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人退变髓核细胞中内质网应激水平的观察研究
文天用1,2, 刘月2, 程实2, 应金威2, 阮狄克2     
1. 710032 西安,空军军医大学西京医院骨科;
2. 100048 北京,海军总医院骨科
[摘要] 目的 观察探讨退变与正常髓核组织中内质网应激水平的差异。方法 获取正常和退变髓核组织共9例(均为海军总医院骨科2016年1月至2017年6月期间住院手术患者),取组织及分离培养髓核细胞,通过透射电镜观察内质网形态、免疫组化法对髓核组织中葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78, GRP78)、C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)的表达分布进行定性分析,RT-PCR及Western blot对髓核细胞中GRP78、CHOP进行mRNA和蛋白质水平的分析。结果 透射电镜结果显示退变髓核细胞的内质网扩张、肿胀,正常片状折叠结构消失;免疫组化染色及Western blot检测结果均可见退变髓核组织GRP78、CHOP的表达升高;RT-PCR提示较之于正常组,退变组GRP78[(1.076±0.13)vs (2.471±0.53)]、CHOP[(1.09±0.21)vs(6.873±1.4)]明显升高(P < 0.05)。结论 退变髓核细胞中内质网应激水平较正常髓核细胞升高,提示内质网应激可能在髓核细胞退变过程中发挥作用。
[关键词] 椎间盘退变     内质网应激     人髓核细胞     透射电镜    
Endoplasmic reticulum stress in degenerative human nucleus pulposus cells
WEN Tianyong1,2 , LIU Yue2 , CHENG Shi2 , YING Jinwei2 , RUAN Dike2     
1. Department of Orthopedics, Xijing Hospital, Air Force Military Medical University, Xi'an, Shaanxi Province, 710032;
2. Department of Orthopedic Surgery, Navy General Hospital, Beijing, 100048, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81472121) and the Innovation Incubator Fund of Navy General Hospital (CXPY201402)
Corresponding author: RUAN Dike, E-mail:ruandikengh@163.com
[Abstract] Objective To investigate the difference in the levels of endoplasmic reticulum (ER) stress between degenerative and normal human nucleus pulposus cells. Methods Nucleus pulposus tissues were collected from specimens of normal and degenerative intervertebral discs from 9 surgical patients (mean age 33 years) admitted in the Department of Orthopedic Surgery, Navy General Hospital between January, 2016 and June, 2017. The nucleus pulposus cells (NPCs) were isolated and cultured, and the morphology of the ER was observed using transmission electron microscopy (TEM). The expression levels of 2 ER stress-related molecules, namely glucose-regulated protein 78 (GRP78) and C/EBP homologous protein (CHOP), were analyzed using immunohistochemical assay, real-time PCR and Western blotting. Results TEM revealed obvious ER dilation and swelling in degenerative NPCs as compared with normal NPCs. Immunohistochemical assay and Western blotting showed obviously increased expressions of GRP78 and CHOP proteins in degenerative NPCs. GRP78 and CHOP mRNA expressions were also significantly increased in degenerative as compared with normal NPCs (2.471±0.53 vs 1.076±0.13, and 6.873±1.4 vs 1.09±0.21, respectively; P < 0.05). Conclusion The abnormal morphology of ER and increased expression of ER stress markers in degenerative NPCs suggest the involvement of ER stress in the development of NPC degeneration.
[Key words] disc degeneration     nucleus pulposus cells     endoplasmic reticulum stress    

内质网负责蛋白质的合成转运、糖基化修饰及细胞内钙的再分布等重要生理功能,是细胞内最大的细胞器。种种原因使得细胞内质网发生功能紊乱,导致错误折叠和未折叠蛋白在内质网腔内聚集以及Ca2+平衡紊乱的病理状态称为内质网应激。当内质网应激(endoplasmic reticulum stress,ERS)出现时,细胞内会发生保护性的非折叠蛋白反应(unfolded protein response,UPR),通过蛋白质合成减慢、折叠功能加强、未折叠蛋白降解等途径,来适应内质网应激;但当刺激存在时间过长或强度过大,则会诱导细胞发生凋亡,UPR的整体作用由促生存转向促凋亡[1]

