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FABD结构域缺失削弱293T细胞BCR/ABL癌蛋白抗凋亡能力
周芳竹, 黄峥兰, 骆贞红, 王腾, 冯文莉     
400016 重庆,重庆医科大学检验医学院临床血液学教研室, 临床检验诊断学教育部重点实验室
[摘要] 目的 通过转染野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-BCR/ABL-ΔFABD于293T细胞中,探讨FABD结构域对Bcr/Abl癌蛋白抗凋亡能力的影响及相关机制。方法 293T细胞分别转染野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD质粒,并设置Blank组和Adtrack组作为对照,分别培养24、48、72 h后,采用流式细胞术(FCM)检测转染荧光强度并筛选最佳转染条件,Western blot验证蛋白表达。采用WST-1(水溶性四唑盐)实验及FCM检测FABD结构域对BCR/ABL癌蛋白促增殖抗凋亡能力的影响;DAPI染色观察细胞核形态变化;Western blot分别检测p-bcr/abl、p-AKT、p-ERK表达及凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP蛋白活化情况。结果 FCM检测结果显示质粒转染效率呈时间依赖性增加,并选择48 h为最佳转染时间。Western blot结果证实已经成功构建野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD质粒。WST-1实验及FCM检测结果显示,FABD结构域缺失可显著抑制细胞增殖并促进凋亡,在处理48 h后细胞凋亡数达到29.0%(P < 0.05);在FABD结构域缺失后,p-AKT、p-ERK表达显著下调;凋亡相关蛋白Caspase-3、PARP均在48 h明显活化。结论 FABD结构域缺失可显著削弱BCR/ABL癌蛋白促增殖抗凋亡能力,其可能与下调AKT、ERK信号通路并激活线粒体凋亡途径有关。
[关键词] FABD结构域     BCR/ABL     AKT、ERK信号通路     凋亡    
Depletion of F-actin binding domain reduces the ability of BCR/ABL to resist apoptosis in 293T cells
ZHOU Fangzhu , HUANG Zhenglan , LUO Zhenhong , WANG Teng , FENG Wenli     
Department of Hematology, Key Laboratory of Medical Diagnostics of Ministry of Education, College of Laboratory Medicine, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81572060), and the Postgraduate Innovation Project of Chongqing (CYS16136)
Corresponding author: FENG Wenli, E-mail: fengwlcqmu@sina.com
[Abstract] Objective To investigate the effects of F-actin binding domain (FABD) on BCR/ABL function in 293T cells by transfecting wild-type pAd-Bcr/Abl and mutant pAd-Bcr/Abl -ΔFABD. Methods Firstly, 293T cells were transfected wild-type pAd-Bcr/Abl and mutant pAd-Bcr/Abl-ΔFABD plasmid, respectively. Then the transfected cells and blank control cells were cultivated for 24, 48, or 72 h. Flow cytometry was used to detect the fluorescence intensity to screen optimal transfection conditions. Western blotting was employed to detect the expression of related proteins. Secondly, the effects of FABD on proliferation and apoptosis of the cells promoted by BCR/ABL oncoprotein were detected by WST-1 assay and flow cytometry, respectively. DAPI staining was adopted to observe the changes of nuclear morphology. The protein expression of p-BCR/ABL, p-AKT, p-ERK, and apoptosis related protein Caspase-3, and PARP activity was determined by Western blotting. Results The results of flow cytometry showed that the efficiency of plasmid transfection was increased in a time-dependent manner, and 48 h was identified as the optimal transfection time. Western blotting results confirmed the pAd-Bcr/Abl and mutant pAd-Bcr/Abl-ΔFABD plasmids were constructed successfully. After the transfection of pAd-Bcr/Abl and mutant pAd-Bcr/Abl-ΔFABD plasmids into 293T cells, WST-1 assay and flow cytometry that FABD depletion significant inhibited cell proliferation and promoted apoptosis, with the percentage of apoptotic cells accounting for 29.0% in 48 h after treatment (P < 0.05). The depletion also down-regulated the expression of p-AKT and p-ERK and activated Caspase-3 and PARP in 48 h after transfection. Conclusion FABD depletion reduces the cell apoptosis promoted by BCR/ABL oncoprotein, which might be though down-regulating AKT and ERK signaling pathways and activating mitochondrial associated apoptotic pathway.
[Key words] F-actin binding domain     BCR/ABL     AKT/ERK signal pathways     apoptosis    

