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超声造影动态评价兔类风湿关节炎模型炎症活动性的价值
吴长洁1, 王亚辉1, 华兴1, 郭燕丽1, 滕永亮2, 刘雪婷3     
1. 400038 重庆, 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院超声科;
2. 130000 长春, 吉林大学第一附属医院病理科;
3. 116000 大连, 沈阳军区大连疗养院
[摘要] 目的 探讨超声造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)动态检测兔类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)模型炎症活动度的价值。方法 6月龄兔24只, 雌雄不拘, 体质量3~3.5 kg, 以卵蛋白法建立膝关节RA模型, 共48例, 按建模时间分为建模前(对照组)、诱导1周(M1组)、诱导4周(M4组)和诱导8周(M8组), 每组12例。对双膝股胫关节行高分辨二维超声与能量多普勒超声成像(power Doppler imaging, PDI), 测量滑膜厚度, 对PDI血流信号进行视觉半定量评分(0~3分)。随后行CEUS检查, 观察滑膜增强情况, 仪器自动拟合时间强度曲线(time-intensity curve, TIC), 测量峰值强度(peak intensity, PI)、达峰时间(peak time, PT)、曲线下面积(area under curve, AUC)、峰值强度减半时间(T1/2)等数值。采集滑膜标本计算滑膜血管面积指数, 比较组间各项指标的差异, 并对超声指标与滑膜病理指标进行相关性分析。结果 随着建模时间增长, 超声测得兔股胫关节滑膜厚度逐渐增加, 组间差异有统计学意义(P < 0.01), M4组和M8组PDI评分差异有统计学意义(P < 0.05)。滑膜厚度与滑膜炎病理评分呈正相关(r=0.887, P < 0.01)。M4组与M8组中, CEUS阳性比例高于PDI(8/12 vs 3/12;12/12 vs 10/12)。TIC参数中, 滑膜PI值和AUC值均显著低于周边组织(P < 0.01);PI值、AUC值及PDI评分与滑膜血管面积指数呈正相关(r1=0.664, P < 0.01;r2=0.711, P < 0.01;r3=0.483, P < 0.05)。结论 灰阶超声检测滑膜厚度能反映滑膜炎病理改变的程度, CEUS较PDI能更敏感地反映滑膜炎新生血管的形成, 能早期动态检测RA滑膜炎的活动性。
[关键词] 类风湿关节炎     超声造影     炎症活动性     超声检查    
Dynamic evaluation of inflammation activity in rheumatoid arthritis rabbits using contrast-enhanced ultrasound
WU Changjie1 , WANG Yahui1 , HUA Xing1 , GUO Yanli1 , TENG Yongliang2 , LIU Xueting3     
1. Department of Ultrasonography, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038;
2. Department of Pathology, First Affiliated Hospital, Jilin University, Changchun, Jilin Province, 130000;
3. Dalian Sanatorium of Shenyang Military Command, Dalian, Liaoning Province, 116000, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81471677)
Corresponding author: HUA Xing, Tel:86-23-68765439, E-mail:huaxing_ultra@163.com
[Abstract] Objective To evaluate the value of contrast-enhanced ultrasound (CEUS) in the dynamic detection of inflammation activity in rabbit model of rheumatoid arthritis (RA). Methods A total of 24 rabbits (both sexes, 6 months old, weighing 3.0~3.5 kg) were used to establish RA model via ovalbumin sensitization in 48 knee joints. The rabbits were divided into 4 groups, that is, control (pre-modeling), M1 (1 week post induction), M4 (4 weeks post induction) and M8 (8 weeks post induction) groups, with 12 knees in each group. Ultrasound examination including grey scale ultrasonography and power Doppler imaging (PDI) was performed in both femorotibial joints of each rabbit to measure the synovial thickness and semi-quantitatively score (0~3). CEUS was subsequently performed to evaluate the enhancement of synovium. Time-intensity curve (TIC) was drawn with automatic fitting, and the data including peak intensity (PI), peak time (PT), area under curve (AUC) and half time of descending (T1/2) were determined automatically. All the rats were killed, and the synovial tissues were collected for pathological examination. The synovial vascular bed area index was calculated in each group, and the results were compared. The correlations between ultrasonic data and pathologic data were analyzed. Results Ultrasonographic results showed that the thickness of femorotibial synovium was increased with modeling time, with significant differences among groups (P < 0.01). There was a significant difference in PDI score between the M4 and M8 groups (P < 0.05). A positive correlation was found between synovial thickness and pathologic score (r=0.887, P < 0.01). Positive rate of CEUS was higher than that of PDI in both the M4 and M8 groups (8/12 vs 3/12, 12/12 vs 10/12). Among the TIC data, the values of PI and AUC in the synovial tissues were lower than those of surrounding fat tissues (P < 0.01). There were positive correlations of the PI value, AUC value and PDI score of the synovial tissue with synovial vascular bed area index (r1=0.664, P < 0.01; r2=0.711, P < 0.01; r3=0.483, P < 0.05). Conclusion Grey scale ultrasonography can reflect the pathological changes of synovitis. CEUS is more sensitive than PDI in reflecting the formation of early angiogenesis in the synovium, and is valuable in the early dynamic detection of inflammation activity in RA.
[Key words] rheumatoid arthritis     contrast-enhanced ultrasound     inflammation activity     ultrasound examination    

