2. 400021 重庆, 重庆市中医院:肿瘤科
2. Department of Oncology, Chongqing Traditional Chinese Medicine Hospital, Chongqing, 400021, China
肺癌是当前人类常见的恶性肿瘤之一, 并且是男性首位和女性第二位的肿瘤相关死亡原因[1]。与其他恶性肿瘤一样, 肿瘤细胞无限增殖和对正常组织的侵袭转移是肺癌的重要生物学特征[2], 也是肺癌恶性程度高, 易于复发和转移的内在原因。肺癌细胞增殖和迁移侵袭的机制被广泛研究, 但其中关键分子和潜在的治疗靶点仍有待发掘。
细胞骨架系统与多种细胞活动相关, 其中肌动蛋白骨架处于actin单体(global actin, G-acitn)多聚化组装生成纤丝状actin(filamentous actin, F-actin), 再由F-actin解离为G-actin的动态变化当中。胞内actin骨架不断转化, 在不同时间、不同胞内区域组装成不同的结构, 以适应细胞形态发生、迁移运动, 乃至细胞分化、分裂等多种活动的需要[3]。这个精细复杂的过程在上游信号通路的调控下, 由下游众多肌动蛋白调节分子协同执行完成。因此, 多种肌动蛋白调节分子的表达和功能明显影响细胞actin骨架调控, 进而影响细胞的多种重要生命活动[4]。腺苷酸环化酶关联蛋白1(adenylatecyclase-associated protein 1, CAP1)是一个多功能的actin调节分子, 在多种生物的进化上高度保守, 提示其在actin骨架调控中的重要作用。CAP1的基本功能是结合游离的G-actin单体, 同时CAP1能加速ADP-actin向ATP-actin的转化。这是actin多聚化中的限速步骤, 从而促进纤丝状的actin骨架形成; 并且CAP1还与actin解聚分子(actin-depolymerizing factor)ADF/cofilin密切协同, 加速其对纤丝状actin的切割解聚。由于上述功能, 通常认为CAP1促进细胞actin骨架形成并加速其转化[5], 理论上可增强正常细胞和肿瘤细胞的运动迁移能力。近年CAP1在肿瘤中的作用开始受到关注, 但已有的研究对CAP1在肿瘤中的表达情况, 以及CAP1对肿瘤细胞运动的作用结论并不一致[6-7]。目前对CAP1在肿瘤发生、发展中的作用尚不明确, 或者在不同肿瘤中CAP1有不同的表达状态及意义。CAP1在肺癌中的研究尚不多。有报道非小细胞肺癌(non-small cell lung cancer, NSCLC)中CAP1高表达的患者其脑转移风险增加, 同时发现CAP1敲低的肺癌细胞迁移能力减弱[8-9]。但除了对细胞迁移的影响, CAP1是否参与肺癌细胞的其他生物学行为尚不明确。本研究拟在NSCLC临床标本中验证CAP1的表达情况, 并在体外细胞实验中探讨CAP1在肺癌发生、发展中的作用, 以期从细胞骨架调节的角度为肺癌的防治提供新的策略并发现新的分子靶点。
1 材料与方法 1.1 材料与仪器42例经手术切除或经皮肺穿刺活检确诊的NSCLC石蜡包埋标本是重庆市中医院病理科2010-2015年库存标本。标本使用获得患者的知情同意, 本研究经重庆市中医院伦理委员会批准(2013-ZLK-01)。CAP1单克隆抗体(sc-376286)购自Santa Cruz公司, 肺癌A549及H460细胞系由本院基础实验室保存。其他主要试剂:RPMI1640培养基购自HyClone公司, 胎牛血清购自BI公司, Transwell小室购自Millipore公司, MTS试剂购自Promega公司, PI细胞周期试剂盒购自碧云天公司, phalloidin购自Sigma公司, RNAiso及RT-PCR试剂盒购自TaKaRa公司。主要仪器:CFX96荧光定量PCR仪购自Bio-Rad公司, 激光共聚焦荧光显微镜LSM 780购自Carl Zeiss公司, FACS Calibur流式细胞仪购自BD公司。
