神经母细胞瘤(neuroblastoma，NB)是儿童最常见的颅外实体瘤，在儿童肿瘤中的发病率为6%～10%，占儿童癌症死亡人数的10%～15%[1]。了解NB的发病机制对研究NB的诊断方法和靶向治疗具有重大意义。NB患儿中有25%～33%存在MYCN扩增，MYCN的过度表达与NB的发生发展密切相关，是NB预后不良与恶性进展的标志[2-3]，但是促发MYCN扩增的分子机制尚未完全阐明。研究发现微小RNA-221(microRNA-221，miR-221)是一个癌基因，在多种恶性肿瘤中表达上调[4]。我们课题组前期的研究中发现，miR-221在MYCN扩增的NB中表达上调[5]。本研究将通过构建裸鼠移植瘤模型，观察SH-SY5Y细胞中miR-221基因过表达后对裸鼠移植瘤生长情况的影响，以及对MYCN的调控作用，从而进一步探讨miR-221在神经母细胞瘤发生发展中的作用。
1 材料与方法 1.1 细胞系SH-SY5Y细胞为人神经母细胞瘤细胞株，购于美国菌种保存中心(ATCC)；SH-SY5Y细胞稳定转染miR-221和对照质粒载体的细胞系：miR-221-up细胞与miRNA-NC细胞均由我课题组建立并保存[5]。
1.2 主要试剂RNAiso Reagent、PrimeScript RT-PCR试剂盒、SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ均购自TaKaRa公司，All-in-OneTM miRNA qPCR检测试剂盒及相关引物由美国GeneCopoeia公司提供。鼠抗人MYCN抗体购自Millipore公司，兔抗人β-actin多抗购自中杉金桥公司；HRP标记的羊抗兔IgG、兔SP检测试剂盒及DAB购自北京中杉金桥生物技术有限公司；化学发光检测试剂盒购自南京凯基生物科技发展有限公司；蛋白裂解液及BCA蛋白定量试剂盒购自碧云天生物技术公司；PVDF膜(0.22 μm)购自Millipore公司；其他试剂均为国产分析纯试剂。
1.3 实验动物BALB/c纯系雌性清洁级小鼠，4～6周龄，体质量(14±3)g，购于北京实验动物研究中心。
1.4 裸鼠移植瘤模型的建立取对数期生长的SH-SY5Y、miRNA-NC、miR-221-up细胞，PBS离心洗涤2次后计数，调整细胞密度为2×107/mL。将18只裸鼠按照随机区组法分成3组，每组6只，分别将上述细胞悬液接种至裸鼠背部皮下，每只0.2 mL，无菌操作。观察各组细胞在裸鼠体内的生长速度及肿瘤大小，30 d后颈椎脱臼处死裸鼠，取瘤称重，用游标卡尺测量肿瘤的最长径(a)和最短径(b)，按公式V=ab2/2求出肿瘤的体积。切取部分组织置于1.5 mL去酶EP管中，液氮中冻存，用于qRT-PCR、Western blot分析；剩余瘤组织用10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，用于免疫组化分析。
1.5 qRT-PCR检测miR-221的表达水平取移植瘤组织0.5 cm3，用RNAiso Reagent试剂抽提总RNA后，用All-in-OneTM miRNA qPCR检测试剂盒逆转录成cDNA，反应体系：Total RNA 2.0 μg，Poly A Polymerase 1.0 μL，RTase Mix 1.0 μL，5×Reaction Buffer 5.0 μL，加ddH2O补齐到25.0 μL，反应条件：37 ℃ 60 min，85 ℃ 5 min，4 ℃备用。随后进行qRT-PCR反应，miR-221的引物为HmiRQP0038，反应体系：(2×All-in-One)qPCR Mix 10.0 μL，miProfile miRNA qPCR Primer 2.0 μL，Universal Adaptor PCR Primer 2.0 μL，1st strand cDNA 2.0 μL，ddH2O 4.0 μL，总体系20.0 μL。反应条件：95 ℃ 10 min；95 ℃ 10 s，60 ℃ 20 s，72 ℃ 10 s，40个循环。每循环结束测荧光值。所有反应均设立3个复孔，并以DEPC水代替模板cDNA作为阴性对照，U6为内参照，引物为HmiRQP9002。对得到的结果通过比较CT值(2-△△CT)进行相对定量分析。