类风湿关节炎(rheumatoid arthritis, RA)是以对称性多关节炎为主要临床表现的异质性、系统性的自身免疫性疾病, 其主要病理改变是侵蚀性滑膜炎、滑膜增生及血管翳形成, 进行性侵蚀软骨, 最终导致关节软骨和软骨下骨的不可逆性破坏, 造成关节的畸形与残疾, 严重降低患者的生活质量。滑膜血管翳的形成是RA软骨破坏的直接原因, 也是临床采取积极治疗的重要标志。尽早对其检出并处理, 有助于改善RA患者的预后[1]。肌骨超声已逐渐用于RA的临床诊断和评估[2], 特别是能量多普勒成像(power Doppler imaging, PDI), 已成为检测滑膜炎活动性较为敏感的技术方法[3]。但由于PDI对低速血流和微循环检测的能力限制, 并受仪器血流敏感性等条件影响大, 使得该技术难以更早期的检出血管翳形成。超声造影(contrast-enhanced ultrasound, CEUS)采用比红细胞体积更小的微泡作为造影剂, 能够较真实地反映组织微循环灌注。近年来, 虽有研究将CEUS应用于RA滑膜炎活动性的评价, 但系统性研究较少。本研究通过建立兔膝关节RA模型, 观察RA的CEUS表现与滑膜病理变化的关系, 探讨CEUS动态评价RA炎症活动度和滑膜病理改变的可能性。

1 材料与方法 1.1 材料

6月龄日本大耳白兔24只, 雌雄不拘, 体质量3~3.5 kg, 由第三军医大学实验动物中心提供。鸡卵清蛋白(A5503)、完全弗氏佐剂(F5881), 均采购自Sigma公司。造影剂采用陆军军医大学第二附属医院超声科自主研发的"脂氟显"造影剂[4]。实验仪器采用飞依诺公司的VINNO 70型超声诊断仪, 自带线阵探头(频率12 MHz)。

1.2 实验方法

1.2.1 兔关节炎模型的制作

采用DUMONDE和GLYNN创立的卵蛋白(ovalbumin, OVA)诱导的关节炎模型[5], 将OVA与弗氏佐剂配置成20 mg/mL浓度的混合液并充分乳化, 于模型组兔肩胛间区分5个部位皮下注射上述乳化液, 每只1 mL, 每周1次, 连续3周, 末次诱导注射后1周于兔双侧膝关节腔内注射10 mg/mL OVA溶液0.5 mL。48个关节按建模时间分为建模前(对照组)、诱导1周(M1组)、诱导4周(M4组)和诱导8周(M8组), 每组12例。4组动物年龄和体质量差异无统计学意义(F1=0.190, P>0.05;F2=0.123, P>0.05, 表 1)。

