2. 400715 重庆，西南大学食品科学学院;
3. 100094 北京，中国航天员科研训练中心营养与食品工程重点实验室
2. College of Food Science, Southwest University, Chongqing, 400715;
3. Key Laboratory of Space Nutrition and Food Engineering, China Astronaut Research and Training Center, Beijing, 100094, China
乳腺癌是严重危害生命健康的常见恶性肿瘤，在美国其发病率位居女性肿瘤首位，2017年新发病例超过25万例[1]。随着我国经济条件的发展和居民生活方式的改变，乳腺癌发病率在我国呈快速上升趋势，特别是在上海、广州等经济发达地区，乳腺癌已成为女性常见肿瘤，其防治压力日益增大[2-3]。尽管乳腺癌患者5年生存率已显著提高，可达80%，但乳腺癌因容易复发且易转移而危及生命[4]，特别是三阴性乳腺癌(ER-、PR-和HER-2-)，由于缺乏有效的治疗靶点，且侵袭转移性极强，因此预后差，死亡风险高，一直是乳腺癌治疗的一个难点。如何有效预防和抑制乳腺癌特别是三阴性乳腺癌的转移是一项重要的研究课题。癌细胞的迁移和侵袭涉及众多蛋白表达的调控，其中Snail、vimentin和基质金属蛋白酶(matrix metallo proteinases, MMPs)的升高和跨膜蛋白E-cadherin的降低是导致细胞迁移和侵袭发生的关键[5-7]。雷帕霉素靶蛋白(mammalian target of rapamycin, mTOR)参与细胞内一系列生理病理过程，其介导的信号通路调控细胞的生长、增殖和凋亡等，同时mTOR信号通路的激活，会上调Snail、MMPs等蛋白的表达，在肿瘤细胞的迁移和侵袭过程中发挥重要作用[8-9]。
乳腺癌的发生、发展与膳食因素关系密切。类黄酮(flavonoids)是一类天然植物多酚化合物，广泛存在于各类水果、蔬菜、茶等植物食物中，2007年美国农业部公布了新的食物成分数据库，其中即包含了类黄酮化合物含量的数据，这标志着类黄酮已成为广受重视的一类食物成分。二氢杨梅素(dihydromyricetin，DHM)是藤茶中主要的活性化合物，具有抗氧化、护肝等活性。研究表明，DHM可显著抑制多种肿瘤细胞的生长[10-12]，但其对乳腺癌细胞的迁移和侵袭是否发挥抑制效应尚少见报道。本研究观察DHM对三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭的影响，同时探讨可能的分子作用机制。
1 材料与方法 1.1 细胞及培养人乳腺癌细胞MDA-MB-231购于中国科学院上海细胞库。细胞采用RPMI1640培养液，均添加10%标准胎牛血清，于37 ℃、5% CO2条件下常规培养传代。
1.2 主要试剂DHM (HPLC≥98%)购自成都曼思特生物科技有限公司，RPMI1640培养液和胎牛血清购自HyClone北京公司，各种抗体购自Cell Signaling Technology公司(Danvers, MA)，Transwell小室和基质胶(Matrige1)购自美国Coming公司，其余试剂和材料均购自Sigma-Aldrich公司。
1.3 Transwell实验检测收集不同浓度DHM处理24 h的细胞，以无血清培养液制备单细胞悬液，调整细胞密度为2×105个/mL，分别取200 μL细胞悬液加入Transwell上室，取500 μL含10%血清的细胞培养液加入下室，置于培养箱中常规培养。24 h后取出，用棉签擦拭上室细胞，PBS冲洗3次，多聚甲醛溶液固定20 min；结晶紫染色20 min，PBS漂洗2～3次；风干后于倒置显微镜下观察，并取5个视野记录迁移细胞数，以平均数反映细胞迁移能力。侵袭检测时，先将Transwell小室置于24孔板中，加入500 μL按体积比1 :8配置的Matrigel和细胞培养液的混合液，4 ℃风干，包被Transwell小室底膜的上室面，其余步骤同迁移检测。实验重复3次，用Graph PadPrism 5软件分析数据。
1.4 蛋白质印迹法检测收集各组处理细胞，加入RIPA裂解液，提取细胞总蛋白，测定蛋白浓度。配制10%分离胶，蛋白上样，以80V行30 min、120V行90 min电泳；电泳后转至PVDF膜，加入含5%脱脂奶粉的封闭液，上摇床2 h，然后加入相应一抗(稀释比例均为1 :1 000)，4 ℃孵育过夜；TBST洗3次，10 min/次，加入二抗(稀释比例均为1 :10 000)，上摇床2 h；TBST洗涤5次，加入ECL试剂进行显色。应用Image J软件对蛋白条带灰度值进行分析。
