2. 400016 重庆,重庆医科大学第一附属医院骨科
2. Department of Orthopedics, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
骨肉瘤(osteosarcoma,OS)是儿童和青少年最常见的骨原发性恶性肿瘤,高发的肺转移率导致患者预后差[1]。尽管手术和化疗明显改善患者预后,但由于肿瘤对化疗药物产生抵抗而常常导致复发和转移,患者5年生存率没有得到明显提高[2]。骨肉瘤作为血管极其丰富的恶性实体肿瘤,其生长、侵袭和转移离不开血管生成。近年来研究发现抗血管生成药物可以修复结构和功能异常的肿瘤血管,改善肿瘤微环境,增加运输到肿瘤组织的药物和氧量,提高化疗药物的疗效[3]。因此,研发抗血管生成的潜在调控靶点为骨肉瘤患者的治疗带来新希望。印记基因TSSC3(tumor-suppressing STF cDNA3)又名PHLDA2(pleckstrin-homology-like domain family A member 2),位于11号染色体短臂第1区第5带,呈母系等位基因表达,与肿瘤细胞凋亡密切相关。本课题组前期研究发现,TSSC3在骨肉瘤中通过抑制细胞增殖、侵袭、干细胞自我更新和促进凋亡发挥抑癌基因作用[4-7]。目前TSSC3对骨肉瘤血管生成的影响及可能机制尚不清楚。本研究拟通过体内外实验观察过表达TSSC3对人骨肉瘤血管生成的影响,以期为骨肉瘤的抗血管生成治疗提供新的方向。
1 材料与方法 1.1 主要实验材料和试剂6、96孔细胞培养板(美国Corning公司),8 μm Transwell侵袭小室(美国Merk Millipore公司)。DMEM高糖培养基、0.25%胰蛋白酶和青/链霉素(美国HyClone公司),胎牛血清(Fetal bovine serum,FBS,以色列BI公司),RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒(日本TaKaRa公司),VEGFA抗体(美国Santa Cruz公司),GAPDH抗体(美国CST公司),CD34抗体和TSSC3抗体(美国Abcam公司),山羊抗兔和山羊抗鼠二抗(北京博奥龙免疫技术有限公司),对照组和overTSSC3慢病毒颗粒(上海英骏生物技术有限公司)[5],人VEGF ELISA试剂盒(深圳欣博盛生物科技有限公司),Matrigel基质胶(美国BD公司),RIPA蛋白裂解液和ECL发光液(美国Pierce公司),Western blot配胶试剂盒(上海碧云天生物技术公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人骨肉瘤细胞MTH是本实验室对人永生化成骨细胞hFOB1.19进行恶性转化,建立的高度恶性骨肉瘤样细胞系,HUVEC细胞由陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院烧伤研究所惠赠。细胞培养均用含有10% FBS和1%青/链霉素的DMEM高糖完全培养基,于37 ℃、5% CO2的培养箱中培养。
1.2.2 转染慢病毒建立稳定细胞系将生长状态良好的MTH细胞接种到6孔板,每孔约1×105个细胞,待细胞融合率在30%左右时,PBS漂洗细胞3次,更换新鲜无双抗培养基,按照细胞MOI值计算每孔加入病毒量。37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后换为新鲜完全培养基,48 h后荧光显微镜下观察转染效率,将细胞进行常规传代培养,通过流式细胞仪筛选出稳定高表达TSSC3细胞株。分为对照组和过表达组(overTSSC3)。
1.2.3 条件培养基(conditional medium,CM)制备将生长状态良好的对照组和overTSSC3组细胞用胰蛋白酶消化离心,新鲜完全培养基制备成单细胞悬液后进行细胞计数,于6孔板接种2×105个细胞,37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h,PBS冲刷细胞3次后,每孔加2 mL DMEM高糖培养继续基培养48 h,收集上清,高速离心去除杂质,将条件培养基保存于-20 ℃冰箱备用。
1.2.4 划痕实验在6孔板中接种适量HUVEC细胞,待细胞融合率约90%时,使用10 μL枪头沿直尺进行划痕,PBS轻柔洗去脱落的细胞。将条件培养基和完全培养基按1:1比例混合后,每孔加2 mL混合培养基,将对照组和overTSSC3组各取3个不同的位置于倒置显微镜100倍下拍照。37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h,相同位置再次于倒置显微镜下采图。