1.2 免疫组化检测及CAP1表达的半定量判定石蜡切片的免疫组化染色按常规方法进行。采用常用的半定量方法判定CAP1的表达[10]。细胞染色阳性百分比: < 5%细胞阳性为0分, 5%~25%细胞阳性为1分, 26%~50%细胞阳性为2分, 51%~75%细胞阳性为3分, >75%细胞阳性为4分; 染色强度得分:淡黄色1分, 棕黄色2分, 棕褐色3分。上述两项得分的乘积为总分:0~1分为阴性(-), 2~4分为弱阳性(+), 5~8分为中阳性(+ +), 9~12分为强阳性(+ + +)。
1.3 细胞培养及CAP1表达敲低肺癌A549及H460细胞以含10%胎牛血清的RPMI1640培养基, 于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养, 以shRNA慢病毒进行CAP1基因表达敲低。两个独立靶向CAP1基因mRNA的shRNA干扰序列为5′-CC-T GGCCCTTATGTGAAAGAA-3′(CAP1敲低sh-1组)、5′-CCCATCTCAGAGCAGATCAAA-3′(CAP1敲低sh-2组), 以无义shRNA序列为对照(对照组), 分别插入慢病毒质粒pLKO.1获得干扰质粒。常规包装获得shRNA慢病毒, 分别感染细胞并经嘌呤霉素筛选获得稳定敲低CAP1的肺癌细胞和对照细胞株。CAP1的干扰效率由RT-qPCR和Western blot在mRNA和蛋白水平验证。
1.4 肺癌细胞的增殖及克隆实验MTS法测定细胞增殖:以流式细胞仪将各组细胞按5 000/孔, 分别铺板到96孔板, 常规培养至各检测时间点, 每孔加入10 μL MTS试剂, 37 ℃孵育2 h后, 酶标仪测定波长490 nm处各孔光密度值[D(490)], 绘制细胞增殖曲线。
克隆形成实验:以流式细胞仪按100/孔, 将各组细胞分别铺板入24孔板, 常规培养2周, 4%多聚甲醛固定细胞后结晶紫染色, 计数各组克隆数。
1.5 细胞迁移实验及细胞actin骨架免疫荧光检测迁移实验以Transwell小室按常规方法进行; 无菌盖玻片置于24孔板内, 分别加入各组细胞培养制成细胞爬片, 经5 μg/mL的phalloidin避光染色40 min, DAPI复染后以激光共聚焦显微镜观察。
1.6 细胞周期分析常规消化收集细胞, 加入含50 μg/mL溴化乙啶、100 μg/mL RNase A、0.2% Triton X-100的PBS 500 μL, 4 ℃避光孵育30 min, 以流式细胞仪检测2×104个细胞, 结果用流式细胞软件FlowJo分析。
1.7 统计学分析采用SPSS 13.0统计软件, 数据以x±s表示; 计量资料组间比较采用单因素方差分析, 免疫组化组间比较采用Mann-Whitney U、Kruskal-Wallis H非参数检验。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 CAP1蛋白在肺癌组织中的表达免疫组化检测42例NSCLC临床标本中CAP1蛋白的表达, 发现CAP1在绝大部分肺癌组织内呈阳性及强阳性表达(图 1)。免疫组化半定量评分统计发现:肺癌组织中CAP1蛋白表达明显高于相应的癌旁组织和正常肺组织(P < 0.01, 图 1、表 1), 而癌旁组织与正常肺组织间CAP1表达差异无统计学意义。这些结果证明CAP1在肺癌组织中异常高表达, 提示CAP1可能在NSCLC的发生、发展中起某种作用。
临床标本 | n | - | + | ++ | +++ |
肺癌组织 | 42 | 2(4.8) | 8(19.0) | 19(45.2) | 13(31.0) |
癌旁组织a | 30 | 11(36.7) | 14(46.7) | 5(16.6) | 0(0.0) |
正常肺组织a | 13 | 8(61.5) | 5(38.5) | 0(0.00) | 0(0.0) |
a:P < 0.01, 与肺癌组织比较 |
2.2 CAP1敲低对肺癌细胞的迁移能力的影响
以两种独立的shRNA慢病毒感染肺癌细胞, 以嘌呤霉素筛选, 获得稳定敲低CAP1表达的肺癌A549及H460细胞株, 并在mRNA及蛋白水平验证两种肺癌细胞中CAP1表达敲低的效率(图 2)。划痕实验发现敲低CAP1后A549细胞的划痕愈合能力明显减弱(图 3), H460细胞划痕实验也显示出同样的趋势。Transwell实验也显示敲低CAP1表达在两种细胞中均导致迁移能力显著下降(图 4)。这些结果提示CAP1分子对肺癌细胞的迁移起促进作用。
