在呼吸道感染的进程中, 病原菌于呼吸道上皮细胞上的初始黏附是其定植直至感染开始的关键一步。因此, 研究细菌在呼吸道上皮细胞的黏附, 对于呼吸道感染疾病的防治研究具有重要的意义。但是, 现有的用于研究细菌与宿主细胞黏附的模型较少见, 多采用在培养板中培养细胞的培养板模型[1-4]。培养板模型虽操作简便, 但存在以下不足:①培养环境封闭, 细菌与宿主细胞的共同作用过程中所产生的一些代谢产物和毒力因子等会使封闭环境发生显著变化, 与体内真实情况不符; ②体内环境中, 细菌会随着流动的体液发生位移, 是一个动态黏附的过程, 培养板模型不具有此特征; ③培养板模型中, 受培养上清中浮游菌的干扰, 难以采用荧光显微镜观察或激光共聚焦显微镜对细菌与宿主细胞的相互作用进行实时观察。
流动小室现多作为体外观察和定量细菌生物膜(bacterial biofilm)形成的可靠模型[5-8], 相对于生物膜研究的微孔板模型, 具有接近体内真实环境、可动态观察等优点, 其开放性和流动性的特点正好可以弥补现有的培养板模型的不足。目前少见利用流动小室结构开展细菌在宿主细胞上黏附的研究, 而既往有研究者在流动小室底部铺上培养细胞, 实现了对细菌生物膜在宿主细胞上形成的观察[9]。受此启发, 本研究通过体外培养呼吸道上皮细胞并铺设于流动小室底部, 以含2.5%血清的RPMI1640培养基为流动相, 构建可用于研究细菌在宿主细胞上初始黏附的体外模型。
鲍曼不动杆菌(Acinetobacter baumannii, Ab)是院内呼吸道感染的常见病原菌, 较强的黏附能力是其主要的特征[10-11], 常导致医院获得性肺炎等严重的呼吸道疾病[12-13]。本实验将选用HBE人支气管上皮细胞作为细胞模型, 以Ab标准菌株ATCC17978作为模式菌应用于本模型的建立。
1 材料与方法 1.1 仪器与试剂三通道流动小室flow-chamber、气泡捕捉器购自美国IBI公司; 蠕动泵购自美国科尔帕默; 多通道蠕动泵泵头, 蠕动泵硅胶管购自雷弗流体科技有限公司; BP221S型电子天平购自德国Sartorius公司; 酶标仪购自美国MD公司; Z2全自动细胞计数仪购自美国贝克曼库尔特公司; IX倒置荧光显微镜购自日本奥林巴斯公司。SYTO9(LIVE/DEAD BacLight Bacterial Viability Kit)购自美国Molecular Probes公司; 血琼脂培养基和营养琼脂平板购自重庆庞通医疗器械有限公司; 胎牛血清购自德国PAN公司; RPMI1640培养基、胰酶购自美国HyClone公司; Triton X-100购自碧云天公司; L-glutamine购自Gibco公司; 牛胶原蛋白购自美国Sigma公司。
1.2 菌株和细胞的来源ATCC17978、PAO1来自西南医院药物临床试验机构保存菌株。HBE、A549细胞购自美国ATCC细胞库。
1.3 常规培养板模型的构建选用文献[1-4]中常用的研究模型24孔板为研究载体, 在24孔板中预培养一层HBE细胞, 37℃, 5%CO2培养24 h后待其刚好长满, 即可作为研究Ab在呼吸道上皮细胞初始黏附的静止模型。
1.4 流动小室模型的构建 1.4.1 流动小室的结构以流动小室为研究载体, 在其底部培养一层上皮细胞, 接入流动系统后给以一定流动环境, 构建出用于流动状态下细菌在细胞上初始黏附的研究模型。流动系统结构见图 1, 按照储液瓶、蠕动泵、气泡捕捉器、flow-chamber、废液瓶的顺序用硅胶管将各部件连接, 储液瓶中装有流动相, 并且要预先使流动相充满管道, 以上均在37℃环境中进行。
1.4.2 流动小室中上皮细胞的培养
流动小室中预包被一层2 mg/mL的牛胶原蛋白, 置紫外下灭菌2 h; 将HBE细胞接种至流动小室中, 培养于含20%灭活胎牛血清和2 mmol/L L-glutamine的RPMI1640培养基中, 5%CO2, 37℃培养24 h, 待其融合长满后用于实验。
