤中具有重要作用[1-3]。新近研究认为,Kupffer细胞的内质网应激可能是引起肝脏缺血再灌注损伤的原因, 如内质网应激影响Kupffer细胞分化[4]、促进Kupffer细胞IL-6分泌增加[5]、改变Kupffer细胞对TLR4受体敏感性[6]等,但其具体机制尚不清楚。内质网应激是指细胞内置网稳态被破坏引起的过强的非折叠蛋白反应(unfolded protein response, UPRs),涉及3种跨膜受体的活化,即ATF6、PERK、IRE1α,通过NF-κB通路等启动炎症应答,最终造成炎症反应以及细胞凋亡[7]。KEESTRA-GOUNDER等[8]发现,骨髓源性巨噬细胞内质网应激状态下IRE1α表达增高,可以促进TRAF2向胞内募集,引起NF-κB通路活性的增高,从而促进多种炎症因子的分泌,但其在实质器官缺血再灌注损伤,尤其是肝脏缺血再灌注损伤中的作用,尚少见报道。Kupffer细胞既是肝脏内最大的巨噬细胞群,又在肝脏缺血再灌注损伤中具有重要作用,同时,Kuppfer细胞内过度活化的NF-κB通路以及由此引起下游炎症因子的释放是肝移植后肝脏缺血再灌注损伤进程中的重要因素[9]。因此我们推测Kupffer细胞内质网应激有可能经相似的机制引起肝脏缺血再灌注损伤。TUDCA是一种由牛磺酸与熊去氧胆酸脱水缩合而成的结合型胆汁酸,被认为具有解痉、抗惊厥、抗炎以及溶解结石等多种效应。前期研究表明,TUDCA能够在多种疾病, 如中枢神经退行性疾病[10]、外伤性脑损伤[11], 以及细胞,如骨髓间充质肝细胞[12]、肝癌细胞[13]中发挥内质网应激抑制作用。本实验检测牛磺熊去氧胆酸(tauroursodeoxycholic acid,TUDCA)的内质网应激抑制效应对Kupffer细胞以及肝脏缺血再灌注损伤的作用,并对其机制进行阐述,以期找寻一种对抗肝脏缺血再灌注损伤的新方法。

1 材料与方法 1.1 主要材料

TUDCA购于AbMole BioScience公司(上海),DMEM细胞培养基、脂多糖以及Ⅳ型胶原酶购于Sigma-Aldrich公司(美国),胎牛血清购于Invitrogen公司(美国),ELISA试剂盒购买于Abcam公司(上海),TUNEL试剂盒购买于Roche公司(上海),IRE1α、TRAF2、P65以及IKKα一抗购于Abcam公司(上海)。p-IKKα、p-P65、IκBα、p-IκBα一抗购于Cell Signaling Technology公司(美国),β-actin一抗购于BOSTER Biological Technology公司(武汉)。

1.2 方法

1.2.1 Kupffer细胞分离、培养

参照LI等[14]提出的三步法分离Kupffer细胞,分为4组:①非活化组;②活化+0 μmol/L组;③活化+50 μmol/L组;④活化+ 100 μmol/L组。非活化组培养方法:将Kupffer细胞接种于含10% FBS、100 U/mL青霉素、100 U/mL链霉素的DMEM培养基,培养于37 ℃,5% CO2环境下的敷育箱中。活化组Kupffer细胞以含100 ng/mL LPS的DMEM培养3 h后,添加含不同浓度(0、50、100 μmol/L)的TUDCA的DMEM培养基继续培养24 h。

1.2.2 实验动物和分组

按照改进的方法[15]进行大鼠原位肝移植,保证冷缺血时间小于60 min。雄性SD大鼠(体质量200~300 g,6~8周,75只)均由重庆医科大学实验动物中心提供,按随机数字表法分为3组:①假手术组(n=15),术前未给予特殊药物处理,各大鼠给予开腹手术后未进行原位肝移植手术。术后正常饮食。②缺血再灌注组(IR组,受体=15,供体=15),术前3 d每日经腹腔注射给予相等剂量的生理盐水,受体配对后,进行大鼠原位肝移植手术。术后正常饮食。③IR+TUDCA组(受体=15,供体=15), 术前3 d腹腔注射TUDCA 400 mg· kg-1· d-1[8],受体配对后,进行大鼠原位肝移植手术, 术后正常饮食;于再灌注3、6、24 h后,各组大鼠按60 mg/kg腹腔注射戊巴比妥麻醉,行心脏穿刺收集血液标本。各组选择5只大鼠,分离肝脏Kupffer细胞,并提取细胞蛋白,其余肝脏经门静脉生理盐水灌注以充分排出肝内血液,然后将肝组织保存于液氮中用于后续实验。