1.5 裸鼠移植瘤模型的构建及处理BALB/c裸鼠12只，雌性，6～8周龄，体质量20～25 g，购买于陆军军医大学(第三军医大学)实验动物中心(合格证号SYXC-2014-00012)，适应性喂养7 d。收集生长状态良好的对数期MDA-MB-231细胞，制备单细胞悬液，调整细胞浓度为5×106个/mL，用酒精棉球将裸鼠受试部位擦拭干净，在裸鼠的右侧上肩处，用1 mL注射器皮下注射细胞悬液，100 μL/只。注射后4～6 d，即可观察到移植瘤长出。在注射10 d后，将裸鼠采用随机数字表法分为DHM组和对照组，每组各6只，DHM组以100 mg(kg·d)-1剂量灌胃，对照组以等量生理盐水灌胃，连续处理7 d后，宰杀取材。本研究符合陆军军医大学(第三军医大学)实验动物伦理委员会制定的伦理学标准。
1.6 肿瘤组织蛋白表达水平的检测取移植瘤组织，常规制作石蜡切片，将切片置于67 ℃烘箱中2 h后，脱蜡，切片放入抗原修复液中，低火持续加热10 min进行抗原修复；3% H2O2室温孵育15 min，以消除内源性过氧化物酶的活性，然后滴加正常山羊血清，室温孵育15 min，进行血清封闭；将一抗稀释液稀释的一抗滴加并完全覆盖组织，湿盒内4 ℃孵育过夜；PBS稀释的二抗滴加并完全覆盖组织，湿盒内37 ℃孵育30 min；擦干切片，滴加HRP标记亲和素，37 ℃孵育30 min；最后进行DAB显色，苏木精复染、脱水、透明和封片。照相后利用Image J软件进行分析，对蛋白表达水平进行定量评价。
1.7 统计学分析数据均以x±s表示，采用SPSS 16.0统计软件进行单因素方差分析，两组间差异比较采用t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 二氢杨梅素抑制乳腺癌细胞迁移和侵袭我们首先采用Transwell法检测了DHM对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭能力的影响。结果显示，DHM处理乳腺癌细胞24 h，与对照组相比，细胞迁移和侵袭能力均显著降低(P < 0.05，P < 0.01，图 1)，且呈剂量-效应关系，DHM可有效抑制MDA-MB-231细胞的迁移和侵袭。
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| Transwell法检测不同浓度DHM对MDA-MB-231细胞迁移与侵袭的影响(结晶紫×200)；B: DHM对MDA-MB-231细胞迁移能力的影响；C: DHM对MDA-MB-231细胞侵袭能力的影响1:对照组(0 μmol/L)；2～4:分别为10、20、40 μmol/L的DHM；a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与对照组(0 μmol/L)比较 图 1 二氢杨梅素对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭的影响 |
2.2 二氢杨梅素抑制乳腺癌细胞侵袭相关蛋白的表达
蛋白表达水平的检测结果显示，DHM处理乳腺癌MDA-MB-231细胞24 h，与对照组相比，细胞迁移和侵袭相关蛋白Snail、vimentin、MMP-2和MMP-9表达水平显著降低(P < 0.01，图 2)，而抑制细胞迁移蛋白E-cadherin表达水平显著升高，这表明DHM可通过调节相关蛋白的表达抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭。
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| 1:对照组(0 μmol/L)；2～4:分别为10、20、40 μmol/L的DHM; a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与对照组(0 μmol/L)比较A: Western blot检测结果; B: Snail、vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平半定量分析；C: E-cadherin蛋白表达水平半定量分析 图 2 二氢杨梅素对乳腺癌细胞MDA-MB-231迁移和侵袭相关蛋白表达的影响 |
利用乳腺癌细胞裸鼠移植瘤模型，我们观察了DHM膳食处理对体内MDA-MB-231细胞相关蛋白表达的影响。免疫组化检测结果显示，DHM膳食干预(100 mg/kg)可显著降低体内移植瘤组织内Snail、vimentin和MMP-9的表达，提高E-cadherin的表达(P < 0.01，图 3)，这与体外研究结果一致。