目前研究证明炎症与椎间盘退变关系密切[2-3],炎症因子在椎间盘退变的发生、发展中发挥重要作用,对于髓核细胞的增殖、分化、凋亡等生物学行为有诸多影响[4-5]。而越来越多的研究报道,内质网应激过程中的UPR可对众多胞内信号通路产生影响,与炎症的发生、发展存在密切关系[6],已经证明其参与类风湿性关节炎、糖尿病等多种慢性炎症性疾病[7]。有研究开始观察软骨细胞退变与内质网应激之间的关系,发现软骨细胞对于各种理化因素的刺激极为敏感,易发生内质网应激,继而影响软骨细胞外基质的构成、诱发软骨细胞凋亡,引起骨关节炎的发生[8-9]。但在椎间盘退变的发病机制方面,尚无内质网应激或非折叠蛋白反应的相关报道;椎间盘作为一种复杂的类软骨结构,ERs可能也在其退变过程中发挥着与骨关节炎类似的作用。

本研究通过在蛋白水平和RNA水平对健康(或轻度退变)和严重退变的髓核细胞内质网应激水平的早期标志性分子伴侣葡萄糖调节蛋白78(glucose regulated protein 78,GRP78)及晚期经典标志物C/EBP同源蛋白(C/EBP homologous protein,CHOP)进行定性及定量分析,比较不同状态下髓核细胞的ERS水平,证实ERS在椎间盘退变中发挥的作用,以期为寻找椎间盘退变潜在的新治疗靶点奠定基础。

1 材料与方法 1.1 标本来源

选取2016年1月至2017年6月收住于海军总医院骨科并实施髓核摘除、椎间融合术或半椎体切除、融合固定术的腰椎间盘突出症、腰椎管狭窄症、胸腰椎骨折、脊柱侧弯的患者共9例,其中女性3例、男性6例,平均年龄为33岁。术前均常规完善脊柱MRI检查,对获取的椎间盘依照Pfirrmann分级进行分级[10],GradeⅠ~Ⅱ定义为正常,Grade Ⅳ~Ⅴ定义为退变,具体患者信息见表 1。人体髓核组织的获取均取得患者知情同意并签字,全部过程通过海军总医院伦理委员会批准。

表 1 入组患者基本信息和退变分级
编号 诊断 节段 分级 性别 年龄/岁
1 腰椎骨折 T12~L1 男性 33
2 腰椎间盘突出症 L4~ L5 男性 52
3 腰椎间盘突出症 L4~ L5 女性 34
4 腰椎间盘突出症 L5~S1 男性 22
5 腰椎骨折 L3~L 4 女性 43
6 腰椎间盘突出症 L4~L 5 男性 17
7 腰椎管狭窄症 L3~L 4 男性 50
8 腰椎间盘突出症 L4~L 5 男性 28
9 先天性脊柱侧弯 L1~L 2 女性 21

1.2 方法

1.2.1 透射电镜检测

肝脏组织块依次在4%戊二醛固定液和2%四氧化锇固定液4℃后固定;乙醇梯度脱水;然后浸入环氧丙烷置换;环氧树脂LX-812(Ladd Research Industries Inc,美国)浸透、包埋,聚合后制作超薄切片,醋酸铀、柠檬酸铅染色后,于FEI Tecnai G12 Spirit BioTwin透射电子显微镜(FEI公司,美国)下观察、拍照。