1.2.5 Transwell实验将条件培养基和完全培养基按1:1比例混合后,向24孔板每孔加500 μL混合培养基,放入8 μm Transwell小室,消化离心HUVEC细胞后,用无血清DMEM制备单细胞悬液,向小室内加入1×104个HUVEC细胞,每组设置3个复孔,37 ℃、5% CO2的培养箱中培养24 h后,Transwell小室依次经过PBS漂洗3次、4%多聚甲醛固定30 min、PBS漂洗3次、结晶紫染色15 min,自来水浸洗后倒置显微镜200倍下拍照计数。
1.2.6 小管形成实验实验前1 d将Matrigel基质胶、96孔板及枪头4 ℃冰箱过夜,用无血清DMEM按1:1比例稀释基质胶,向96孔板每孔加50 μL Matrigel基质胶,加胶过程中避免产生气泡,整个过程均在冰上操作,96孔板放入37 ℃培养箱中孵育30 min待基质胶凝固。将条件培养基和完全培养基按1:1混合后制备HUVEC细胞单细胞悬液,每孔加入100 μL混合培养基(含1×104个HUVEC细胞),设置3个复孔,于37 ℃、5% CO2培养箱中培养6 h后观察小管形成并于倒置显微镜100倍下拍照。用Image J软件对小管样结构计数。
1.2.7 RT-PCR检测用RNAiso Plus试剂提取细胞总RNA,按两步法将RNA反转录为cDNA,参照SYBR Premix Ex TaqTMⅡ试剂盒说明书配制反应体系,反应条件为95 ℃ 30 s,(95 ℃ 5 s,60 ℃ 50 s)×40个循环。引物序列由上海英骏生物技术有限公司提供,GAPDH上游:5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′,下游:5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′,片段大小为132 bp;TSSC3上游:5′-TCCAGCTATGGAAGAA-GAAGC-3′,下游:5′-GTGGTGACGATGGTGAAGTACA-3′,片段大小为163 bp;VEGFA上游:5′-CTTCGCTTACTCTCACCTGCTTCTG-3′,下游:5′-GCTGCTTCTTCCAACAATGTGTCTC-3′,片段大小为92 bp。
1.2.8 Western blot检测细胞刮收集细胞,RIPA裂解液冰上充分裂解细胞30 min,14 000×g离心10 min,4 ℃离心后收集总蛋白,采用BCA试剂盒测定蛋白浓度,加蛋白上样缓冲液充分混匀,金属浴100 ℃下持续蛋白变性10 min。以60 μg/孔蛋白上样量进行凝胶电泳,转PVDF膜90 min后,5%脱脂奶粉室温封闭1 h,一抗4 ℃冰箱孵育过夜,GAPDH、VEGFA及TSSC3抗体稀释浓度分别为1:1 000、1:500及1:1 000。PBST洗膜15 min×3次,将膜依次放入按照1:5 000稀释抗鼠和抗兔二抗中室温孵育1 h,PBST洗膜15 min×3次,将ECL发光液A液和B液等体积混合,现配现用,Bio-Rad凝胶成像仪曝光成像。
1.2.9 ELISA测定VEGFA分泌量将收集的各组骨肉瘤细胞上清按比例稀释后,采用血管内皮生长因子ELISA试剂盒检测对照组和overTSSC3组上清中VEGFA浓度,每组设置3个复孔,详细步骤参照ELISA试剂盒说明书。
1.2.10 裸鼠移植瘤模型建立将4周龄雌性裸鼠随机分成两组,每组6只。制备对照组和overTSSC3组单细胞悬液,75%酒精棉球消毒小鼠右侧腋下皮肤,1 mL注射器取200 μL细胞悬液(约5×106个细胞)皮下注射。每3天观察皮下肿瘤生长情况,3周后处死小鼠,将移植瘤完整剥离,福尔马林固定组织,用于后续免疫组织化学染色。
1.2.11 肿瘤组织免疫组织化学染色将移植瘤组织进行常规石蜡包埋及切片,石蜡切片依次经过脱蜡、抗原修复、阻断内源性过氧化物酶、山羊血清封闭、一抗孵育、PBST漂洗切片、二抗孵育、DAB显色液显色、苏木精复染、切片脱水后封片,VEGFA和CD34抗体稀释浓度分别为1:50和1:200。计数被CD34抗体着色的单个内皮细胞及内皮细胞组成的管腔数,即为MVD。
1.3 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件,计量资料数据以x±s表示,两组间均数比较采用独立样本t检验方法。P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 过表达TSSC3骨肉瘤细胞株的鉴定RT-PCR检测结果显示,与对照组细胞相比,overTSSC3组中TSSC3 mRAN水平显著升高(5.703±0.407 vs 1.006±0.136,P < 0.01),Western blot结果显示,overTSSC3组较对照组TSSC3蛋白水平也明显升高(1.267±0.255 vs 0.457±0.071,P < 0.01,图 1)。