2.3 CAP1敲低对肺癌细胞actin骨架形态的影响
以phalloidin对细胞内纤丝状actin染色, 行激光共聚焦显微镜观察, 发现CAP1敲低的细胞内纤丝状actin结构明显减少, actin主要呈弥散分布, 同时细胞外形变圆, 长径缩短, 细胞膜突起减少(图 5)。
2.4 敲低CAP1抑制肺癌细胞的增殖
MTS法检测CAP1敲低细胞和对照组细胞增殖情况, 发现CAP1敲低在两种肺癌细胞中都明显抑制了细胞增殖(P < 0.01, 图 6), 提示CAP1在NSCLC细胞的增殖中有重要作用。
2.5 敲低CAP1抑制肺癌细胞的克隆形成能力
细胞克隆形成实验发现, A549和H460细胞中敲低CAP1均导致其克隆形成能力较相应对照细胞明显下降(图 7), 证明CAP1在肺癌细胞的生长增殖中有重要作用。
2.6 CAP1敲低使得肺癌细胞阻滞在G0/G1期
流式细胞仪行细胞周期检测结果显示, 敲低CAP1后A549细胞并未出现明显的亚G1峰, 说明干扰CAP1后细胞增殖变慢并非是由于细胞凋亡增加。比较各周期的细胞分布, 发现CAP1敲低组细胞进入S期和G2/M期的比例较低, 而处于G0/G1期的细胞比例明显增高。这提示CAP1敲低对细胞增殖的抑制可能是由于CAP1降低导致了细胞G0/G1期阻滞(图 8)。
3 讨论
CAP蛋白最先在酵母Ras信号通路中的腺苷酸环化酶复合物内被发现, 并因此得名。虽然在哺乳动物中未再发现CAP参与Ras信号传导, 但CAP结合actin的功能在生物进化中高度保守[5, 11], 提示CAP在actin细胞骨架调控中具有重要作用。人类CAP家族有两个成员:CAP1和CAP2。CAP1广泛表达于各种组织细胞中因而研究较多。
近年来CAP1在肿瘤发生、发展中的作用也开始受到关注。有研究报道胰腺癌、肝癌、卵巢癌中CAP1表达增高[12-14], 其表达可能与患者肿瘤转移或预后不良相关, 但也有研究指出某些肿瘤中CAP1表达减低, 如乳腺癌和白血病[7], 且CAP1的低表达反而增强了宫颈癌HeLa细胞和部分乳腺癌细胞的迁移侵袭能力[6, 15]。这些结果表明CAP1在不同类型肿瘤中其生物学作用存在差异, 因此具体肿瘤中CAP1表达及其作用需要进一步研究。近期有研究报道NSCLC癌组织中CAP1的高表达与肺癌脑转移及生存期缩短有关[8-9], 但CAP1在肺癌中的具体生物学作用尚未完全阐明。我们通过对数十例NSCLC的临床组织标本的免疫组化检查, 发现CAP1在肺癌组织中较癌旁组织和正常肺组织的表达显著升高, 提示CAP1高表达可以作为肺癌诊断的一个生物学标志。
为了探讨高表达的CAP1在肺癌中的作用, 本实验通过在两种NSCLC细胞系中稳定敲低CAP1表达, 发现敲低CAP1显著降低了肺癌细胞的迁移能力。这与在乳腺癌或宫颈癌细胞中的研究结果[6, 15]不同, 而与在肺癌中的报道[8-9]相符, 证实肺癌中CAP1的确是促进细胞迁移运动的。癌细胞actin细胞骨架染色以及免疫荧光检测显示, CAP1敲低后肺癌细胞内F-actin形成明显减少, 细胞变圆, 细胞膜突起减少, actin骨架变化可能是CAP1敲低后细胞迁移能力减弱的原因。这提示CAP1可能通过促进肿瘤细胞F-actin的形成, 从而增强肿瘤细胞的迁移能力。
本研究显示, CAP1表达敲低后肺癌细胞的增殖减慢, 且克隆形成能力减弱, 说明CAP1在肺癌细胞的生长增殖过程中具有重要作用。从细胞周期的角度来观测CAP1对肺癌细胞增殖的影响, 发现CAP1敲低可能导致癌细胞G0/G1期阻滞。这些结果提示CAP1也参与癌细胞的细胞周期调控, 但具体机制尚不明确。MAPK是重要的细胞增殖调控信号通路。有研究指出改变CAP1表达能够引起ERK磷酸化状态的变化, 如在MCF-7细胞中敲低CAP1能够降低ERK1/2的磷酸化激活[15]。这是不是CAP1敲低后肺癌细胞增殖减慢的原因, 尚待进一步研究确定。