慢性髓细胞白血病(chronic myeloid leukemia,CML)是一类起源于造血干细胞的克隆性疾病,因发生染色体易位t(9;22)(q34;q11)而形成特征性遗传学标志Ph染色体[1-3]。位于9q34上的c-Abl基因与22q11上的Bcr基因易位形成Bcr/Abl融合基因。该基因表达的BCR/ABL癌蛋白具有高酪氨酸激酶活性,可通过激活PI3K-AKT-BAX等多条信号通路参与调控白血病细胞的恶性增殖、凋亡,在CML发生、发展中起关键作用[4-6]。目前,酪氨酸激酶抑制剂伊马替尼(Imatinib,IM)作为临床治疗的一线用药,其可竞争性结合BCR/ABL激酶活性区ATP结合口袋,阻断BCR/ABL及下游分子磷酸化,破坏CML细胞生存途径,从而使大部分CML患者得到缓解。然而随着药物的大量应用,临床上的耐药现象亦愈发明显[7-9]。因此,寻求新的治疗靶点和策略具有重要意义。

FABD结构域(F-actin binding domain,FABD)是位于BCR/ABL蛋白上ABL端的大片段非催化结构域,其对c-ABL蛋白在细胞内的定位及生物学功能非常重要[10-11]。此外,有研究报道FABD结构域可通过与细胞骨架蛋白F-actin、FAK、Paxillin等相互作用从而影响细胞的黏附及迁移[12-14],但是该结构域对BCR/ABL蛋白抗凋亡能力的影响尚不清楚。因此,本研究在课题组前期已构建野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD质粒的基础上,以细胞中无野生型BCR/ABL蛋白表达的293T细胞为研究对象,探究FABD结构域对BCR/ABL癌蛋白抗凋亡能力的影响及相关机制。

1 材料与方法 1.1 材料与试剂

野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD质粒、空载质粒pAd-track由本课题组前期构建[15]及保存。质粒提取试剂盒购于天根生化科技公司,脂质体转染试剂Lipofectamine 2000、Anti-HA-Ms标签抗体购于Abcam公司,DAPI染料购于碧云天公司。DMEM培养基、小牛血清(FBS)购于美国Gibco公司,细胞增殖检测试剂WST-1购于瑞士Roche公司,伊马替尼(Imatinib)购于瑞士诺华制药,p-Bcr/Abl、Bcr/Abl、p-AKT、PARP、Cleaved-Caspase3抗体购于Cell Signaling Technology公司,β-actin抗体购自中杉金桥公司。实验中所用仪器主要为酶标仪、流式细胞计数仪、化学发光仪、倒置荧光显微镜。

1.2 细胞培养

293T细胞为美国芝加哥大学何通川教授惠赠,由本实验室液氨保存,定期复苏观察细胞状态,以确保细胞的稳定性。使用10%FBS的DMEM培养基,于37 ℃,5%CO2孵箱中培养,取对数生长期细胞进行实验,细胞起始接种浓度为1×105/mL。

1.3 质粒转染及转染条件筛选

按照质粒提取试剂盒说明书操作步骤提取细菌质粒并测定浓度。将293T细胞分为4组:Blank组、Ad-track组、BCR/ABL组和BCR/ABL-ΔFABD组,各组细胞按2×105/孔加入6孔培养板,分别加入对应的质粒,按照转染试剂Lipofectamine 2000使用说明书配制转染液。分别转染24、48、72 h后在正置荧光显微镜下观察转染效率并拍照,收集各组细胞,PBS洗2次,1 000 r/min离心后去上清,1 mL PBS重悬后,应用流式细胞术检测荧光强度并计算转染效率。

1.4 水溶性四唑盐(WST-1)检测Bcr/Abl-ΔFABD对细胞增殖的影响

分组同1.3。每组5个复孔,每孔3 000个细胞,待细胞贴壁后,分别转染24、48、72、96 h后加入WST-1 10 μL,4 h后应用酶标仪在波长440 nm处检测光密度值[D(440)],重复3次并分析制图。

1.5 流式细胞术检测细胞凋亡

分组同1.3。各组细胞按2×105/孔加入6孔培养板中,分别进行对应质粒的转染,在转染48 h后收集细胞沉淀,PBS洗2次,用1 mL PBS重悬,采用FCM检测细胞凋亡数。重复进行3次并分析制图。

1.6 DAPI染色观察细胞核形态变化

分组同1.3。各组细胞按1×105/孔加入12孔培养板中,转染48 h后取出爬片,用4%多聚甲醛室温固定15 min,PBS洗3次后干燥,1% Triton X-100透化15 min,PBS洗3次后干燥,加DAPI试剂于37 ℃染色15 min,PBS洗3次后干燥,甘油封片后于荧光显微镜下观察。