1.2.3 ELISA检测Kupffer细胞上清液中IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达水平

根据说明书运用ELISA试剂盒,检测非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组Kupffer细胞培养基上清液中IL-1β、IL-6以及TNF-α等促炎症因子表达水平。同时,检测非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组血清中IL-1β、IL-6以及TNF-α的表达水平。

1.2.4 Real-time quantitative PCR检测Kupffer中IL-1β、IL-6以及TNF-α的转录水平

运用TRIzol(TaKaRa,日本)试剂提取非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组Kupffer细胞总RNA。运用PrimeScriptTM RT reagent Kit (Perfect Real-time;TaKaRa,日本)进行反转录反应。应用SYBR Green I(TaKaRa,日本)以及Icycler IQ Multicolor Real-Time Detection System(Bio-Rad,美国)进行RT-PCR反应。所有样本以β-actin进行标准化。各引物序列见表 1

表 1 RT-PCR引物序列与长度
基因 引物序列(5′→3′) 片段大小(bp)
IL-1β 上游:CTGTGCTGCCTGTGTCTATG 812
下游:CCCTCTCTACTTCACGGTTC
IL-6 上游:GACAAAGCCAGAGTCCTTCAGAG 765
下游:TCCTTAGCCACTCCTTCTGTGAC
TNF-α 上游:ATGAGCACTGAAAGCATGATC 347
下游:AGGCGGTGCTTGTTCCTCA
β-actin 上游:TGGGAATGGGTCAGAAGGA 393
下游:ATTGAGAAAGGGCGTGGC

1.2.5 Western blot检测Kupffer细胞中IRE1α、TRAF2、IKKα、p-IKKα、IκB、p-IκB、P65、p-P65的表达

Kupffer细胞经不同浓度TUDCA处理后,提取细胞总蛋白,运用BCA法测量非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组Kuupffer细胞蛋白浓度。按50 mg/孔上样后电泳并转膜。各条带于5% BSA中封闭1 h。在4 ℃下过夜孵育于IRE1α、TRAF2、IKKα、p-IKKα、IκB、p-IκB、P65、p-P65(均为1: 1 000)以及β-actin (1: 5 000)一抗抗体溶液中。用PBST清洗后,常温孵育于二抗抗体溶液中1 h。运用凝胶成像系统以及ECL法检测各蛋白表达情况。目的蛋白相对表达量均以β-actin进行标准化。

1.2.6 免疫荧光检测Kupffer细胞核P65表达

非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组Kupffer细胞以4%多聚甲醛固定10 min,3% Triton X-100通透20 min,1% BSA封闭30 min后,4 ℃下过夜孵育于p65一抗抗体。PBST清洗非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组Kupffer细胞,常温下孵育于荧光二抗中1 h。PBST清洗后,常温下DAPI孵育10 min。孵育结束后,以抗荧光淬灭剂封片,于荧光显微镜下观察非活化组、活化+0 μmol/L组、活化+50 μmol/L组、活化+100 μmol/L组Kupffer细胞核P65表达情况。

1.2.7 组织病理学检测肝组织病理学变化

于再灌注3、6、24 h后收集假手术组、IR组、IR+TUDCA组大鼠肝脏标本,将提取的肝脏以4%多聚甲醛固定,石蜡包埋并以苏木精-伊红法染色。根据组织病理学结果进行Suzuk评分,对假手术组、IR组、IR+TUDCA组大鼠肝移植后肝组织缺血再灌注损伤程度进行评价。

1.2.8 肝脏缺血再灌注损伤后肝功能评价

于再灌注3、6、24 h后收集假手术组、IR组、IR+TUDCA组大鼠腔静脉血液。运用全自动生化仪(Beckman CX7,Beckman Coulter, CA, USA)检测血清中肝功能标志物水平,包括丙氨酸转移酶(alanine aminotransferase, AST)、天冬氨酸转移酶(aspartate transaminase, ALT)。

