2. 610081 成都, 凤凰山77120部队卫生连;
3. 400038 重庆, 陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系:毒理学研究所
2. Medical Company of Troop 77120, Chengdu, Sichuan Province, 610081, China;
3. Institute of Toxicology, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038
结肠直肠癌(colorectal cancer, CRC)是世界上常见的恶性肿瘤之一, 其发病率居第3位, 病死率居第4位[1]。在2012年, 全球确诊的病例近140万例, 死亡70万人, 预期到2030年全球每年将有超过220万例CRC发病和110万例患者死亡[2]。随着经济的发展和生活方式的改变, 中国结直肠癌的发病率和死亡率都迅速上升, 2015年被确诊的CRC将近37.63万例, 死亡人数将近19.1万人[1, 3]。最近的研究表明, 饮酒是肝癌、乳腺癌、结直肠癌、口咽癌和食管癌的一个确定危险因素[4-6]。一项大规模的荟萃分析报告指出, 中等饮酒和重度饮酒者患CRC的相对危险度分别为不饮酒者的1.17倍和1.44倍[7]。乙醇进入人体后主要通过氧化途径代谢[8], 首先通过乙醇脱氢酶1B(ADH1B)和细胞色素P 450(CYP2E1)将乙醇转化为乙醛, 乙醛再被醛脱氢酶(ALDH)代谢成乙酸[9], 由ADH1B、乙醛脱氢酶-2(ALDH2)和CYP2E1构成的代谢途径完成了几乎全部的乙醇体内代谢过程[10]。CRC的发病风险与单核苷酸多态性(SNP)等遗传变异和饮酒等环境暴露的相互作用关系密切[11]。我们前期的研究和其他的研究都表明, 位于ALDH2基因上的SNP rs671和ADH1B基因上的SNP rs1229984与CRC的发病风险相关, 并且发现饮酒与基因多态性的交互作用会使患CRC的风险更高[10, 12]。JIANG等[13]的Meta分析也发现CYP2E1RsaⅠ/PstⅠ, 96-bp插入多态性与CRC的发病风险增加有关。拷贝数变异(copy number variation, CNV)是指1 kb以上的基因组DNA拷贝数的变化, 包括重复、缺失或插入等[14-15], 是除了SNP以外最常见的遗传变异, 占人类变异的10%~13%[16], 但CNV对基因组的覆盖范围、对基因功能可能产生的影响等均可能远超过SNP。近年来的研究也提示, CNV与CRC的风险有关[15, 17-18], 然而, 目前还没有乙醇代谢相关基因CNV对CRC发病风险的影响的相关研究。本研究采用病例对照研究基于靶基因区域分析方法, 分析了ADH1B、ALDH2和CYP2E1拷贝数变异与CRC发病风险的关联, 以期为易感人群提供有效的保护和干预措施, 为肿瘤的防治提供科学依据。
1 资料与方法 1.1 研究对象从2001年1月至2004年6月陆军军医大学3所附属医院收集到的478例CRC新发患者, 以性别及年龄±3岁进行1:1匹配收集的同期院内对照, 最终纳入449例CRC患者和449例对照。病例纳入标准:①CRC患者均为初次诊断6个月内且未接受过任何医学治疗; ②在当地居住时间>15年, 或累计居住时间>30年且在外连续居住不超过5年; ③CRC病例均经组织病理学诊断为原发性结直肠癌。病例排除标准:①CRC复发; ②家族性腺瘤性息肉病变; ③遗传性非息肉病性CRC; ④回盲部肿瘤和肛管癌; ⑤合并其他肿瘤; ⑥ 2年以上严重消化道疾病; ⑦合并糖尿病、脂肪肝、肝硬化、代谢综合征和严重的心血管疾病等。对照纳入标准:①以同性别、年龄(±3岁)为匹配因素与病例组按照1:1配对; ②与CRC患者属于同时期住院患者。对照排除标准:①肿瘤患者; ②严重消化道2年以上的肠道疾病; ③合并糖尿病、脂肪肝、肝硬化、代谢综合征和严重的心血管疾病等。在所有参与者提供书面同意之后, 抽取5 mL的外周静脉血样, 并完成半定量食物频率问卷, 收集人口统计学资料、饮食信息、吸烟和饮酒习惯。
1.2 研究方法 1.2.1 DNA提取全血DNA使用Wizard Genomic DNA Purification Kit(Promega)试剂盒按说明从外周血中提取基因组DNA, Nanodrop重测DNA原液浓度后统一稀释为50 ng/μL共50 μL的DNA样本。取10 μL至96孔板中密封并储存在-80℃。