1.5 正交实验因素与水平设计流动小室中细胞模型维持稳定是保证后期黏附实验稳定进行的前提。采用L9(34)正交实验优选流动小室的实验参数, 以流动小室中活细胞数量为指标, 对模型的条件参数流速、流动时长和流动相成分进行考察, 因素与水平见表 1。
水平 | 流速/μL·min-1 | 流动时长/h | 流动相成分 |
1 | 25 | 2 | 流动相1 |
2 | 50 | 3 | 流动相2 |
3 | 75 | 4 | 流动相3 |
流动相1:RPMI1640+2 mmol/L L-glutamine; 流动相2:RPMI1640+2.5%FBS; 流动相3:RPMI1640+2 mmol/L L-glutamine+2.5%FBS |
1.6 活细胞的收集与计数
将200 μL 5×108CFU/mL细菌量加入流动小室, 37℃静置1 h后接入流动系统, 分别在正交实验设定好的流动条件下进行实验; 实验完成后用PBS清洗2次, 加入200 μL胰蛋白酶, 37℃孵育2 min后显微镜下观察孔道内细胞消化完全后全部吸出, 用200 μL流动相清洗孔道3次并终止消化作用, 最终使细胞悬液终体积为1 mL。最后进行细胞计数。各实验条件下每组设3个重复。
1.7 流动时长的单因素考察正交实验结果得到流速50 μL/min和流动相RPMI 1640+ 2 mmol/L L-glutamine+2.5%FBS为最优, 而细胞数随流动时长减小而增加。因此, 以最优条件对流动时长作进一步单因素考察。实验过程为:以200 μL 5×108CFU/mL细菌量加入流动小室, 37℃静置1 h后接入流动系统, 流动相为RPMI1640+2 mmol/L L-glutamine+2.5%FBS, 流速为50 μL/min, 分别流动0.5、1、1.5、2和2.5 h后收集小室中的活细胞并计数。
1.8 实时显微镜成像荧光显微镜观察方法:1 μmol/L SYTO9活菌染料将细菌标记, 调整菌液浓度至2×108和5×107CFU/mL (MOI=200和MOI=50), 加入流动小室中与上皮细胞黏附; 根据最优实验条件:37℃环境下, 预静置1 h, 以流速50 μL/min, 流动时长1 h后, 取出流动小室, 可即刻放置于荧光显微镜下观察细菌在细胞上的黏附情况。以具有代表性的另一种呼吸道细胞系A549细胞作为验证。
1.9 两种模型黏附实验比较根据已得到的流动小室最优实验条件, 将该模型用于黏附实验的细菌定量检测, 并以常规培养板研究方法为比较。
流动小室模型实验步骤:将小室中原有的细胞培养液去除, 并用流动相溶液适应性培养0.5 h。以2×108、108、5×107、2.5×107 CFU/mL(MOI=200、100、50、25)浓度细菌悬液每孔道200 μL的量加入流动小室中, 37℃静置孵育1 h后, 接入流动系统, 以最佳流速50 μL/min和流动时长1 h为实验条件进行黏附实验。实验以其他菌种铜绿假单胞菌标准株PAO1作为对比。
常规培养板模型实验步骤:实验前将已建立模型中原有细胞培养液去除, 用对应的流动相溶液清洗3次, 适宜性培养0.5 h。以上各浓度细菌悬液以每孔250 μL体积加入, 37℃静置孵育2 h后, 用PBS溶液洗去其中未黏附上的浮游菌, 清洗3次。
黏附细菌的计数:选用平板计数法对细胞上已黏附的细菌进行计数。黏附实验完成后, 用细胞裂解液(0.25%胰酶和0.2%Triton X-100等体积混合)将流动小室和24孔板中的细胞充分裂解并收集; 用无菌生理盐水将细菌细胞混合溶液10倍连续稀释4~5个梯度, 取每个梯度的稀释液200 μL于营养琼脂平板中涂布, 每个稀释度涂布3次, 37℃倒置培养24 h后计数菌落数。计数方法:选取菌落数刚好在30~300之间的稀释梯度, 数完菌落数后换算成浓度再乘以稀释倍数。每个处理设3个重复, 取其均值。