增殖失控是肺癌的重要恶性生物学行为, 而抑制癌细胞增殖则是抗肿瘤治疗的重要目标。现已发现NSCLC中多种基因的突变, 如EGFR突变、ALK重排等, 导致MAPK、PI3K/AKT等下游信号通路持续活化, 成为驱动癌细胞无限增殖的原因。而针对上述突变基因的靶向治疗已经应用于临床[16-17], 并推动肺癌治疗发生划时代的进步。但对于不具备上述基因靶点或对这些靶向治疗耐药的患者, 如何从其他机制寻找控制癌细胞增殖的方法仍有待研究。鉴于实验中发现的CAP1对于细胞增殖的显著影响, 以及CAP1与MAPK等信号通路潜在的关系, 从actin骨架调节的方向探寻肿瘤细胞异常增殖的原因, 可能会发现新的治疗靶点。
综上所述, 肌动蛋白调节分子CAP1在NSCLC中异常高表达并促进肺癌细胞迁移; CAP1表达高低会显著影响肺癌细胞actin骨架形态, 可能因此影响肺癌细胞的迁移能力。更重要的是, CAP1还在肺癌细胞的生长增殖中有重要作用, CAP1降低引起细胞周期阻滞。CAP1参与细胞周期活动的具体机制有待深入研究。
[1] | TORRE L A, BRAY F, SIEGEL R L, et al. Global cancer statistics, 2012[J]. CA Cancer J Clin, 2015, 65(2): 87–108. DOI:10.3322/caac.21262 |
[2] | HANAHAN D, WEINBERG R A. Hallmarks of cancer:the next generation[J]. Cell, 2011, 144(5): 646–674. DOI:10.1016/j.cell.2011.02.013 |
[3] | ROTTNER K, FAIX J, BOGDAN S, et al. Actin assembly mechanisms at a glance[J]. J Cell Sci, 2017, 130(20): 3427–3435. DOI:10.1242/jcs.206433 |
[4] | SHISHKIN S, EREMINA L, PASHINTSEVA N, et al. Cofilin-1 and other ADF/cofilin superfamily members in human malignant cells[J]. Int J Mol Sci, 2016, 18(1): 10. DOI:10.3390/ijms18010010 |
[5] | ONO S. The role of cyclase-associated protein in regulating actin filament dynamics—more than a monomer-sequestration factor[J]. J Cell Sci, 2013, 126(Pt 15): 3249–3258. DOI:10.1242/jcs.128231 |
[6] | ZHANG H, GHAI P, WU H, et al. Mammalian adenylyl cyclase-associated protein 1 (CAP1) regulates cofilin function, the actin cytoskeleton, and cell adhesion[J]. J Biol Chem, 2013, 288(29): 20966–20977. DOI:10.1074/jbc.M113.484535 |
[7] | XIE S, SHEN C, TAN M, et al. Systematic analysis of gene expression alterations and clinical outcomes of adenylatecyclase- associated protein in cancer[J]. Oncotarget, 2017, 8(16): 27216–27239. DOI:10.18632/oncotarget.16111 |
[8] | TAN M, SONG X, ZHANG G, et al. Overexpression of adenylatecyclase-associated protein 1 is associated with metastasis of lung cancer[J]. Oncol Rep, 2013, 30(4): 1639–1644. DOI:10.3892/or.2013.2607 |