1.2.2 CNV检测采用专门设计的专利AccuCopyTM多重基因拷贝检测试剂盒(天昊生物, 中国上海), 在1个反应体系中对ADH1B、ALDH2和CYP2E1基因的CNV进行检测。为确保基因分型结果的准确性, 对每个基因设计了2~3个探针(2~3对引物)和4个用于标化的参照DNA片段(2p, 10pL, 20q, 16p), 见表 1。检测方法:将已知拷贝数的内对照DNA与合适量样本DNA混匀后经多重荧光竞争性PCR扩增, 将扩增后产物稀释20倍后进行毛细管电泳, 原始数据通过GeneMapper 4.0(ABI)进行分析, 将每个特定峰的峰高数据用Microsoft Excel导出, 按AccuCopyTM标准计算方法进行计算[19]。
| 基因片段 | 染色体 | 位置(GRCh38) | 扩增长度(样本, 参照-2 bp) | 备注 | 正向引物(5'→3') | 反向引物(5'→3') |
| 2p | chr2 | 84273487~84273561 | 75 | 参照基因 | TGAGCCAAAAATTCAGAATACAAGGA | TTGCTTGGAAGGCAGGCAAAC |
| 10pL | chr10 | 30831602~30831746 | 145 | 参照基因 | CACTGAGCCCCAGAGACCTGAC | AATGCACACCTCCAGGGAAAAC |
| 20q | chr20 | 37237518~37237739 | 222 | 参照基因 | AGGGTGCTGGGATCAGAGAGAG | GCTACTGGAGGGTGGCAAAATG |
| 16p | chr16 | 25246808~25247105 | 298 | 参照基因 | TCCTCCACCAAGCTGATGTGTT | TTCAGGCCTGTCCCCGAAATAG |
| ADH1B-1 | chr4 | 99306387~99321442 | 205 | CATTCACCACTTCCTTGGCAC | TCCGACAGTCTGCATGTAAGCA | |
| ADH1B+1K | chr4 | 99305675~99305870 | 196 | ATGGAGTTCTACATGCCCATCTCA | AGAAGGCTCCCACATGCCACT | |
| ALDH2-1 | chr12 | 111766887~111809985 | 119 | TCAGCCCTTTGTTTTCCTCTCA | AAATCCACCAGGTAGGAGATGACATA | |
| ALDH2-2 | chr12 | 111766887~111809985 | 173 | GCTGGACCAGTTTGAGTCTTCTCTT | TTCATGGCGTGTGTAGCTGAA | |
| ALDH2-3 | chr12 | 111766887~111809985 | 159 | CCCTCAGCCATTGATGGAAAG | CTCAGCCAACCCACCATGTTT | |
| CYP2E1-2 | chr10 | 133527363~133539116 | 236 | TTGGTGAACCTCAGTGGGTGA | GGGAGTGCTGAGTAGGTGGAAGTT | |
| CYP2E1-1 | chr10 | 133527363~133539116 | 253 | TGCACAGCAGCTGGAATCTG | TTTTGAGTGTCGCTCCAGGAT | |
| CYP2E1-3 | chr10 | 133527363~133539116 | 135 | AAAACGAGTGTGTGCTGGAGAAG | AACCCAATATGTATAGGGCTGAGGT |
1.3 统计学分析
采用SAS 9.1(SAS Institute, Cary, NC)统计软件。研究对象的人口学特征的分布差异采用χ2检验, 通过标准AccucopyTM方法计算每个样品的拷贝数, 然后在调整或不调整年龄、性别、吸烟、饮酒、家族肿瘤史等因素下使用非条件Logistic回归分析CNV与CRC风险之间的关联。关联强度以比值比(odds ratio, OR)和95%置信区间(confidence intervals, CI)表示。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 人口学特征分布本研究人群基本信息见表 2。经统计分析, 病例对照组在年龄、性别、教育程度、家族肿瘤史、吸烟、饮茶、咖啡等方面差异均无统计学意义(χ2=5.93, 0.001, 1.67, 3.65, 0.85, 0.57, 1.56, P>0.05)。但饮酒在病例人群中的频率高于对照组, 差异有统计学意义(χ2=12.60, P=0.002)。这与在研究中发现的饮酒是CRC发生、发展过程中高危险因素一致。