1.2.9 TUNEL法检测肝细胞凋亡水平

按照说明书指导进行TUNEL实验,检测假手术组、IR组、IR+TUDCA组肝组织中肝细胞凋亡程度。在显微镜下观察假手术组、IR组、IR+TUDCA肝细胞核染色的情况,以细胞核呈棕色为TUNEL阳性细胞,根据总细胞数量与TUNEL阳性细胞数量比例,评估假手术组、IR组、IR+TUDCA组肝细胞凋亡水平。

1.3 统计学分析

采用SPSS 18.0统计软件,计量资料数据以x±s表示,进行正态性、方差齐性分析,两样本均数比较采用独立样本t检验,多样本均数比较采用方差分析。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 TUDCA对Kupffer细胞活性的影响

分离后2 h的Kupffer细胞呈圆形,且基本贴壁(图 1A);而在分离后12 h,Kupffer细胞由类圆形向梭状变化,细胞密度较2 h时增高(图 1B);在分离后24 h,Kupffer细胞呈典型的梭状,且细胞生长速度以及细胞状态均良好(图 1C)。提示该方法能够较好地分离大鼠Kupffer细胞。MTT实验检测不同浓度TUDCA对细胞活力的影响发现,在0、50、100 μmol/L TUDCA下,细胞增殖活性均>90%,但是在150 μmol/L浓度时,Kupffer细胞增殖活性显著下降[(71.20±7.24)%,图 1DP < 0.05]。因此,我们选择0、50、100 μmol/L TUDCA进行后续实验。

A~C:分别为2、12、24 h;D:MTT检测结果a:P < 0.05,与0~100 μmol/L浓度比较 图 1 不同时间Kupffer细胞形态变化与MTT检测TUDCA处理后Kupffer细胞活力变化

2.2 TUDCA抑制LPS活化的Kupffer细胞分泌促炎因子

经不同浓度的TUDCA处理24 h后,收集各组Kupffer细胞以及细胞上清液。①ELISA检测各组Kupffer细胞炎症因子的表达(图 2A),包括IL-1β、IL-6以及TNF-α,结果显示,较未活化的Kupffer细胞,活化的Kupffer细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α表达量显著升高(P < 0.05)。同时,经不同浓度TUDCA处理后,活化组Kupffer细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等促炎症因子的表达呈浓度依赖性降低(P < 0.05)。②RT-PCR检测各组Kupffer细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子在转录水平上的变化(图 2B),结果显示,经LPS活化以及TUDCA处理后,各组Kupffer细胞IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子mRNA表达水平也呈浓度依赖性下降(P < 0.05),该趋势与ELISA结果一致。提示TUDCA能够有效地抑制活化Kupffer细胞中炎症因子的转录与表达。

a: P < 0.05,与活化+50 μmol/L组比较;b:P < 0.05,与活化+100 μmol/L组比较;c:P < 0.05,与非活化组比较A: ELISA检测各组Kupffer细胞中促炎症因子的分泌;B:RT-RCR检测各组Kupffer细胞中炎症因子的转录 图 2 ELISA、RT-PCR检测Kupffer细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α的分泌和转录

2.3 TUDCA经下调IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性抑制Kupffer细胞功能

Western blot检测结果显示,与未活化的Kupffer细胞相比,活化的Kupffer细胞中IRE1α、TRAF2、p-IKKα、p-IκB以及p-P65蛋白表达显著增高(P < 0.05)。而TUDCA处理后,活化的Kupffer细胞中上述各指标呈浓度依赖性下降(图 3ABP < 0.05)。同时,运用免疫荧光检测各组Kupffer细胞中P65入核的情况,结果显示,在TUDCA处理后,活化的Kupffer细胞中p65入核程度也明显下降(图 3CDP < 0.05)。提示TUDCA能够显著地经下调IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性抑制活化的Kupffer细胞的功能。

1:活化+0 μmol/L组;2:活化+50 μmol/L组;3:活化+100 μmol/L组;4:非活化组;a:P < 0.05,与活化+50 μmol/L组比较;b:P < 0.05,与活化+100 μmol/L组比较;c:P < 0.05,与非活化组比较; A:经不同浓度TUDCA处理后,非活化组、活化组Kupffer细胞中IRE1α、TRAF2、p-IKKα、p-IκBα以及p-P65表达情况;B、C:各蛋白相对表达量检测;D:经不同浓度TUDCA处理后,非活化组、活化组Kupffer细胞中P65细胞核相对表达情况 图 3 免疫荧光及Western blot检测Kupffer细胞中IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性