1.6 qRT-PCR检测MYCN mRNA的表达水平用RNAiso Reagent提取组织总RNA后，使用TaKaRa基因组逆转录试剂盒进行逆转录。逆转录分两步进行，第1步去除样本中DNA，反应体系为：5×gDNA Eraser Buffer 2.0 μL，gDNA Eraser 1.0 μL，Total RNA 1.0 μg，最后加RNase Free ddH2O补齐到10 μL；反应条件：42 ℃ 2 min，4 ℃备用。第2步逆转录，反应体系为：第1步反应液10 μL，PrimeScriptRT Enzyme Mix I 1.0 μL，RT Primer Mix 1.0 μL，5×PrimeScript Buffer 2(for Real Time) 4.0 μL，RNase Free ddH2O 4.0 μL，总体积20.0 μL；反应条件：37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，4 ℃备用。随后进行qRT-PCR反应，体系为：SYBR Ⅱ 12.5 μL，ddH2O 10.5 μL，cDNA 1.0 μL，Primer F 0.5 μL，Primer R 0.5 mL，总体积25.0 μL。反应条件：95 ℃ 5 min；95 ℃ 20 s，56 ℃ 20 s，72 ℃ 30 s，35个循环，每循环结束测荧光值。所有反应均设立3个复孔，并以DEPC水代替模板cDNA作为阴性对照，以GAPDH为内参照。对得到的结果通过比较CT值(2-△△CT)进行相对定量分析。MYCN上游引物5′-GGCAGTAGGACCACCAGTGT-3′，下游引物5′-CTAATACTGGCCGCAAAAGC-3′；GAPDH上游引物5′-CA-GCGACACCCACTCCTCCACCTT-3′，下游引物5′-CATAGGTCCACCACCCTGTTGCT-3′。
1.7 Western blot检测瘤组织中MYCN蛋白的表达取部分组织块剪碎放置于匀浆器中，加入适量预冷的RIPA裂解液(按100: 1比例蛋白酶抑制剂；10: 1比例加入磷酸酶抑制剂)于冰上进行匀浆，待无明显组织块，低频超声15 min后，4 ℃ 14 000 r/min离心30 min，取上清。BCA法测蛋白浓度。取20 μg蛋白上样，经10% SDS-PAGE凝胶电泳后转膜，室温封闭1 h后，配置一抗MYCN(1: 40)和β-actin(1: 800)，4 ℃孵育过夜；次日TBST洗膜3次，每次10 min，然后摇床上室温孵二抗(1: 5 000)l h。再用TBST洗涤3次，每次10 min，用增强化学发光系统(ECL)检测膜上信号，由Bio-Rad凝胶成像仪摄取凝胶图像，用Quantity One测定其面积及灰密度值，重复3次。
1.8 免疫组织化学法检测瘤组织中MYCN蛋白的表达肿瘤组织经10%甲醛溶液固定，石蜡包埋，4 μm厚度连续切片，经脱蜡和水化后，微波修复组织抗原，用3% H2O2 对内源性过氧化物酶灭活；10%山羊血清室温封闭30 min，滴加鼠抗人MYCN(1: 40)抗体，用0.01 mol/L PBS代替一抗作阴性对照，置于湿盒中，4 ℃孵育过夜。第2天37 ℃复温45 min，PBS洗3次，每次5 min。滴加辣根过氧化物酶标记二抗孵育室温孵育1 h。PBS洗3次，每次5 min。DAB显色10 min，苏木精复染，脱水封片，显微镜下观察并拍照，用Image Pro Plus软件每张切片随机选择5个不同视野，对阳性信号的灰度值进行半定量分析。
1.9 统计学处理采用SPSS 17. 0统计软件，数据以 x±s表示，多组数据的比较采用方差分析，免疫组化各计数资料的比较采用χ2检验或Fisher精确概率检验。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 miR-221对SH-SY5Y细胞裸鼠移植瘤生长的影响裸鼠在细胞接种后5 d左右开始成瘤，成瘤率为100%。30 d后颈椎脱臼处死，手术剥出瘤体，量取肿瘤体积并称重。对肿瘤分析发现，miR-221-up组肿瘤体积和质量较SH-SY5Y组均明显增加(P < 0.01)，而SH-SY5Y组与miRNA-NC组相比差异无统计学意义(P>0.05)。见表 1。
| 组别 | n | 瘤体质量/g | 瘤体体积/cm3 | 成瘤率/% |
| SH-SY5Y组 | 6 | 1.218±0.567 | 1.121±0.497 | 100 |
| miRNA-NC组 | 6 | 0.984±0.321 | 1.421±0.797 | 100 |
| miR-221-up组 | 6 | 2.043±0.930a | 3.764±1.387a | 100 |
| a: P < 0.01，与SH-SY5Y组比较 | ||||
2.2 qRT-PCR检测移植瘤中miR-221的表达
qRT-PCR结果显示，miR-221在SH-SY5Y中的表达为(1.030±0.181)，与SH-SY5Y组相比，miR-221-up组(6.500±0.681)中miR-221表达明显升高，约为SH-SY5Y组的6.5倍(P=0.001 3)，而miRNA-NC组(1.230±0.119)无统计学差异(P=0.421 2)。
2.3 qRT-PCR检测裸鼠移植瘤中MYCN表达qRT-PCR结果显示，miR-221-up组中MYCN的表达(6.080±0.656)约为SH-SY5Y组(1.000±0.136)的6倍(P=0.001 5)，而与SH-SY5Y组相比，miRNA-NC组(1.200±0.093)miR-221的表达无明显差异(P=0.278 7)。