| 变量名 | 病例组(n=449) | 对照组(n=449) | χ2值 | P值 |
| 年龄a | 5.93 | 0.749 | ||
| ≤ 50岁 | 163(36.47) | 168(37.50) | ||
| > 50岁 | 284(63.53) | 280(62.50) | ||
| 性别a | < 0.01 | 0.969 | ||
| 女 | 195(43.62) | 196(43.75) | ||
| 男 | 252(56.38) | 252(56.25) | ||
| 教育程度b | 1.67 | 0.435 | ||
| 小学 | 174(41.53) | 164(37.36) | ||
| 中学 | 204(48.69) | 226(51.48) | ||
| 大专及以上 | 41(9.79) | 49(11.16) | ||
| 家族肿瘤史c | 3.65 | 0.056 | ||
| 无 | 331(78.25) | 366(83.37) | ||
| 有 | 92(21.75) | 73(16.63) | ||
| 吸烟d | 0.85 | 0.653 | ||
| 不吸烟 | 243(58.41) | 270(61.51) | ||
| 戒烟 | 31(7.45) | 30(6.83) | ||
| 吸烟 | 142(34.13) | 139(31.66) | ||
| 饮酒e | 12.60 | 0.002 | ||
| 不饮酒 | 262(62.98) | 321(73.62) | ||
| 戒酒 | 27(6.49) | 14(3.21) | ||
| 饮酒 | 127(30.53) | 101(23.17) | ||
| 饮茶f | 0.57 | 0.448 | ||
| 不喝 | 239(56.77) | 261(59.32) | ||
| 喝 | 182(43.23) | 179(40.68) | ||
| 咖啡f | 1.56 | 0.212 | ||
| 不喝 | 387(91.92) | 414(94.09) | ||
| 喝 | 34(8.08) | 26(5.91) | ||
| a、b、c、d、e、f表示总体样本中相应变量的缺失值, 分别为5、37、33、40、43、34例 | ||||
2.2 ADH1B、ALDH2和CYP2E1基因拷贝数
在纳入的898名研究对象中, 分型成功的共有895例, 另有3例未成功样本包括2例CRC患者和1例对照, ADH1B、ALDH2和CYP2E1基因拷贝数的分布情况见表 3。ADH1B、ALDH2基因拷贝数在CRC病例和对照中均为2拷贝。CYP2E1基因拷贝数在病例组中为2~4, 其中2拷贝429例, 3拷贝17例, 4拷贝1例。在对照组中2拷贝440例, 3拷贝8例。将病例和对照的拷贝数分为两组(2拷贝和≥ 3拷贝), 经χ2检验, 两组间CYP2E1基因拷贝数的频率差异具有统计学意义(χ2=3.98, P=0.046)。
| 基因 | 病例组(n=447) | 对照组(n=448) | χ2值 | P值 |
| ADH1B | - | - | ||
| 2拷贝 | 447(100.00) | 448(100.00) | ||
| ALDH2 | - | - | ||
| 2拷贝 | 447(100.00) | 448(100.00) | ||
| CYP2E1 | 3.98 | 0.046 | ||
| 2拷贝 | 429(95.97) | 440(98.21) | ||
| ≥ 3拷贝 | 18(4.03) | 8(1.79) |
2.3 CYP2E1基因拷贝数变异与CRC易感性的关联分析
对CYP2E1基因拷贝数与CRC易感性的关系行二分类Logistic回归分析(表 4), 结果提示CYP2E1基因拷贝数≥ 3与CRC的发病风险增加有关, 但关联处于临界状态(OR=2.31, 95%CI:0.99~5.36, P=0.052)。经性别、年龄、家族肿瘤史、饮酒、吸烟等因素校正以后提示拷贝数≥ 3是CRC发病的危险因素(OR=2.47, 95%CI:1.04~5.85, P=0.041)。进一步对结直肠癌相关危险因素进行分层后探讨CYP2E1基因拷贝数增加与CRC风险的关联(表 5)。分层后结果显示, 年龄>50岁, 肿瘤位于结肠, 乙醇摄入量≤ 50 g的人群中, CYP2E1拷贝数增加与CRC风险具有关联。
| CNV | 病例组/例 | 对照组/例 | 校正前OR(95%CI) | 校正前P值 | 校正后OR(95%CI)a | 校正后P值 |