表 1 兔股胫关节滑膜炎灰阶超声表现和病理评分(n=12, x ±s)
组别 滑膜厚度(mm) PDI评分(分) 病理评分(分)
对照组 1.01±0.16 0 0
M1组 2.21±0.33 0 1.17±0.39
M4组 3.17±0.28 0.33±0.65 1.92±0.51
M8组 4.21±0.66 1.58±1.00a 2.75±0.45
F 139.36 - 105.35
P < 0.01 - < 0.01
a:P < 0.01, 与M4组比较

1.2.2 超声检查 1.2.2.1 常规超声检查

按2 mg/kg耳缘静脉注射2%戊巴比妥钠对实验兔进行麻醉。实验兔以平卧位固定于操作台, 膝关节采取自然半屈曲位, 剔除双膝毛发。于双侧膝关节前侧进行超声检查, 探头与膝关节长轴平行, 于髌骨下方显示股胫关节正中纵切面, 观察股胫关节内滑膜, 测量滑膜最大厚度。随后切换至PDI模式, 观察滑膜内血流信号分布。并按照SZKUDLAREK等[6]评分标准血流声像图表现进行半定量分级。分级标准:0级, 滑膜内无血流信号; 1级, 增生的滑膜内见点状彩色血流信号; 2级, 增生的滑膜内见条状彩色血流信号, 充盈面积不到滑膜面积的50%;3级, 增生的滑膜内见条状丰富彩色血流信号, 充盈面积为滑膜面积50%以上。

1.2.2.2 超声造影检查

常规超声检查后将探头固定于股胫关节正中纵切面, 超声诊断仪切换至CBI增益模式, 耳缘静脉快速推注造影剂0.1 mL, 生理盐水冲管同时连续录制120 s造影图像。4 h后, 对对侧膝关节进行CEUS。采用机器自带软件分析滑膜区及邻近脂肪组织图像, 获取时间强度曲线(time-intensity curve, TIC)、自动测量峰值强度(peak intensity, PI)、达峰时间(peak time, PT)、曲线下面积(area under curve, AUC)、峰值强度减半时间(T1/2)数值。

1.3 病理检查

造影实验结束后, 用耳缘静脉空气栓塞法处死动物。双膝消毒, 迅速切开双侧膝关节囊, 肉眼观察关节囊、滑膜、关节软骨、关节积液一般表现, 留取滑膜标本。标本以常规方法制备、HE染色。镜下观察滑膜增生、周围组织炎性细胞浸润等情况, 并根据提出的滑膜炎病理评分标准进行评分[7]。0分:无滑膜炎症; 1分:轻度滑膜炎症、炎性细胞轻度浸润; 2分:中度滑膜炎症、炎性细胞中度浸润; 3分:重度滑膜炎症、炎性细胞重度浸润。观察滑膜组织内新生血管的形成情况, 每个关节任意选取5个视野, 测量并计算血管管腔面积/视野面积比值, 计算平均值, 即获得滑膜血管面积指数。

1.4 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件, 计量资料以x ±s表示, 组间超声参数(滑膜厚度、PDI评分、TIC参数)比较采用t检验, 滑膜厚度与病理评分相关性、TIC指标与滑膜血管面积指数相关性采用双变量相关分析。

2 结果 2.1 兔关节炎模型的建立

所有动物存活。诱导1周后实验兔出现膝关节部肿胀、跛行等表现, 并逐渐加重, 提示关节炎模型构建成功。病理检查结果显示:对照组中滑膜炎病理评分均为0分; M1组中10个关节评为1分, 2个关节评为2分; M4组中2个关节评为1分, 9个关节评为2分, 1个关节评为3分; M8组中3个关节评为2分, 9个关节评为3分。不同评分滑膜炎病理表现见图 1。股胫关节滑膜炎病理评分值随着建模时间增长而逐渐显著增加, 组间比较差异有统计学意义(F=105.35, P < 0.01, 表 1)。

A:0分, 无滑膜炎症; B:1分, 轻度滑膜炎症, 炎性细胞轻度浸润; C:2分, 中度滑膜炎症, 炎性细胞中度浸润、新生血管形成; D:3分, 重度滑膜炎症, 炎性细胞重度浸润, 大量新生血管形成 图 1 卵蛋白致敏兔股胫关节滑膜炎的病理表现(HE ×400)