1.10 统计学分析采用SPSS 13.0软件进行统计处理, 数据以x ±s表示, 正交实验结果采用方差分析, 两组间比较采用独立样本t检验, P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 正交实验结果正交实验直观分析结果见表 2, 极差显示影响因素主次为A>B>C, 即流速>流动时长>流动相成分。方差分析结果显示, 流速和流动时长对流动小室中细胞模型有显著影响, 且差异具有统计学意义(P < 0.05, 表 3), 流动相成分改变对细胞模型影响不大; 最佳条件为A2B1C3, 即流速50 μL/min, 流动时长2 h, 流动相为RPMI1640+2 mmol/L L-glutamine+2.5%FBS。由于检测指标随着流动时长减小而增大, 为优选最佳条件, 对流动时长做进一步单因素考察, 即考察流速50 μL/min(A2)、流动相为RPMI1640+2 mmol/L L-glutamine+2.5%FBS(C3)条件下, 流动时长对细胞模型的影响。
实验号 | A | B | C | D | 细胞数/×104个 |
1 | 1 | 1 | 1 | 1 | 26.69 |
2 | 1 | 2 | 2 | 2 | 25.12 |
3 | 1 | 3 | 3 | 3 | 21.53 |
4 | 2 | 1 | 2 | 3 | 26.98 |
5 | 2 | 2 | 3 | 1 | 25.53 |
6 | 2 | 3 | 1 | 2 | 21.89 |
7 | 3 | 1 | 3 | 2 | 19.83 |
8 | 3 | 2 | 1 | 3 | 17.55 |
9 | 3 | 3 | 2 | 1 | 14.51 |
均值1 | 24.447 | 24.500 | 22.043 | 22.243 | |
均值2 | 24.800 | 22.733 | 22.203 | 22.280 | |
均值3 | 17.297 | 19.310 | 22.297 | 22.020 | |
极差 | 7.503 | 5.190 | 0.254 | 0.260 |
因素 | 偏差平方和 | 自由度 | F比 | F临界值 |
流速 | 107.547 | 2 | 903.756 | 19.000a |
流动时长 | 41.776 | 2 | 351.059 | 19.000a |
流动相成分 | 0.098 | 2 | 0.824 | 19.000 |
误差 | 0.120 | 2 | ||
a:P < 0.05 |
2.2 单因素考察流动时长
以正交实验选取的最优参数A2、C3为固定条件, 单独对流动时长进行单因素考察, 结果见表 4; 指标随着时间增加而降低, 综合黏附实验研究所需时间要求, 选取流动时长1 h作为后期黏附实验最优条件。
2.3 荧光标记细菌在细胞上的黏附
在流动小室最优实验条件下, SYTO9标记ATCC17978, 以A549细胞系作为验证, 结果见图 2; 荧光显微镜下观察可见细胞上绿色荧光, 表示细菌在细胞上的黏附, 荧光量的强弱可反映细菌黏附的数量大小; 结果表明, 两种呼吸道细胞上皆可见绿色荧光, 提示该优化条件下可采用荧光标记手段对细菌黏附进行实时定量观察, 并且该方法同样适用于A549细胞系构建的模型。
2.4 细菌黏附实验结果