[9] | XIE S S, TAN M, LIN H Y, et al. Overexpression of adenylatecyclase-associated protein 1 may predict brain metastasis in non-small cell lung cancer[J]. Oncol Rep, 2015, 33(1): 363–371. DOI:10.3892/or.2014.3577 |
[10] | SU L, LUO Y, YANG Z, et al. MEF2D Transduces microenvironment stimuli to zeb1 to promote epithelial-mesenchymal transition and metastasis in colorectal cancer[J]. Cancer Res, 2016, 76(17): 5054–5067. DOI:10.1158/0008-5472.CAN-16-0246 |
[11] | ZHOU G L, ZHANG H, FIELD J. Mammalian CAP (Cyclase-associated protein) in the world of cell migration:Roles in actin filament dynamics and beyond[J]. Cell Adh Migr, 2014, 8(1): 55–59. DOI:10.4161/cam.27479 |
[12] | HUA M, YAN S, DENG Y, et al. CAP1 is overexpressed in human epithelial ovarian cancer and promotes cell proliferation[J]. Int J Mol Med, 2015, 35(4): 941–949. DOI:10.3892/ijmm.2015.2089 |
[13] | LIU Y, CUI X, HU B, et al. Upregulated expression of CAP1 is associated with tumor migration and metastasis in hepatocellular carcinoma[J]. Pathol Res Pract, 2014, 210(3): 169–175. DOI:10.1016/j.prp.2013.11.011 |
[14] | YAMAZAKI K, TAKAMURA M, MASUGI Y, et al. Adenylatecyclase-associated protein 1 overexpressed in pancreatic cancers is involved in cancer cell motility[J]. Lab Invest, 2009, 89(4): 425. DOI:10.1038/labinvest.2009.5 |
[15] | ZHANG H, ZHOU G L. CAP1 (cyclase-associated protein 1) exerts distinct functions in the proliferation and metastatic potential of breast cancer cells mediated by ERK[J]. Sci Rep, 2016, 6: 25933. DOI:10.1038/srep25933 |
[16] | HIRSCH F R, SCAGLIOTTI G V, MULSHINE J L, et al. Lung cancer:current therapies and new targeted treatments[J]. Lancet, 2017, 389(10066): 299–311. DOI:10.1016/s0140-6736(16)30958-8 |
[17] | GRIFFIN R, RAMIREZ R A. Molecular targets in non-small cell lung cancer[J]. Ochsner J, 2017, 17(4): 388–392. |