2.2 二维超声检测

正常对照组股胫关节部未见明显滑膜或仅见薄条状低回声滑膜组织(图 2A); 诱导后股胫关节滑膜肿胀, 呈条状低回声, 并随诱导时间增加进一步增厚(图 2B~D)。滑膜厚度如表 1所示, 组间比较具有显著差异(F=139.36, P < 0.01)。PDI显示:对照组与M1组滑膜内未见明显PDI信号, M4组中有3个关节出现血流信号(25%), M8组中有10例出现血流信号(83.33%, 图 3); 对照、M1、M4、M8组的PDI评分分别为0、0、25、83.33分, M4组与M8组间比较差异有统计学意义(t=-3.638, P < 0.05)。

A:对照组↑:示低回声滑膜结构; B:M1组↑:示轻度增厚滑膜; C:M4组↑:示增厚滑膜; D:M8组↑:示显著增厚滑膜 图 2 兔股胫关节滑膜炎灰阶声像图

红色区域代表PDI血流信号
A:0级, 滑膜内无血流信号; B:1级, 滑膜少量状血流信号; C:2级, 滑膜内中等量血流信号; D:滑膜内大量血流信号
图 3 兔股胫关节滑膜炎PDI声像图

2.3 超声造影

正常对照组和M1组股胫关节滑膜区未见明显增强。M4组中可见8例出现滑膜增强(66.67% vs 25.00%), 而M8组中12例全部出现滑膜增强(100% vs 83.33%)(图 4), 均高于PDI显示比例。而且出现PDI信号的滑膜CEUS均有增强。TIC参数分析如表 2所示, 未增强滑膜TIC呈直线(图 5A白色曲线), 而增强滑膜TIC(图 5B白色曲线)与周边脂肪组织TIC(图 5B黄色曲线)波形相似且变化同步。组间t检验比较, M8组滑膜PI值及AUC值均较M4组高(t1=-7.924, P < 0.01;t2=-7.318, P < 0.01)。M4和M8组内, 滑膜内PI值和AUC值低于周边脂肪组织(M4组:t1=12.477, P < 0.01, t2=15.981, P < 0.01;M8组:t1=8.084, P < 0.01, t2=9.840, P < 0.01)。

表 2 不同组滑膜与周边脂肪组织时间强度曲线参数比较(n=12, x ±s)
组别 PI PT/s AUC T1/2/s
滑膜 周边脂肪 滑膜 周边脂肪 滑膜 周边脂肪 滑膜 周边脂肪
对照组 0 60.84±2.79 0 6.50±0.67 0 5 777.68±124.27 0 118.75±3.49
M1组 0 60.91±3.72 0 0.67±0.78 0 5 759.07±107.62 0 119.67±2.57
M4组 46.04±2.17 59.95±3.20b 6.67±0.65 6.75±0.62 5 041.89±132.02 5 798.04±97.13b 119.67±0.89 119.33±0.65
M8组 52.75±1.98a 60.68±2.76b 6.67±0.89 6.75±0.97 5 374.12±85.46a 5 785.41±116.87b 119.25±0.97 119.33±1.07
a:P < 0.01, 与同参数M4比较; b:P < 0.01, 与同组内滑膜比较

A:滑膜未增强表现↑:示滑膜部位; B:滑膜组织增强表现↑:示滑膜边缘见明显中强回声增强 图 4 兔股胫关节CEUS图像

A:滑膜组织未增强TIC; B:滑膜组织增强TIC 图 5 造影后仪器自动拟合时间强度曲线

2.4 相关性分析

股胫关节滑膜厚度与滑膜炎病理评分呈正相关(r=0.887, P < 0.01)。对照、M1、M4、M8组滑膜血管面积指数分别为0、0、0.075 6±0.059 7、0.192 0±0.060 1。CEUS参数PI值和AUC值与滑膜血管面积指数呈强正相关(r1=0.664, P < 0.01;r2=0.711, P < 0.01), PDI指数与滑膜血管面积指数呈中度正相关(r=0.483, P < 0.05), 而PT值、T1/2值与膜血管面积指数则无明显相关性(P>0.05)。