1.7 Western blot检测蛋白的表达水平

将293T细胞分为4组:Blank组、BCR/ABL组、BCR/ABL+Imatinib(IM)组和BCR/ABL-ΔFABD组。取1×106各组细胞加入10 cm的塑料圆盘中,转染48 h后按照操作说明提取细胞蛋白,用BCA(碧云天)法测定蛋白浓度,经10% SDS-PAGE分离胶电泳,将蛋白质电转移至PVDF膜,5%脱脂奶粉4 ℃封闭4 h;分别孵一抗,4 ℃过夜;用TBST洗涤膜3次,孵IgG-HRP羊抗兔二抗,用TBST洗涤膜2次,TBS洗膜1次,采用ECL化学发光法检测目的蛋白表达情况。

1.8 统计学分析

实验均重复3次,采用SPSS 19.0统计软件,计量数据以x±s表示,多组间比较采用方差分析,两组间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 转染条件筛选及质粒表达验证

分别转染野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD质粒于293T细胞,显微镜观察结果显示,绿色荧光密度在48、72 h明显高于24 h,并呈时间依赖性(图 1A)。FCM检测结果显示,pAd-track、pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD在24 h转染率分别为50.2%、37.9%、29.1%,48 h转染率分别为72.0%、51.4%、46.9%,同组不同时间差异均有统计学意义(P < 0.05,图 1B)。与质粒转染后48 h比较,72 h细胞死亡较多,不利于后续实验。因此,后续研究选择48 h为最佳转染时间。此外,Western blot检测结果显示,HA-Tag及BCR/ABL蛋白均能在BCR/ABL及pAd-BCR/ABL-ΔFABD组中表达(图 2)。

A:荧光显微镜观察转染效率(×100);B:FCM检测细胞转染率 图 1 质粒转染条件筛选的荧光显微镜观察及流式细胞术检测结果

1:Blank组;2:BCR/ABL组;3: BCR/ABL-ΔFABD组 图 2 质粒转染后HA-Tag及BCR/ABL蛋白表达验证

2.2 FABD结构域缺失抑制BCR/ABL癌蛋白促增殖能力

293T细胞分别转染对应质粒并培养24、48、72、96 h,WST-1检测结果显示:与BCR/ABL组比较,BCR/ABL-ΔFABD组在48、72 h细胞生长受到明显抑制,并呈时间依赖性,差异有统计学意义(P < 0.05,图 3A)。Western blot检测BCR/ABL及下游蛋白磷酸化表达结果显示,与BCR/ABL组比较,用Imatinib处理后,BCR/ABL及下游信号分子AKT、ERK蛋白磷酸化水平均显著下调。同样,在BCR/ABL-ΔFABD组中BCR/ABL蛋白下游的p-AKT、p-ERK蛋白表达均明显减少,差异具有统计学意义(P < 0.05,图 3BC)。

A:WST-1检测FABD结构域缺失对细胞增殖的影响a: P < 0.05, 与BCR/ABL组比较; B:Western blot检测BCR/ABL及下游蛋白磷酸化表达1:Blank组;2:BCR/ABL组;3:BCR/ABL+IM组;4:BCR/ABL-ΔFABD组;C:蛋白表达半定量分析a: P < 0.05,b: P < 0.01, 与BCR/ABL组比较 图 3 FABD结构域缺失对BCR/ABL癌蛋白促增殖能力的影响

2.3 FABD结构域缺失削弱BCR/ABL癌蛋白抗凋亡能力

结果显示,与BCR/ABL组比较,BCR/ABL-ΔFABD组细胞凋亡显著增加,差异具有统计学意义(P < 0.05)。此外,BCR/ABL-ΔFABD组在转染48 h后细胞凋亡数量较Blank组及Adtrack组明显增多(图 4AB)。进一步采用核染色观察细胞核形态变化情况,结果发现,与BCR/ABL组相比,BCR/ABL-ΔFABD组细胞核形态发生染色质聚集固缩,核碎裂,核膜肿胀等显著凋亡变化(图 4C)。此结果与流式细胞术检测结果一致。

A: FCM检测FABD结构域缺失对细胞凋亡的影响; B:各组细胞凋亡率比较1:Blank组;2:Adtrack组;3:BCR/ABL组;4: BCR/ABL-ΔFABD组;a: P < 0.01, 与BCR/ABL组比较;C: DAPI染色观察细胞核形态改变(×400) ↑:示细胞核碎裂及凋亡小体形成等形态改变 图 4 流式细胞术及DAPI染色检测BCR/ABL-ΔFABD对细胞凋亡的影响