2.4 TUDCA能有效改善肝脏缺血再灌注损伤和肝功能标志物水平

血清肝功能标志物检测结果显示(图 4A),IR组血清AST、ALT水平显著高于假手术组(P < 0.05);而TUDCA处理后,在IR+TUDCA组中,血清AST、ALT水平较IR组显著下降(P < 0.05)。组织病理学结果显示(图 4B),在假手术组中,肝细胞以及胆管细胞未见明显异常,汇管区未见明显炎症细胞浸润;在IR组中,肝细胞水肿,呈气球样变性,可见点灶坏死,汇管区见大量中性粒细胞、淋巴细胞浸润,肝血窦变窄,且随再灌注时间延长,上述病理改变越明显。在IR+TUDCA组中,各时间点肝组织病理改变较IR组显著减轻,仅见少量肝细胞水肿,汇管区见少量中性粒细胞、淋巴细胞浸润;IR组Suzuk’s评分(4.78±0.36)显著高于假手术组[(1.27±0.21),P < 0.05],而TUDCA处理后,IR+TUDCA组Suzuk’s评分(2.95±0.15)也较IR组明显降低(P < 0.05)。表明运用TUDCA能够有效地改善肝功能标志物水平和肝脏缺血再灌注损伤程度。

A:各组大鼠血清ALT、AST水平变化a: P < 0.05,与假手术组比较;b:P < 0.05,与IR组比较;B:再灌注后24 h各组大鼠肝脏病理学变化;方框示400倍观 图 4 各组大鼠肝脏组织病理学变化

2.5 TUDCA能够减轻肝细胞凋亡水平

TUNEL实验结果显示,假手术组几乎未见到TUNEL阳性的肝细胞(图 5A)。IR组中TUNEL阳性的肝细胞数量明显增加(图 5B);而经TUDCA处理后,IR+TUDCA组中,呈棕色的肝细胞核数量较IR组显著减少(图 5C)。凋亡指数分析显示,IR组(56.3±17.5)凋亡指数显著高于假手术组[(5.0±3.2),P < 0.05],而TUDCA处理后,IR+TUDCA组凋亡指数(29.0±12.3)较IR组明显降低(P < 0.05)。提示TUDCA能够通过抑制内质网应激状态,减轻由于肝移植后肝脏缺血再灌注损伤引起的肝细胞凋亡。

A:假手术组;B:IR组;C:IR+TUDCA组 图 5 TUNEL实验检测各组大鼠肝细胞凋亡程度(×400)

2.6 TUDCA能够抑制Kupffer细胞功能减轻IR引起的炎症反应

提取各时间点大鼠血清标本,对各组标本中IL-1β、IL-6以及TNF-α表达水平进行检测。ElISA实验检测结果显示,与假手术组相比,IR组血清中IL-1β、TNF-α以及IL-6显著升高(P < 0.05),但是IR+TUDCA组与IR组相比,上述各指标显著下降(P < 0.05,图 6)。提示TUDCA能够在体内经下调Kupffer细胞各炎症因子的表达,从而减轻肝脏缺血再灌注损伤引起的肝脏炎症反应。

a: P < 0.05,与假手术组比较;b:P < 0.05,与IR组比较 图 6 ELISA检测各组大鼠血清中IL-1β(A)、IL-6(B)、TNF-α(C)表达

Western blot检测结果显示,与假手术组相比,IR组中IRE1α、TRAF2、p-IKKα、p-IκB、p-P65表达水平均显著升高(P < 0.05);TUDCA处理后,与IR组,IR+TUDCA组比较上述各指标均显著下降(P < 0.05,图 7)。提示TUDCA能够在体内显著下调肝脏缺血再灌注损伤中Kupffer细胞IRE1α/TRAF2/NF-κB通路的活性。

1:假手术组; 2:IR组; 3:IR+TUDCA组A:Western blot检测结果;B:半定量分析a: P < 0.05,与假手术组比较;b:P < 0.05,与IR组比较 图 7 Western blot检测IRE1α/TRAF2/NF-κB通路相关蛋白表达