1.2.2 髓核组织免疫组化检测

对手术留取的部分髓核组织尽快以10%多聚甲醛溶液固定6~10 h后,对样本进行梯度酒精脱水,石蜡包埋,切片机切为4 μm片备用。切片标准脱蜡处理,3% H2O2浸泡15 min、灭活内源性过氧化物酶,PBS漂洗5 min×3次,血清封闭30 min后晾干,用1 :200的兔抗人GRP78多抗、兔抗人CHOP单抗(Abcam公司,美国)的一抗4 ℃孵育过夜,第2天PBS漂洗3次、每次5 min,孵二抗;DAB显色3~5 min,苏木精复染30s,脱水吹干后,树脂封片,用一步法免疫检测试剂盒检测(原能,武汉),光学显微镜下观察并拍照。

1.2.3 髓核细胞分离、培养

术中取出的髓核组织,放入20mL无菌离心管,浸泡在冰盒中迅速带回实验室,离心管内预先放入少量DMEM/F12培养液(Invitrogen公司,美国)。在15min内于超净台下剪碎为2~3 mm组织粒,0.02%Ⅱ型胶原蛋白酶(Sigma公司,美国)37 ℃水浴4 h后终止消化,加PBS清洗、离心2遍,加入含10%胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)的DMEM/F12完全培养基重悬、混匀细胞,按合适密度接种、培养。后续实验所用细胞均为第1代细胞。

1.2.4 RT-PCR检测基因水平

TRIzol法提取髓核细胞总RNA,测定样品RNA浓度[D(260)/D(280)>1.8],用反转录试剂盒PrimeScript RT Master Mix (TaKaRa公司,大连)将RNA反转录为cDNA,荧光定量PCR反应使用SYBR Green Real-time PCR Master Mix (TOYOBO公司,上海)试剂,体系按说明书设定,引物序列由Primer Premier 5.0设计、上海生工合成,GRP78引物序列:上游5′-TCAAGTTCTTGCCGTTCA-AGG-3′,下游5′-AAATAAGCCTCAGCGGTTTCTT-3′;CHOP引物序列:上游5′-CAAGAGGTCCTGTCTTCAG- ATGA-3′,下游5′-CAAGAGGTCCTGTCTTCAGATGA-3′。CFX96实时荧光定量PCR仪(Bio-Rad,美国)进行上机反应、检测。用甘油醛-3-磷酸脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase,GAPDH)作为内参,计算各目的基因mRNA的相对表达量。

1.2.5 Western blot检测蛋白水平

收集的髓核细胞用冰PBS洗涤,离心后弃上清,用细胞裂解液(碧云天,江苏)裂解后,离心收集蛋白质,用BCA蛋白质浓度测定试剂盒(碧云天公司,江苏)进行蛋白质含量的测定,加于5×上样缓冲液中煮沸10 min变性,用SDS-PAGE进行电泳分离,转至PVDF膜上,含0.05% Tween-20和5%胎牛血清封闭1 h,用1 :1 000的兔抗人β-actin(Santa Cruz,美国)、兔抗人GRP78、兔抗人CHOP抗体,4 ℃摇床孵育过夜后,漂洗3次,加二抗(1 :3 000),室温孵育1 h,ECL试剂盒曝光显影。图像以β-actin为内参,图像处理软件分析各条带的灰度值后,计算蛋白相对表达量。

1.3 统计学分析

通过SPSS 17.0及Graph Pad Prism 5.0进行统计学分析。计量资料均按照x±s形式表示,两组之间差异采用独立样品非配对t检验进行比较。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 透射电镜检测结果

在内质网应激发生的时候,在形态上内质网经常会出现比较显著的异常改变。为了观察到内质网应激在人髓核细胞退变中是否存在,我们使用透射电子显微镜来观察其中内质网形态的差异。结果显示,和正常NPCs的内质网结构相比较而言,退变的NPCs内质网显现出了异常的扩张和肿胀,主要表现为正常折叠结构消失,并且可以看到粗面内质网的核糖体数量有明显降低。这样的结果提示,退变髓核细胞的内质网形态发生改变,提示在退变的髓核细胞中发生了内质网应激(图 1)。