2.4 FABD结构域缺失可显著影响凋亡相关蛋白表达及活化

将293T细胞分为Blank组、BCR/ABL组、BCR/ABL+IM组以及BCR/ABL-ΔFABD组,分别转染相应的质粒后培养48 h,Western blot检测结果发现,FABD结构域缺失后,凋亡相关蛋白PARP和Caspase3蛋白发生明显活化。同时,相比BCR/ABL组而言, Caspase3活化条带表达明显,促凋亡蛋白Bax表达显著增加(图 5)。

1:Blank组;2:BCR/ABL组;3: BCR/ABL+IM组;4: BCR/ABL-ΔFABD组 图 5 Western blot检测凋亡相关蛋白PARP、Cleaved- Caspase3、Bax的表达及活化情况

3 讨论

FABD结构域是存在于BCR/ABL蛋白上ABL端的一段功能结构域,其对c-ABL蛋白生物学功能起着关键作用,若FABD结构域缺失,c-ABL从胞质进入胞核并引发细胞显著凋亡[16]。那么,鉴于FABD结构域对c-ABL生物学功能的重要影响,其是否对BCR/ABL蛋白也起着关键作用呢?目前,FABD结构域对BCR/ABL癌蛋白生物学功能的作用还未见详细报道。因此,本研究着重探讨FABD结构域缺失对BCR/ABL癌蛋白促增殖抗凋亡能力的影响和相关机制。

本研究主要通过转染野生型pAd-Bcr/Abl及缺失突变型pAd-Bcr/Abl-ΔFABD于293T细胞中,进一步探讨FABD结构域缺失对BCR/ABL癌蛋白促增殖抗凋亡能力的影响。首先,验证了前期构建的质粒及外源性BCR/ABL蛋白在细胞内的表达,通过转染条件摸索最终选择48 h为最佳转染时间,此时质粒转染效率可达51.4%。然后,检测了FABD结构域缺失对BCR/ABL癌蛋白体外促增殖抗凋亡能力的影响。WST-1实验结果显示FABD结构域缺失可显著抑制BCR/ABL癌蛋白体外促增殖能力。同时,Western blot检测BCR/ABL及下游信号分子磷酸化表达发现,与BCR/ABL组比较,采用Imatinib抑制BCR/ABL激酶活性后,BCR/ABL及下游信号分子AKT、ERK磷酸化水平均显著下调。同样,当FABD结构域缺失后,BCR/ABL蛋白下游的p-AKT、p-ERK表达均显著减少。由此表明,FABD结构域缺失后可能通过下调AKT、ERK的磷酸化表达水平来抑制BCR/ABL癌蛋白促增殖能力。另一方面,实验中FCM检测及DAPI染色结果显示,FABD结构域缺失可明显诱导细胞核发生染色质聚集固缩,核碎裂等凋亡变化,并显著促进细胞凋亡,削弱BCR/ABL癌蛋白体外抗凋亡能力。那么,FABD结构域缺失引起该效应的相关机制是什么呢?进而,我们检测了与凋亡相关的蛋白表达,结果发现,在FABD结构域缺失后,凋亡相关蛋白PARP和Caspase3发生明显活化,Caspase3活化条带表达明显,促凋亡蛋白Bax表达显著增加。因此,FABD结构域缺失显著削弱BCR/ABL癌蛋白体外抗凋亡能力,可能与线粒体凋亡途径有关,但其具体的分子生物学机制仍有待后续实验进一步阐明。

综上所述,本研究证实FABD结构域缺失可显著削弱BCR/ABL癌蛋白体外促增殖抗凋亡能力。一方面,FABD结构域缺失后可能通过下调AKT和ERK蛋白磷酸化水平,抑制PI3K-AKT及RAS-ERK信号通路而抑制BCR/ABL癌蛋白体外促增殖能力;另一方面,FABD结构域缺失显著削弱BCR/ABL癌蛋白体外抗凋亡能力,可能与线粒体凋亡途径有关。因此,本研究结果提示FABD结构域对BCR/ABL癌蛋白功能有重要作用,为进一步深入完善FABD结构域的功能及对BCR/ABL癌蛋白致病机制的影响奠定了实验基础,为寻找CML治疗新的有效靶点提供了一定的理论依据。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201802024
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周芳竹, 黄峥兰, 骆贞红, 王腾, 冯文莉.
ZHOU Fangzhu, HUANG Zhenglan, LUO Zhenhong, WANG Teng, FENG Wenli.
FABD结构域缺失削弱293T细胞BCR/ABL癌蛋白抗凋亡能力
Depletion of F-actin binding domain reduces the ability of BCR/ABL to resist apoptosis in 293T cells
第三军医大学学报, 2018, 40(17): 1548-1553
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(17): 1548-1553
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201802024

文章历史

收稿: 2018-02-04
修回: 2018-06-03

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