两种模型黏附实验结果见表 5, 以细菌黏附量为检测指标, 通过线性关系、检测结果精密度和检测值大小对两种模型进行评价, 发现在鲍曼不动杆菌黏附实验中, 随着加入细菌量增大, 细胞上的黏附数量随之增大, 两种模型细菌黏附量与菌液浓度均表现出良好线性关系, 流动小室模型检测结果精密度高于常规模型, 说明流动小室可替代常规模型用于细菌黏附研究。同样的感染复数下, 常规24孔板静止模型的黏附率要高于流动小室模型(P < 0.05), 说明在流动和静止两种不同状态下细菌在细胞上的黏附率不同, 静止状态下细菌在细胞上的黏附明显偏高, 原因在于静止状态下细菌在细胞上发生的被动黏附。由PAO1黏附实验结果可知, 其流动小室模型下检测结果误差偏大, 且线性关系不佳, 说明该优化条件仅适用于鲍曼不动杆菌黏附实验分析, 而对于其他菌种需要重新调整最优条件参数。
模型 | 感染复数 | 流动小室 | 24孔培养板 |
ATCC17978 | MOI=200 | 463±32 a | 612±51 |
MOI=100 | 251±16 b | 325±21 | |
MOI=50 | 132±19 | 173±43 | |
MOI=25 | 65±12 | 96±23 | |
PAO1 | MOI=200 | 201±51b | 479±30 |
MOI=100 | 186±52 | 238±22 | |
MOI=50 | 88±35 | 123±23 | |
MOI=25 | 35±13 | 61±15 | |
a:P < 0.05, b:P < 0.01, 与24孔培养板比较 |
3 讨论
对于细菌生物膜的研究, 流动小室(flow-chamber)已被视为公认的细菌生物膜感染的体外模型, 其特点是结构相对开放, 并能在每个阶段观察生物膜形成, 了解生物膜形成的结构[5-8]。与传统96孔板结晶紫染色法相比, 不仅模拟了体内环境, 更从可视化角度研究细菌生物学行为。目前为止鲜有报道将该模型用于研究细菌与宿主细胞相互作用, 且未见其用于细菌在宿主细胞的初始黏附。有学者借助微流小室模型用于在流体切应力下细胞形态学改变和模拟体内血流环境研究细胞因子与血管内皮细胞相互作用[14]。微流控流动小室[15-16]与该模型类似, 具有开放和流动的环境, 已应用于细胞相关研究, 但其中细胞数量极少, 不适用于细菌黏附的定量检测。
细菌在宿主细胞上的初始黏附与感染的建立密切相关, 本实验实现在体外培养呼吸道上皮细胞于流动小室中, 并找到了可靠的参数(如流速、流动时长和流动相)组成, 从而建立起用于研究鲍曼不动杆菌在宿主上皮细胞黏附的流动模型。由文献[1-4]可知, 细菌在0~3 h内与细胞发生的相互作用可认为是初始阶段的黏附。因此, 实验得到的最佳流动时长刚好满足细菌初始黏附的需求。
相比于培养板模型, 流动小室模型具有以下三方面优势:①可实时观察细菌在宿主细胞上的黏附情况。从结果可看出, 本实验已实现对流动小室内部实时显微镜观察, 并能对已黏附细菌进行荧光成像和定量检测。②更贴近体内真实的动态环境。由小室中黏附细菌的定量检测结果可知, 两种模型在相同感染复数条件下检测细菌黏附率, 在感染复数25~200范围内随着感染复数增加细菌黏附量增大; 24孔培养板模型的检测结果比流动小室流动模型显著偏高, 提示培养板模型存在一些被动黏附的细菌。其原因可能在于重力因素或密闭环境内细菌快速增殖等, 与体内环境不符。③流动小室模型能使细菌和宿主相互作用环境保持基本恒定。随着时间增加, 细菌和宿主细胞不断消耗营养物质并产生代谢产物, 培养环境中营养成分比例、酸碱性失衡, 影响细胞正常的生理活性。
本实验通过方法学摸索建立了基于流动小室的一种稳定可靠的研究模型, 可替代传统的培养板方法用于细菌在呼吸道上皮细胞的黏附实验。除鲍曼不动杆菌外, 呼吸道其他常见病原菌如铜绿假单胞菌、肺炎克雷伯菌和金黄色葡萄球菌等, 它们在呼吸道部位感染的建立同样必经早期的宿主细胞黏附的过程, 该模型也同样适用于以上病原菌在宿主细胞的黏附研究, 当然需要针对不同菌种作适当的模型参数调整。因此, 流动小室模型是一种具广泛研究意义、可靠且稳定的用于细菌在宿主细胞黏附的体外研究模型。
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