A: N-NPCs; B: D-NPCs; ↑:示内质网 图 1 透射电镜观察正常和退变髓核细胞的超微结构变化(TEM)

2.2 免疫组化检测结果

髓核细胞呈巢状或单个聚集在陷窝中,正常细胞核为蓝染,阳性表达产物为棕黄染。CHOP在正常髓核组织内有零星细胞可见阳性,GRP78在正常髓核组织内可见较多细胞弱阳性表现;但退变髓核组织中二者均高表达,其中CHOP的阳性强度高于GRP78(图 2)。

A:GRP78正常髓核;B:GRP78退变髓核;C:CHOP正常髓核;D:CHOP退变髓核 图 2 免疫组化检测退变和正常髓核组织中内质网应激相关标志的表达分布

2.3 髓核细胞生长形态

原代髓核细胞培养时可在于第3~4天完成贴壁,贴壁后的细胞以多角形或类圆形为主,数日后随着生长展开、变为梭形,当接近融合时则呈现不规则梭形或团簇样生长。原代细胞生长速度较慢,需培养2周左右才可达到传代标准;退变髓核细胞和正常髓核细胞在光镜下形态无明显区别,但退变髓核细胞生长达融合所需时间较长(图 3)。

A:正常髓核细胞;B:退变髓核细胞 图 3 正常和退变髓核原代细胞培养情况(LM ×200)

2.4 实时定量PCR与Western blot检测结果

健康组髓核细胞内GRP78、CHOP的mRNA表达量分别为(1.076±0.13)、(1.09±0.21),而退变组的GRP78、CHOP的mRNA表达量分别为(2.471± 0.53)、(6.873±1.4),差异均有统计学意义(P < 0.05)。GRP78、CHOP在退变髓核细胞表达均高于正常髓核细胞,差异有统计学意义(P < 0.05,图 4)。

A:Western blot检测结果;B:半定量分析结果a:P < 0.05,与正常髓核比较 图 4 正常及退变髓核细胞中内质网应激标志蛋白的表达水平

3 讨论

椎间盘退变(intervertebral disc degeneration,IDD)是脊柱退行性疾病的核心问题,而髓核是维持椎间盘功能的关键结构。髓核退变包括细胞外基质降解、蛋白多糖丢失、胶原结构紊乱、血管神经长入等,髓核细胞凋亡、数量减少、表型改变在退变过程中发挥关键作用[11]。因此通过直接作用于IDD细胞层面的病理生理改变、影响椎间盘内细胞的生物学行为、促进其增殖、改善其合成,可能实现延缓甚至逆转椎间盘退变。既有研究表明提示炎症在髓核退变的过程中扮演重要角色[5],相应的炎症相关信号通路或者抗炎因子也就成为治疗退变的研究热点。而ERS是一类极为保守的、在真核细胞内普遍存在的应激反应,是近些年受研究者们较多关注的细胞器水平的调控机制。研究证明,ERs与炎症的发生、发展存在密切关系,可同时影响多条炎症相关的细胞通路(NF-κB、MAPK等),与多种慢性炎症性疾病相关,如类风湿关节炎、糖尿病等[12-14]

在骨科领域有关内质网应激的研究相对较少,仅局限于ERS对软骨细胞的影响、在骨关节炎发病中的作用。LI等[15]通过机械应力刺激大鼠颞下颌关节软骨来模拟软骨退变,通过筛查ERS相关基因的表达、免疫组化及电镜结果,均证明内质网应激发生,且通过阻断内质网应激,退变早期的细胞凋亡下降、退变晚期的细胞增殖减少、软骨层的厚度得到了部分保持。日本学者研究显发现骨细胞中蓄积晚期糖基化终末产物会使细胞发生内质网应激,最终导致软骨细胞凋亡,引起骨关节炎的发生[16]。Takada等[17]报道骨关节炎患者的关节软骨较正常人相比,GRP78、PERK、XBP1等内质网应激标志蛋白升高;内质网应激可诱使软骨细胞Ⅱ型胶原合成减低、基质金属蛋白酶13合成增加;而CHOP、caspase-3等凋亡相关蛋白的激活则导致软骨细胞凋亡增加。在椎间盘退变相关机制中,内质网应激是否发挥作用尚未证实,近2年才有少数报道,且仅限于酸性刺激髓核退变或硫化氢保护髓核退变等过程中是否经由内质网应激途径发挥作用的动物研究[18-19]。尚少见有关于人退变和正常髓核组织的内质网应激水平是否存在差异的报道。