2.2 过表达TSSC3对HUVEC细胞迁移影响
划痕实验结果(图 2A)显示,24 h后,overTSSC3组HUVEC细胞横向迁移距离显著低于对照组(0.763± 0.188 vs 1.709±0.070,P < 0.01);Transwell实验结果(图 2B)显示,overTSSC3组HUVEC细胞纵向迁移数量显著低于对照组(84.667±9.609 vs 180.000±13.453,P < 0.01)。说明骨肉瘤细胞过表达TSSC3后抑制了HUVEC细胞迁移能力。
2.3 过表达TSSC3对HUVEC小管形成影响
体外小管形成实验结果表明,overTSSC3组HUVEC细胞小管样结构形成数量显著低于对照组(8.000±1.000 vs 21.667±1.528,P < 0.01,图 3)。说明骨肉瘤细胞过表达TSSC3后抑制了HUVEC细胞小管形成能力。
2.4 过表达TSSC3对骨肉瘤细胞VEGFA表达和分泌的影响
overTSSC3组较对照组VEGFA mRNA水平显著降低(0.309±0.003 vs 1.003±0.096,P < 0.01),蛋白水平也明显下降(图 4);ELISA检测结果显示,overTSSC3组细胞上清中VEGFA的蛋白浓度较对照组显著降低[(617.98±96.89)pg/mL vs (124 2.22±186.64) pg/mL,P < 0.01]。说明过表达TSSC3抑制骨肉瘤细胞VEGFA合成及分泌。
2.5 过表达TSSC3对移植瘤组织中VEGFA和CD34的表达影响
免疫组化结果显示,overTSSC3组肿瘤中VEGFA蛋白表达强度明显低于对照组,且MVD数量也低于对照组(图 5)。体内实验说明过表达TSSC3抑制骨肉瘤细胞VEGFA合成进而影响血管生成。
3 讨论
肿瘤的生长和转移依赖血管生成[8],当肿瘤直径大于2 mm时,需要新生血管形成提供氧气和营养,否则肿瘤会发生坏死。肿瘤血管生成主要是内皮细胞经过活化、增殖、迁移、基底膜降解及管状血管结构的形成,从现有的血管上芽生出新血管。肿瘤血管生成不同于生理性血管生成,肿瘤新生血管存在排列紊乱、血管迂曲、周细胞连接松散或缺失、基底膜缺损等异常,脱落的肿瘤细胞易通过结构和功能不完整的血管进入血液,导致肿瘤发生转移[9]。促血管生成因子与抗血管生成因子异常表达是肿瘤血管生成的关键因素之一,其中血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor,VEGF)是公认的生理和病理性血管生成过程中作用最强的正性调控因子。
基因组印记作为一种表遗传学修饰,调控方式包括DNA甲基化、组蛋白修饰、lncRNA转录等,在胚胎生长和发育的过程中扮演关键作用[10]。印记基因缺失和表达上调将影响胎盘生长和胚胎发育,在成体组织中其异常表达与常见的遗传性疾病及肿瘤的发生和演进相关。目前发现与肿瘤相关的印记基因有IGF2、NOEY2、H19、DLK1、PEG10、WT1、M6P/IGF2R、TSSC3等[11]。印记基因TSSC3作为PHLDA家族新成员,在人类胎盘及胚胎组织中高表达,主要集中于细胞滋养层,起促进胚胎发育的作用。研究发现TSSC3表达升高抑制胎盘生长,影响胎儿宫内发育[12]。与健康成人脑组织和血液相比,TSSC3在胶质瘤中明显地被印记,通过抑制Fas介导的凋亡途径影响脑肿瘤的进展[13];WANG等[14]发现TSSC3高表达的骨肉瘤患者预后较好;然而HSU等[15]通过基因芯片技术及生物信息学分析,发现TSSC3在肺腺癌中高表达,与患者预后密切相关,提示不同肿瘤中TSSC3作用可能不一致。但TSSC3对肿瘤血管的作用及机制不清楚。本研究通过体外实验发现,骨肉瘤细胞过表达TSSC3显著抑制HUVEC迁移和小管形成能力。