| 2拷贝 | 429 | 440 | 1.00 | 1.00 | ||
| ≥ 3拷贝 | 18 | 8 | 2.31(0.99~5.36) | 0.052 | 2.47(1.04~5.85) | 0.041 |
| a:经年龄、性别、吸烟、饮酒、家族肿瘤史、教育程度、能量、蛋白、脂肪和膳食纤维摄入校正 | ||||||
| 变量 | 病例组/例 | 对照组/例 | 校正前OR(95%CI) ≥ 3拷贝/2拷贝 | 校正前P值 | 校正后OR(95%CI)a ≥ 3拷贝/2拷贝 | 校正后P值 | |||
| 2拷贝 | ≥ 3拷贝 | 2拷贝 | ≥ 3拷贝 | ||||||
| 年龄 | |||||||||
| ≤ 50岁 | 161 | 2 | 166 | 2 | 1.03(0.14~7.41) | 0.976 | 1.11(0.14~8.73) | 0.921 | |
| > 50岁 | 268 | 16 | 274 | 6 | 2.73(1.05~7.07) | 0.039 | 3.18(1.19~8.53) | 0.021 | |
| 性别 | |||||||||
| 男 | 244 | 8 | 248 | 4 | 2.03(0.60~6.84) | 0.252 | 2.07(0.60~7.14) | 0.251 | |
| 女 | 185 | 10 | 192 | 4 | 2.59(0.80~8.41) | 0.113 | 2.69(0.78~9.25) | 0.116 | |
| 家族肿瘤史 | |||||||||
| 有 | 88 | 4 | 73 | 0 | NA | 0.982 | NA | 0.979 | |
| 无 | 317 | 14 | 358 | 8 | 1.98(0.82~4.77) | 0.130 | 1.89(0.77~4.67) | 0.168 | |
| 肿瘤部位 | |||||||||
| 结肠 | 156 | 8 | 440 | 8 | 2.82(1.04~7.64) | 0.042 | 3.18(1.13~8.91) | 0.028 | |
| 直肠 | 273 | 10 | 440 | 8 | 2.02(0.79~5.17) | 0.145 | 2.09(0.75~5.57) | 0.141 | |
| 吸烟 | |||||||||
| 是/戒烟 | 168 | 5 | 167 | 2 | 2.48(0.48~12.98) | 0.281 | 2.12(0.39~11.38) | 0.382 | |
| 否 | 230 | 13 | 264 | 6 | 2.49(0.93~6.65) | 0.069 | 2.50(0.90~6.94) | 0.078 | |
| 饮酒 | |||||||||
| 是/戒酒 | 148 | 6 | 113 | 2 | 2.29(0.45~11.56) | 0.316 | 2.17(0.41~11.35) | 0.361 | |
| 否 | 250 | 12 | 315 | 6 | 2.52(0.93~6.81) | 0.068 | 2.66(0.96~7.39) | 0.060 | |
| 乙醇摄入量b | |||||||||
| > 50 g | 67 | 3 | 59 | 1 | 2.64(0.27~26.09) | 0.406 | 2.17(0.21~22.90) | 0.520 | |
| ≤ 50 g | 362 | 15 | 381 | 7 | 2.26(0.91~5.59) | 0.079 | 2.57(1.01~6.53) | 0.048 | |
| a:经年龄、性别、吸烟、饮酒、家族肿瘤史、教育程度、能量、蛋白、脂肪和膳食纤维摄入校正; b:通过食物半定量问卷收集CRC患者发病前1年的膳食摄入情况, 按平均日摄入乙醇量≤ 50 g和>50 g分为2组; NA:无法获取相关数据 | |||||||||
3 讨论
近年来, CNV由于其在表型多样性和进化过程中潜在的重要作用而受到广泛关注。我们前期的研究表明, 饮酒与CRC的风险增加有关, 并且发现主要的乙醇代谢酶编码基因ALDH2中的多态性位点rs671和CYP2E1中的多态性位点rs1329149与CRC的患病风险显著相关[10]。同时大量的研究表明ADH1B、ALDH2与CYP2E1基因上的SNP位点与CRC的风险有关, CNV作为比SNP更重要的一种遗传变异, 有关这3个基因的CNV与CRC风险之间的关联尚不清楚。因此, 本研究采用AccuCopyTM检测技术探讨中国西南地区人群中主要的乙醇代谢酶编码基因(ADH1B、ALDH2与CYP2E1)的CNV与结直肠发病风险之间的关联。结果发现ADH1B和ALDH2基因的拷贝数在CRC病例和健康对照中均为2拷贝, 没有发现拷贝数增加或缺失。在Genomic Variants数据库(http://dgv.tcag.ca/dgv/app/home, version:GRch38/hg38)检索到在ADH1B和ALDH2基因上已知的拷贝数变异分别为4个和10个, 其发生频率大都在0.003以下, 本研究通过AccuCopyTM检测技术未检测到ADH1B和ALDH2基因的拷贝数变化, 可能与选取的样本量太少有关。