3 讨论

RA滑膜病理改变可分为炎症期、血管翳形成期和组织纤维化期[8]。血管翳是RA病变过程中的一个特征性病理产物, 出现在绝大多数RA患者病变关节腔内, 主要由新生微血管、增生肥大的滑膜细胞、炎性细胞及机化的纤维素构成, 是引起关节病变、软骨破坏的主要原因及病理基础。新生血管形成被认为是形成和维持RA血管翳的一个重要因素[9]。在RA的发病过程中, 新生血管形成出现较早, 甚至在炎症特异的临床征象和组织学征象出现以前就已存在。抑制血管生成的药物被证实可有效缓解RA的病情。因此, 新生血管形成是血管翳形成的主要病理基础, 也是代表滑膜炎症活动性的重要特征[10-11]。血管翳乃至新生血管是目前RA治疗的重要靶点, 其早期检测对控制RA病程、改善患者预后具有重要的临床意义[12]

本研究采用兔卵蛋白关节炎模型, 能模拟RA新生血管形成的病理改变。采用高频二维超声检查结果显示缓解滑膜随建模时间逐渐增厚, 与滑膜炎病理评分具有较好的相关性, 证明超声表现能动态反映滑膜炎病理改变, 与以往研究结果相一致[13]。但滑膜炎二维超声表现并不能判断新生血管的形成, 反映滑膜炎的活动性。PDI对血管翳新生血管的检测能力已得到大量研究的证实, 是目前临床用于判断RA活动性和评价治疗效果的重要手段。本研究结果显示, 随着建模时间的增长和滑膜内新生血管的增多, PDI检测阳性的病例也随之增多, 且半定量评分也随之升高, 与滑膜血管面积指数具有一定的相关性, 再次证实了PDI对新生血管的动态检测能力。然而, M4组中, 即在病例证实新生血管形成的早中期, PDI显示比例却较低, 提示PDI对新生血管新生血管形成早期的检测敏感性有限。该现象应该与PDI不能显示微循环和低速血流的自身先天缺陷有关[14]。这也许是临床上治疗后PDI呈阴性的RA患者, 依然有一部分会出现短期内复燃的原因之一。

CEUS采用微米级微泡作为对比造影剂, 可通过观察组织脏器或病变比较真实的血流灌注来揭示组织脏器微循环的情况, 受仪器条件影响较小。目前CEUS已广泛应用于临床各个领域, 包括微循环灌注、肿瘤化疗及消融的监测[15]。国内外目前关于CEUS应用于RA的诊断及疗效评估的研究不多, 对滑膜炎活动性动态评价的研究则更少。本研究结果显示, 在滑膜新生血管形成的M4组和M8组, CEUS阳性比例较高, 而且代表血流灌注量的TIC参数PI与AUC值与代表新生血管数量的滑膜血管面积指数具有较高的相关性。该结果证明CEUS对滑膜新生血管以及滑膜炎活动性的检测能力明显优于PDI, 能动态反映滑膜炎新生血管形成的病程变化。造影剂微泡的大小与红细胞相仿, 不会穿透血管壁逸散到血管外组织内, 能真正达到"血池内显像的目的"。该机制赋予CEUS准确评价组织微循环灌注的能力, 也使CEUS评价滑膜内新生血管水平成为可能。

总之, 灰阶超声能动态反映RA滑膜炎病理改变, 但不能反映其血管翳的形成。PDI具有反映RA滑膜内新生血管生成的能力, 但对早期病变的显示能力有限。CEUS能较敏感地反映滑膜内新生血管的形成, 能动态反映RA发展过程中滑膜炎活动性的变化, 具有较好的临床应用潜力。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201801218
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吴长洁, 王亚辉, 华兴, 郭燕丽, 滕永亮, 刘雪婷.
WU Changjie, WANG Yahui, HUA Xing, GUO Yanli, TENG Yongliang, LIU Xueting.
超声造影动态评价兔类风湿关节炎模型炎症活动性的价值
Dynamic evaluation of inflammation activity in rheumatoid arthritis rabbits using contrast-enhanced ultrasound
第三军医大学学报, 2018, 40(11): 984-990
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(11): 984-990
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201801218

文章历史

收稿: 2018-01-26
修回: 2018-03-14

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