3 讨论

肝脏缺血再灌注损伤是一种肝胆外科常见的病理生理过程,尤其是在肝移植术后,其可能引起急、慢性排斥反应,甚至移植物失功,严重影响患者术后肝功能恢复以及远期生存率[16]。前期研究表明,早期内质网应激对细胞有着保护效应,而过强的内质网应激促进肝实质细胞凋亡[17],其机制主要激活了CHOP基因[18]、JNK信号通路[19]、Caspase12信号通路[20]等凋亡相关信号通路。然而,新近研究表明,在肝脏缺血再灌注的进程中,除了肝脏实质细胞过强的内质网应激能够直接引起肝实质细胞凋亡,促进肝脏组织损伤外,Kupffer细胞内过强的内质网应激对Kupffer细胞的活化以及功能产生影响,从而参与到肝脏缺血再灌注损伤的病理过程中[21]。因此,有效的抑制Kupffer细胞内质网应激对于减轻肝移植后肝脏缺血再灌注损伤有着重要的意义。

TUDCA具有显著的内质网应激抑制效应,在多种内质网应激相关疾病[22-24]的病理过程中起到保护性作用,本实验从体内、体外研究了以TUDCA抑制Kupffer细胞内质网应激,从而抑制Kupffer细胞活化和多种炎症因子分泌,减轻肝脏缺血再灌注损伤方面的作用。本实验结果显示,在体外,较非活化组,活化+0μmol/L组(未给予TUDCA处理)Kupffer细胞上清液中IL-1β、IL-6、TNF-α的转录和表达均显著升高;经TUDCA处理后,活化的Kupffer细胞上清液中多种炎症因子,如IL-1β、IL-6、TNF-α均显著下降。在体内,较Sham组、IR组肝脏组织损伤程度、肝功能标志物水平以及肝细胞凋亡的程度均显著增高,血清中IL-1β、IL-6、TNF-α的表达也增高;经TUDCA处理后,IR+TUDCA组肝脏组织损伤程度、肝功能标志物水平以及肝细胞凋亡的程度均显著下降。本实验结果显示,内质网应激下活化的Kupffer细胞分泌在大鼠肝移植后肝脏缺血再灌注损伤中有着重要的作用,进一步证实了Kupffer细胞在肝脏缺血再灌注损伤中的作用,而TUDCA能够较好的减轻肝脏缺血再灌注损伤程度,并且能够有效地抑制Kupffer细胞中IL-1β、IL-6、TNF-α等炎症因子的分泌。

前期研究表明,TRAF2对于NF-κB通路活性的激活有着十分重要的意义[25-26],而在过强的内质网应激下,高表达的IRE1α有着向细胞内募集TRAF2的能力[27],因此,我们假设,IRE1α/TRAF2/NF-κB通路能够作为一个桥梁,将Kupffer细胞内质网应激与其在肝脏缺血再灌注损伤中的作用联系起来。本研究证明,在体外,TUDCA能够呈浓度依赖性的下调IRE1α、TRAF2、p-IKKα、p-IκBα、p-P65的表达,并且下调p-P65在细胞核内的表达;同时,在体内,较IR组,TUDCA处理后,在再灌注24 h后提取的Kupffer细胞中,上述各蛋白的表达也呈下降趋势。实验结果初步证明,TUDCA能够通过下调IRE1α/TRAF2/NF-κB通路活性,抑制活化的Kupffer细胞功能,减轻大鼠肝移植后肝脏缺血再灌注损伤的程度。TUDCA可能是一种新颖的方法,通过抑制Kupffer细胞内质网应激,有效地减轻肝脏缺血再灌注损伤。

本实验未敲除IRE1α、TRAF2基因或应用IRE1α、TRAF2特异性抑制剂,对于机制研究存在不足。同时,内质网应激存在多种炎症反应的通路,本研究只讨论了NF-κB相关的炎症通路,对其他可能的信号通路未进行讨论。因此,对于是否存在其他更多的信号通路参与到TUDCA的保护性作用之中,尚有待进一步研究。另外,值得注意的是,作为一种非经典的细胞凋亡机制,与传统的死亡受体信号通路、线粒体凋亡相关信号通路相比,内质网应激引起肝细胞的凋亡在肝移植后肝脏缺血再灌注损伤中是否占主要作用,也需要在后续实验中进一步明确。