2.4 Western blot检测移植瘤中MYCN蛋白表达Western blot分析显示，与SH-SY5Y组(0.980±0.126)相比，miR-221-up组(3.910±0.541)MYCN蛋白表达上调明显(P=0.006 2)，而miRNA-NC组(1.030±0.090)差异无统计学意义(P=0.734 1)(图 1)。免疫组化检测结果发现，MYCN蛋白在细胞质和细胞核均着色，在SH-SY5Y组和miRNA-NC组均呈弱阳性反应，在miR-221-up组呈强阳性反应(图 2)。用Image Pro Plus软件在3组移植瘤中分别随机选择5个不同视野进行半定量分析，结果发现与SH-SY5Y组(1.000±0.086)相比，miR-221-up组(1.750±0.075)MYCN蛋白的表达明显增多(P=0.002 9)；而miRNA-NC组(0.950±0.058)无明显变化(P=0.634 5)。
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| 1：SH-SY5Y组；2：miRNA-NC组；3：miR-221-up组 图 1 Western blot检测移植瘤中MYCN蛋白表达 |
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| A：SH-SY5Y组；B：miRNA-NC组；C：miR-221-up组 图 2 免疫组化检测移植瘤中MYCN蛋白表达(S-P ×200，左下角×400) |
3 讨论
MYCN癌基因扩增是NB中最重要也是最常见的分子遗传学改变，其定位于2p23-p24，产物为MYCN蛋白，有456个氨基酸残基。MYCN在正常细胞中的拷贝数为2，而在MYCN扩增的神经母细胞瘤中其拷贝数通常>10，大部分在50～100之间，其扩增是NB预后不良的标志。MYCN为核转录调节因子，其与特殊的DNA顺序结合后，可以影响DNA复制的启动过程，从而调节相关基因的转录，进而调节细胞增殖凋亡，细胞周期，DNA损伤[6]。如Wnt、Hedgehog和其他生长因子与MYCN的异常表达相关，进而影响NB的发生发展。MYCN还可以调控组蛋白甲基化和乙酰化及其他参与转录激活和抑制的相关基因的表达。因此MYCN在神经母细胞瘤的发生发展中起重要作用。
近年来研究发现，微小RNA(microRNA，miRNA)与基因表达调控密切相关。miRNA是一类长度约为20 bp的非编码RNA，通过与靶基因3′UTR特异性结合，对靶基因进行转录后调控，抑制靶基因的表达。miRNA异常表达调控在肿瘤的发生和发展中扮演着重要角色[7]，在一些研究中也报道过miRNA可以调控NB的发生发展[8-9]。SCHULTE等[10]通过基因芯片分析MYCN扩增和非扩增NB中的miRNA差异表达谱，发现很多miRNA的表达异常，如miR-92、miR-106a、let-7b、miR-17-5p、miR-93、miR-99、miR-221等，在MYCN高表达的NB组织中表达上调。其中高表达的miR-221由于在许多肿瘤中被报道而成为我们的研究对象。
miR-221是一个癌基因，在多种恶性肿瘤中表达上调，miR-221及其调控基因已成为癌症治疗的新靶点。例如，miR-221通常在前列腺癌细胞中过度表达，miR-221可以调节STAT1/STAT3介导的JAK/STAT信号通路的活化来调节前列腺癌细胞的生长、侵袭和凋亡，因而可以作为诊断前列腺癌的生物标志物[11]。在乳腺癌中，miR-221可以通过靶向PTEN/Akt途径促进乳腺癌细胞的生长、迁移和侵袭，同时促进乳腺干细胞的自我更新，因而可以作为一种新的乳腺癌治疗的靶点[12]。这些研究证明miR-221可以促进肿瘤发展，值得关注的是，在我们课题组前期的研究中也发现miR-221可以上调神经母细胞瘤中MYCN的表达并且可以通过减少G1～S期阻滞促进细胞增殖[5]。
为进一步证实miR-221在神经母细胞瘤中的作用，我们以神经母细胞瘤细胞SH-SY5Y(在此细胞中MYCN和miR-221表达极低)为实验对象，观察上调miR-221对肿瘤的生长和MYCN表达的影响。结果发现miR-221过表达组的肿瘤体积较大，质量较大，说明高表达miR-221可以促进肿瘤的生长，同时用qRT-PCR、Western blot、免疫组化检测肿瘤中MYCN的表达情况，结果发现相比SH-SY5Y细胞注射组，miR-221过表达组中MYCN的mRNA和蛋白的表达水平均增高，这说明miR-221可以上调MYCN基因的表达。鉴于miRNA对靶基因表达是一种负性调控，且通过生物信息学分析在MYCN的3′UTR区未发现miR-221的结合位点，因此我们认为miR-221很可能通过调控某一个靶基因进而调控MYCN的表达，这一推断我们将在后续的实验中进行证实。
以上结果表明上调miR-221可以促进肿瘤的生长，而miR-221的这种作用可能是通过上调MYCN基因的表达实现的。因此miR-221可能为NB的诊断和治疗提供新的思路。
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