CYP2E1为乙醇诱导酶, 属于细胞色素P450超家族的成员, 其多态性与酒精相关疾病的关系已被广泛研究, 位于5'端的突变位点PstⅠ(rs3813867)和RsaⅠ(rs2031920)多态性可以改变酶的活性, 影响亚硝酸胺相关的致癌作用, 是CYP2E1基因多态性研究最多, 且被认为是常见癌症的潜在危险因素[20]。有研究发现, PstⅠ/RsaⅠ多态性可能增加CRC的风险[21-22], 另外两个研究较多的多态性位点中, -7 632 T/A(rs6413432)多态性没有功能意义, 而96-bp插入多态性的突变等位基因表现出更高的酶活性[23]。在QIAN等[23]的Meta分析中发现, 96-bp插入多态性与患CRC的风险具有显著关联, 而rs6413432多态性与结直肠癌风险无关。SAEED等[20]的研究也显示rs6413432与结直肠癌无关。CNV作为遗传变异的普遍形式, 表现为特定DNA片段(通常1 kb以上)的拷贝数增加或缺失, 可以通过直接干扰或远距离基因调控改变基因表达而表现出表型多样性[24]。越来越多的证据表明, CNV可能可以解释SNP无法解释的复杂人类疾病的遗传基础, 特别是对于人类癌症[25-26]。BI等[27]研究发现MDM2基因拷贝数变异与CRC的风险增加相关, 而SKP2基因的拷贝数变异与CRC的风险降低有关。另有研究发现SLC18A1基因拷贝数缺失与CRC的风险显著相关[17]。在本研究中, CYP2E1基因拷贝数在病例组中为2~4, 对照为2~3, 经二分类Logistic回归分析发现CYP2E1拷贝数增加是CRC的危险因素, 但关联不太显著, 经混杂因素校正后提示CYP2E1基因拷贝数≥ 3患CRC的风险是拷贝数为2的2.47倍。分层后结果显示, 年龄>50岁, 肿瘤位于结肠, 乙醇摄入量≤ 50 g的人群中, CYP2E1拷贝数增加与CRC风险具有关联。
在人类和动物中, 观察到肝CYP2E1酶在慢性饮酒后活性增加10~20倍[28]。CYP2E1在代谢乙醇的过程中可产生大量的ROS[29], 体内高水平的ROS通过介导DNA损伤导致基因组不稳定促进多种癌症的发生发展[30], 如乳腺癌[31]、肝癌[32]、结直肠癌[33]、肺癌[34]和前列腺癌[35]。研究发现, CYP2E1的表达和功能异常与CRC的发生密切相关。原因在于, CYP2E1调控结直肠黏膜中致癌性亚乙烯基-DNA加合物的水平, 该物质通过CYP2E1在乙醇代谢中产生的活性氧(ROS)作用而产生[36]。本研究发现CYP2E1拷贝数增加是CRC的风险因素, 由于拷贝数的增加会使其覆盖区域或者临近区域基因mRNA或蛋白的表达增加, 删失会使其表达减少[35], 而CYP2E1的活性可以被饮酒、吸烟、饮食和肥胖等的影响[37]。因此, 推测其机制可能是CYP2E1拷贝数增加以后使该基因的表达量增加, 经环境因素暴露后CYP2E1的活性增加, 导致体内ROS水平升高, 增加患CRC的风险。分层后结果显示在年龄>50岁, 肿瘤位于结肠, 乙醇摄入量≤ 50 g的人群中, CYP2E1拷贝数增加与CRC风险具有关联。由于受样本量的影响, 本结果未发现乙醇摄入量>50 g人群中CYP2E1拷贝数增加与CRC风险关联。本研究对拷贝数的鉴定采用的是AccuCopyTM方法, 基于多重检测技术相互验证来判断拷贝数变异, 该方法由于具备准确性高、速度快等优点被应用于大量研究中[19, 38-39]。但是, 本研究仍然存在不足。首先, 本研究人群主要为西南地区, 人群样本量少, 无法代表我国整体情况。其次, 研究尚未完成相关的功能验证, 还缺乏相关基因拷贝数变异在CRC发生中作用阶段和具体机制信息。
综上所述, 本研究提示CYP2E1基因拷贝数增加可能与更高的CRC发病风险有关。有关ADH1B、ALDH2与CYP2E1拷贝数变异与CRC的关联需要不同种族的更大的人群样本和更详细的功能研究来进一步阐述其作用方式和机制。
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