VEGF家族在促血管生成中发挥重要作用,包括VEGFA、VEGFB、VEGFC、VEGFD、VEGFE和胎盘生长因子(placenta growth factor,PGF)[16]。目前公认VEGFA促血管生成因子中作用最强,与内皮细胞膜上受体VEGER-1和VEGFR-2选择性结合,激活下游信号通路促进肿瘤血管生成及肿瘤的转移。大量的研究表明VEGFA在骨肉瘤组织中高表达,并与肿瘤复发、转移及预后呈正相关[17-18];RASTOGI等[18]研究发现血清中VEGFA水平可以作为预测骨肉瘤患者疗效及预后的重要指标;ZHAO等[19]研究发现沉默VEGFA通过PI3K/AKT通路抑制骨肉瘤血管生成、细胞增殖及促进凋亡。本研究通过RT-PCR、Western blot及ELISA检测发现,过表达TSSC3后显著抑制骨肉瘤细胞VEGFA表达。为进一步验证本实验结果,建立裸鼠移植瘤模型,肿瘤组织免疫组化检测显示,过表达TSSC3组VEGFA蛋白表达量及MVD数量较对照组明显减少。结合体内外实验结果,我们认为印记基因TSSC3可能通过下调VEGFA表达抑制骨肉瘤血管生成,具体调控机制有待后续深入研究。
综上所述,本研究通过体内外实验发现,印记基因TSSC3在骨肉瘤中可能通过下调VEGFA表达抑制血管生成,这将为骨肉瘤治疗提供新的思路和途径。
[1] | ROGOZHIN D V, BULYCHEVA I V, KONOVALOV D M, et al. Classical osteosarcoma in children and adolescent[J]. Arkh Patol, 2015, 77(5): 68–74. DOI:10.17116/patol201577568-74 |
[2] | XIE L, JI T, GUO W. Anti-angiogenesis target therapy for advanced osteosarcoma[J]. Oncol Rep, 2017, 38(2): 625–636. DOI:10.3892/or.2017.5735 |
[3] | JAIN R K. Antiangiogenesis strategies revisited: from starving tumors to alleviating hypoxia[J]. Cancer Cell, 2014, 26(5): 605–622. DOI:10.1016/j.ccell.2014.10.006 |
[4] | DAI H, HUANG Y, LI Y, et al. TSSC3 overexpression associates with growth inhibition, apoptosis induction and enhances chemotherapeutic effects in human osteosarcoma[J]. Carcinogenesis, 2012, 33(1): 30–40. DOI:10.1093/carcin/bgr232 |
[5] | HUANG Y, DAI H, GUO Q N. TSSC3 overexpression reduces stemness and induces apoptosis of osteosarcoma tumor-initiating cells[J]. Apoptosis, 2012, 17(8): 749–761. DOI:10.1007/s10495-012-0734-1 |
[6] | YAN G N, TANG X F, ZHANG X C, et al. TSSC3 represses self-renewal of osteosarcoma stem cells and Nanog expression by inhibiting the Src/Akt pathway[J]. Oncotarget, 2017, 8(49): 85628–85641. DOI:10.18632/oncotarget.20429 |
[7] | LV Y F, DAI H, YAN G N, et al. Downregulation of tumor suppressing STF cDNA 3 promotes epithelial-mesenchymal transition and tumor metastasis of osteosarcoma by the Wnt/GSK-3β/β-catenin/Snail signaling pathway[J]. Cancer Lett, 2016, 373(2): 164–173. DOI:10.1016/j.canlet.2016.01.046 |
[8] | FOLKMAN J. Tumor angiogenesis: therapeutic implications[J]. N Engl J Med, 1971, 285(21): 1182–1186. DOI:10.1056/NEJM197111182852108 |
[9] |
张静, 张文超, 钱子君, 等. 血管正常化提高肿瘤治疗疗效[J].