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| a: P < 0.05, 与对照组(0 μmol/L)比较；C: E-cadherin蛋白表达水平半定量分析A:免疫组织化学法检测蛋白表达水平(S-P)箭头表示阳性表达细胞；B: Snail、vimentin、MMP-2和MMP-9蛋白表达水平半定量分析 图 3 二氢杨梅素膳食干预对乳腺癌细胞MDA-MB-231裸鼠移植瘤组织侵袭相关蛋白表达的影响 |
2.3 二氢杨梅素抑制乳腺癌细胞mTOR信号通路
mTOR信号通路在癌细胞的迁移和侵袭中发挥重要作用，其持续激活会诱导Snail等关键蛋白的表达，促进细胞的转移。我们检测了DHM对乳腺癌细胞mTOR及其下游蛋白激活的影响，结果显示，DHM可显著降低磷酸化mTOR、4EBP1、S6K70和eIF4B的水平，而对相应总蛋白的表达水平无显著影响，这表明DHM可显著抑制MDA-MB-231细胞内mTOR和下游蛋白4EBP1、S6K70、eIF4B的激活(图 4)。
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| 1:对照组(0 μmol/L)；2～4:分别为10、20、40 μmol/L的DHM；A: Western blot检测结果; B:半定量分析结果a: P < 0.05, b: P < 0.01, 与对照组(0 μmol/L)比较 图 4 二氢杨梅素对乳腺癌MDA-MB-231细胞mTOR及其下游蛋白激活的影响 |
3 讨论
DHM是药食两用植物藤茶中的主要活性成分，前期研究[10-12]已证实，DHM具有显著的抑癌效应，可有效抑制多种肿瘤细胞的生长，但DHM对于乳腺癌细胞的迁移和侵袭是否具有显著作用，尚少见报道。本研究发现，DHM能够有效抑制三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231的迁移和侵袭，其分子机制可能涉及对mTOR信号通路的抑制作用。本研究结果对于探讨乳腺癌防治的膳食营养干预策略具有一定的参考价值，并对开发有关DHM的辅助性治疗药物提供重要的实验依据。
植物化学物在“慢性非传染性疾病”防治中的作用日益受到关注，特别是其对于心血管病、糖尿病、肿瘤等发生、发展的抑制效应和作用机制，成为多方研究领域的一项重要课题[13-15]。藤茶在我国南方地区特别是西南地区，有广泛分布，资源丰富，西南山区的瑶族、土家族等少数民族自古就有饮用藤茶的习惯，食用安全性已得到充分证实。DHM是藤茶中含量极为丰富的一种植物化学物，在藤茶的嫩茎叶中含量可高达20%以上(以干质量计)[16]。本研究发现，DHM在体内外可有效抑制乳腺癌细胞的迁移和侵袭，这提示，通过饮用藤茶大量摄入DHM，可能能够抑制乳腺肿瘤的发展和演变，是一个切实可行且值得深入研究的膳食防治策略。当然，本实验结果仅来源于细胞和动物实验，DHM在人体内是否发挥显著作用，尚需要进一步研究证实。
肿瘤的转移过程极其复杂，涉及众多信号通路和功能蛋白，但主要包括以下几个步骤：肿瘤细胞发生转化，由上皮特性向间质细胞转变，使其更具变形和迁移能力，在此“上皮-间质转化(epithelial to mesenchymal transition)”的过程中，N-cadherin表达的上升和E-cadherin表达的下降发挥关键作用[17-18]；转化的肿瘤细胞逐渐与内皮细胞基底膜成分发生粘附，通过MMPs等蛋白的作用，对基底膜成分开始局部分解，然后分离，移动到远处部位；游离的肿瘤细胞最后在继发部位增生，形成转移灶。我们的研究发现，DHM可显著下调Snail、MMP-2、MMP-9的表达，同时上调E-cadherin的表达，这表明DHM可有效抑制乳腺肿瘤细胞的上皮-间质转化，且抑制肿瘤细胞的分离，在多个环节抑制乳腺肿瘤的转移。
mTOR是细胞生长和分化的关键调节因子，其介导的信号通路参与细胞生长、增殖、转化等生命过程。研究表明，在肿瘤细胞内mTOR信号通路往往过度激活，这与肿瘤细胞的快速生长、增殖密切相关，并参与肿瘤细胞的迁移和侵袭[19-20]。mTOR的下游主要包括2种信号分子：核糖体S6K70和真核细胞翻译起始因子4E结合蛋白1(4EBP1)，这2种蛋白均可激活与核糖体生物合成及翻译相关的生物过程，包括细胞周期完成所必需的蛋白质合成。mTOR除了可以通过S6K70和4EBP1对蛋白质翻译进行调控外，还可介导下游多种效应分子和转录因子发生磷酸化激活。研究表明，mTOR信号的过度激活会上调Snail等蛋白的表达，直接促进肿瘤细胞的转移[21]。本研究发现，DHM可抑制mTOR及其下游信号蛋白的激活，这可能是DHM抑制乳腺肿瘤细胞转移的重要分子机制，相关研究有待进一步深入探讨。
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