参考文献
[1] OGAWS K, KONDO T, TAMURA T, et al. Influence of Kupffer cells and platelets on ischemia-reperfusion injury in mild steatotic liver[J]. World J Gastroenterol, 2013, 19(9): 1396–1404. DOI:10.3748/wjg.v19.i9.1396
[2] WU Y, ZHANG W, LI M, et al. Nobiletin ameliorates ischemia- reperfusion injury by suppressing the function of Kupffer cells after liver transplantation in rats[J]. Biomed Pharmacother, 2017, 89: 732–741. DOI:10.1016/j.biopha.2017.02.087
[3] BANAN B, XIAO Z, WATSON R, et al. Novel strategy to decrease reperfusion injuries and improve function of cold-preserved livers using normothermic ex vivo liver perfusion machine[J]. Liver Transpl, 2016, 22(3): 333–343. DOI:10.1002/lt.24352
[4] PARK J K, SHAO M, KIM M Y, et al. An endoplasmic reticulum protein, Nogo-B, facilitates alcoholic liver disease through regulation of kupffer cell polarization[J]. Hepatology, 2017, 65(5): 1720–1734. DOI:10.1002/hep.29051
[5] GAO J, JIANG Z, WANG S, et al. Endoplasmic reticulum stress of Kupffer cells involved in the conversion of natural regulatory T cells to Th17 cells in liver ischemia-reperfusion injury[J]. J Gastroenterol Hepatol, 2016, 31(4): 883–889. DOI:10.1111/jgh.13163
[6] RAO J, YUE S, FU Y, et al. ATF6 mediates a pro-inflammatory synergy between ER stress and TLR activation in the pathogenesis of liver ischemia-reperfusion injury[J]. Am J Transplant, 2014, 14(7): 1552–1561. DOI:10.1111/ajt.12711
[7] CELLI J, TSOLIS R M. Bacteria, the endoplasmic reticulum and the unfolded protein response: friends or foes[J]. Nat Rev Microbiol, 2015, 13(2): 71–82. DOI:10.1038/nrmicro3393
[8] KEESTRA-GOUNDER A M, BYNDLOSS M X, Seyffert N, et al. NOD1 and NOD2 signalling links ER stress with inflammation[J]. Nature, 2016, 532(7599): 394–397. DOI:10.1038/nature17631
[9] SAKAI N, VANSWERINGEN H L, SCHUSTER R, et al. Receptor activator of nuclear factor-κB ligand (RANKL) protects against hepatic ischemia/reperfusion injury in mice[J]. Hepatology, 2012, 55(3): 888–897. DOI:10.1002/hep.24756.
[10] LAUNAY N, RUIZ M, GRAU L, et al. Tauroursodeoxycholic bile acid arrests axonal degeneration by inhibiting the unfolded protein response in X-linked adrenoleukodystrophy[J]. Acta Neuropathol, 2017, 133(2): 283–301. DOI:10.1007/s00401-016-1655-9
[11] SUN D, GU G, WANG J, et al. Administration of tauroursodeoxycholic acid attenuates early brain injury via Akt pathway activation[J]. Front Cell Neurosci, 2017, 11: 193. DOI:10.3389/fncel.2017.00193
[12] YOON Y M, LEE J H, YUN S P, et al. Tauroursodeoxycholic acid reduces ER stress by regulating of Akt-dependent cellular prion protein[J]. Sci Rep, 2016, 6: 39838. DOI:10.1038/srep39838
[13] UPPALA J K, GANI A R, RAMAIAH KVA. Chemical chaperone, TUDCA unlike PBA, mitigates protein aggregation efficiently and resists ER and non-ER stress induced HepG2 cell death[J]. Sci Rep, 2017, 7(1): 3831. DOI:10.1038/s41598-017-03940-1
[14] LI P Z, LI J Z, LI M, et al. An efficient method to isolate and culture mouse Kupffer cells[J]. Immunol Lett, 2014, 158(1-2): 52–56. DOI:10.1016/j.imlet.2013.12.002
[15] WU Y, WANG Y, LI M, et al. Gadolinium chloride suppresses acute rejection and induces tolerance following rat liver transplantation by inhibiting Kupffer-cell activation[J]. Exp Ther Med, 2014, 8(6): 1777–1782. DOI:10.3892/etm.2014.2015