中国癌症杂志, 2016, 26(2): 188–192.
ZHANG J, ZHANG W C, QIAN Z J, et al. Tumor vascular normalization improves cancer treatment efficacy[J]. China Oncology, 2016, 26(2): 188–192. DOI:10.3969/j.issn.1007-3969.2016.02.012 |
[10] | RIBARSKA T, GOERING W, DROOP J, et al. Deregulation of an imprinted gene network in prostate cancer[J]. Epigenetics, 2014, 9(5): 704–717. DOI:10.4161/epi.28006 |
[11] |
刘岩, 王芳. 印记基因调控肿瘤的研究进展[J].
医学研究生学报, 2016, 29(1): 87–91.
LIU Y, WANG F. Imprinted gene network regulation in tumor: Advances in researches[J]. J Med Postgraduates, 2016, 29(1): 87–91. DOI:10.16571/j.cnki.1008-8199.2016.01.018 |
[12] | APOSTOLIDOU S, ABU-AMERO S, O'DONOGHUE K, et al. Elevated placental expression of the imprinted PHLDA2 gene is associated with low birth weight[J]. J Mol Med, 2007, 85(4): 379–387. DOI:10.1007/s00109-006-0131-8 |
[13] | M LLER S, VAN DEN BOOM D, ZIRKEL D, et al. Retention of imprinting of the human apoptosis-related gene TSSC3 in human brain tumors[J]. Hum Mol Genet, 2000, 9(5): 757–763. DOI:10.1093/hmg/9.5.757 |
[14] | WANG X, HE H, ZHANG K, et al. The expression of TSSC3 and its prognostic value in patients with osteosarcoma[J]. Biomed Pharmacother, 2016, 79: 23–26. DOI:10.1016/j.biopha.2015.10.013 |
[15] | HSU Y L, HUNG J Y, LEE Y L, et al. Identification of novel gene expression signature in lung adenocarcinoma by using next-generation sequencing data and bioinformatics analysis[J]. Oncotarget, 2017, 8(62): 104831–104854. DOI:10.18632/oncotarget.21022 |
[16] | COMUNANZA V, BUSSOLINO F. Therapy for cancer: strategy of combining anti-angiogenic and target therapies[J]. Front Cell Dev Biol, 2017, 5: 101. DOI:10.3389/fcell.2017.00101 |
[17] | TABONE M D, BRUGI RES L, PIPERNO-NEUMANN S, et al. Prognostic impact of blood and urinary angiogenic factor levels at diagnosis and during treatment in patients with osteosarcoma: a prospective study[J]. BMC Cancer, 2017, 17(1): 419. DOI:10.1186/s12885-017-3409-z |
[18] | RASTOGI S, KUMAR R, SANKINEANI S R, et al. Role of vascular endothelial growth factor as a tumour marker in osteosarcoma: a prospective study[J]. Int Orthop, 2012, 36(11): 2315–2321. DOI:10.1007/s00264-012-1663-x |
[19] | ZHAO J, ZHANG Z R, ZHAO N, et al. VEGF silencing inhibits human osteosarcoma angiogenesis and promotes cell apoptosis via PI3K/AKT signaling pathway[J]. Cell Biochem Biophys, 2015, 73(2): 519–525. DOI:10.1007/s12013-015-0692-7 |