当ERS发生时,细胞内会发生保护性的非折叠蛋白反应,通过减少细胞蛋白合成、增强蛋白折叠、促进内质网相关降解以维持细胞稳态;但应激过强或持续时间过长时,又会促进细胞凋亡。正常状态下,细胞内GRP78与PERK(Protein kinase R-like ER kinase)、ATF6(Activating transcription factor 6)和IRE1(Inositol requiring enzyme 1)这3种内质网应激相关的标志蛋白结合在一起;当应激出现时,GRP78便解离出来,释放这3种蛋白、出发UPR。所以,GRP78上调一般作为ERS开始的标志[1, 7]。长期或高强度应激细胞如果不能够有效地进行代偿时,细胞凋亡就会自动启动。而由ERS所引发的调控机制也将从促进细胞回归稳定、保证细胞正常生存转换到促进细胞凋亡以及清理异常细胞。而在这个时候,CHOP出现了高表达,该蛋白隶属于C/EBP这个转录因子家族,并且特异的存在于ERS过程中的转录因子,是一种前凋亡分子,往往被视为ERS的晚期标志。

本实验选取人正常髓核(Pfirrmann Ⅰ、Ⅱ)和退变髓核(Pfirrmann Ⅳ、Ⅴ)进行对照分析,这在以往文献中尚少见类似研究设计。电镜观察可见退变髓核细胞中内质网肿胀、囊泡化,片状折叠的囊管状结构消失,提示内质网病理状态。免疫组化、荧光定量PCR及Western blot检测均从mRNA水平和蛋白水平证实GRP78、CHOP两种标志性蛋白在退变髓核细胞中均高表达,其中CHOP更为显著,可能提示选取病例退变较为严重,长期的、严重的刺激超出细胞代偿范围,大部分细胞进入促凋亡状态,因此CHOP的表达量上升更为明显。但是由于髓核组织与软骨组织类似,是细胞少、细胞外基质多的组织结构,细胞又多以团簇状分布在陷窝中,这就使得组织切片观察下细胞稀少以及组织中提取蛋白量稍显不足。因此,我们选取高倍镜视野观察并呈现免疫组化结果、选取分离培养的第1代髓核细胞进行mRNA和蛋白检测。组织学检测和细胞学检测均证明ERS在退变髓核细胞中存在,且与凋亡相关的CHOP有着更高的表达,可能提示ERS介导的细胞凋亡是髓核退变的重要病理机制。

综上所述,椎间盘退变患者的髓核细胞中内质网应激水平较高,证明内质网应激可能是髓核细胞退变的重要机制之一。如能在下一步实验中发现具体哪一条下游通路发挥作用,并研究其激活或者阻遏对于髓核细胞生物学行为有哪些影响,将进一步印证内质网应激在椎间盘退变中的作用并为治疗找到新的潜在靶点。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201803077
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由第三军医大学主管、主办

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文天用, 刘月, 程实, 应金威, 阮狄克.
WEN Tianyong, LIU Yue, CHENG Shi, YING Jinwei, RUAN Dike.
人退变髓核细胞中内质网应激水平的观察研究
Endoplasmic reticulum stress in degenerative human nucleus pulposus cells
第三军医大学学报, 2018, 40(12): 1098-1103
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(12): 1098-1103
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201803077

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收稿: 2018-03-11
修回: 2018-04-03

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