[16] ZHANG Y Q, DING N, ZENG Y F, et al. New progress in roles of nitric oxide during hepatic ischemia reperfusion injury[J]. World J Gastroenterol, 2017, 23(14): 2505–2510. DOI:10.3748/wjg.v23.i14.2505
[17] GROOTJANS J, KASER A, KAUFMAN R J, et al. The unfolded protein response in immunity and inflammation[J]. Nat Rev Immunol, 2016, 16(8): 469–484. DOI:10.1038/nri.2016.62
[18] SHAH A, KUMAR A. Methamphetamine-mediated endoplasmic reticulum (ER) stress induces type-1 programmed cell death in astrocytes via ATF6, IRE1αand PERK pathways[J]. Oncotarget, 2016, 7(29): 46100–46119. DOI:10.18632/oncotarget.10025
[19] BROWN M, STRUDWICK N, SUWARA M, et al. An initial phase of JNK activation inhibits cell death early in the endoplasmic reticulum stress response[J]. J Cell Sci, 2016, 129(12): 2317–2328. DOI:10.1242/jcs.179127.
[20] SU C C. Tanshinone IIA could inhibit pancreatic cancer BxPC-3 cells through increasing PERK, ATF6, caspase-12 and CHOP expression to induce apoptosis[J]. J Bio Sci Eng, 2015, 8(3): 149–159. DOI:10.4236/jbise.2015.83015
[21] IMARISIO C, ALCHERA E, Bangalore Revanna C, et al. Oxidative and ER stress-dependent ASK1 activation in steatotic hepatocytes and Kupffer cells sensitizes mice fatty liver to ischemia/reperfusion injury[J]. Free Radic Biol Med, 2017, 112: 141–148. DOI:10.1016/j.freeradbiomed.2017.07.020
[22] LAUNAY N, RUIZ M, GRAU L, et al. Tauroursodeoxycholic bile acid arrests axonal degeneration by inhibiting the unfolded protein response in X-linked adrenoleukodystrophy[J]. Acta Neuropathol, 2017, 133(2): 283–301. DOI:10.1007/s00401-016-1655-9
[23] RANI S, SREENIVASAIAH P K, KIM J O, et al. Tauroursodeoxycholic acid (TUDCA) attenuates pressure overload-induced cardiac remodeling by reducing endoplasmic reticulum stress[J]. PLoS One, 2017, 12(4): e0176071. DOI:10.1371/journal.pone.0176071
[24] PARIDAENS A, RAEVENS S, COLLE I, et al. Combi-nation of tauroursodeoxycholic acid and N-acetylcysteine exceeds standard treatment for acetaminophen intoxication[J]. Liver Int, 2017, 37(5): 748–756. DOI:10.1111/liv.13261
[25] TAMINIAU A, DRAIME A, TYS J, et al. HOXA1 binds RBCK1/HOIL-1 and TRAF2 and modulates the TNF/NF-κB pathway in a transcription-independent manner[J]. Nucleic Acids Res, 2016, 44(15): 7331–7349. DOI:10.1093/nar/gkw606
[26] MITSUUCHI Y, BENETATOS C A, DENG Y, et al. Bivalent IAP antagonists, but not monovalent IAP antagonists, inhibit TNF-mediated NF-κB signaling by degrading TRAF2-associated cIAP1 in cancer cells[J]. Cell Death Discov, 2017, 3: 16046. DOI:10.1038/cddiscovery.2016.46
[27] KEESTRA A M, WINTER M G, AUBURGER J J, et al. Manipulation of small Rho GTPases is a pathogen-induced process detected by NOD1[J]. Nature, 2013, 496(7444): 233–237. DOI:10.1038/nature12025
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201803187
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

徐雪松, 王孟皓, 白赫, 龚建平.
XU Xuesong, WANG Menghao, BAI He, GONG Jianping.
牛磺熊去氧胆酸抑制Kupffer细胞减轻大鼠肝移植后缺血再灌注损伤
Tauroursodeoxycholic acid alleviates ischemia-reperfusion injury in liver graft following transplantation by suppressing Kupffer cell function in rats
第三军医大学学报, 2018, 40(18): 1644-1652
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(18): 1644-1652
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201803187

文章历史

收稿: 2018-03-26
修回: 2018-05-08

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