2. 400038 重庆, 陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院全军病理学研究所
2. Institute of Pathology, First Affiliated Hospital, Army Medical University(Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
急性白血病是严重危害人类健康的重大疾病。其中,急性髓系白血病(acute myeloid leukemia,AML)占急性白血病60%以上,并随年龄增长发病率逐渐增高,成为中老年人群的主要恶性疾病[1]。随着大剂量化疗、造血干细胞移植技术的进步,AML疗效显著提高,但仍有40%~50%的患者在治疗过程中因复发而死亡[2]。如何有效提高复发难治AML的治疗效果是临床亟需解决的关键问题。
白血病干细胞(leukemic stem cells,LSCs)是AML复发难治的根源[3]。LSCs并非孤立存在,其生物学特点与其所在骨髓造血微环境的功能异常息息相关。国内外研究显示,白血病异常造血微环境具有维持AML-LSCs干性的作用[4-5]。然而,上述研究均将造血微环境中基质细胞作为一个整体进行研究。基质细胞是一个混杂的细胞群,包括成纤维细胞、内皮细胞、巨噬细胞、脂肪细胞等。白血病状态下,基质细胞成分是否存在变化,微环境与正常造血微环境中细胞成分是否存在差异,尚不清楚。本课题组在前期预实验中发现:在AML-M2患者骨髓活检片中发现大量CD68呈强阳性表达的细胞,而在正常人骨髓活检中仅能看到少量CD68阳性细胞[6]。CD68是巨噬细胞表面标记,AML患者骨髓活检中大量巨噬细胞源于何处,具有什么样的生物学功能,值得进一步探索。生理条件下,巨噬细胞来源于单核细胞;AML患者白血病细胞大量增殖,正常髓系造血受到抑制。AML造血微环境中巨噬细胞来源有其特殊性,推测其可能来源于AML LSCs细胞。这种AML LSCs源性巨噬样细胞在AML白血病微环境的形成中发挥重要作用。因此,本研究拟分选AML LSCs,在巨噬细胞培养体系中培养,获得AML LSCs源性巨噬样细胞;进一步从形态学、表面分子标记、生物学功能等角度评估AML LSCs源性巨噬样细胞生物学特性,为全面认识LSCs源性巨噬样细胞在AML异常造血微环境形成中的作用提供理论依据,也为AML白血病新型治疗模式的探索提供可行的设计思路。
1 材料与方法 1.1 标本来源AML白血病细胞系Kasumi-3细胞购自ATCC,RPMI1640+10%胎牛血清,37 ℃,5%CO2培养。
1.2 方法 1.2.1 AML-LSCs流式分选收集对数生长期Kasumi-3细胞,调整细胞浓度1×106~1×107/mL,每1×106细胞加入10 μL荧光素标记流式抗体CD34/CD38/CD123,混匀,4 ℃避光孵育30 min;PBS洗涤后流式分选。
1.2.2 AML LSCs源性巨噬样细胞体外培养从白血病细胞系中流式分选出CD34+CD38- CD123+ LSCs,在含有GM-CSF和IL-4的培养基中培养1周,之后转入含有IL-4、TGF-β的培养基中继续培养。
1.2.3 透射电镜观察AML LSCs源性巨噬样细胞超微结构培养获得的AML LSCs源性巨噬样细胞消化后离心,1%四氧化锇4 ℃固定15 min,系列丙酮在室温下脱水,纯丙酮-EPON812包埋剂室温过夜;60 ℃烤箱烘烤2 h固化成硬块;切片后透射电镜下观察细胞形态和超微结构。
1.2.4 激光共聚焦显微镜观察AML LSCs源性巨噬样细胞表面标志物表达内置玻片的培养皿培养获得AML LSCs源性巨噬样细胞,取出玻片固定在载玻片上,4%多聚甲醛固定20 min,0.5% Triton X-100 PBS洗涤5 min×3次,分别加入抗CD11b、CD206、CD163单克隆抗体,4 ℃恒温孵育过夜;0.5% Triton X-100 PBS漂洗5 min×3次,加入Vimentin-Cy3标记二抗,37 ℃恒温孵育60 min;0.5% TritonX-100 PBS漂洗3 min×3次,DAPI 30 min,Triton X-100 PBS漂洗3 min×3次,中性甘油封片,激光共聚焦观察。
1.2.5 ELISA检测AML LSCs源性巨噬样细胞IL-10和IL-8分泌水平按照ELISA试剂盒说明书进行。
1.2.6 细菌吞噬实验验证LSCs源性巨噬样细胞生物学功能琼脂培养基过夜扩增GFP+ E.coli,60Co射线照射GFP+ E.coli 20 min,向LSCs源性巨噬样细胞培养上清中加入20 μL GFP+ E.coli悬液,37 ℃孵育15、30 min和60 min,去除上清,PBS清洗,Vimentin-Cy3/Hoechst Dye染色后荧光显微镜观察。
1.2.7 AML LSCs源性巨噬样细胞对AML细胞耐药蛋白表达的影响按本室方法[7]构建AML细胞/AML LSCs源性巨噬样细胞共培养体系,以悬浮培养的AML细胞作为对照,免疫荧光检测AML细胞表面ABC转运蛋白表达水平。
1.2.8 不同培养条件下Kasumi-3细胞对多种化疗药物耐药系数的测定收集悬浮培养Kasumi-3细胞和与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞,调整细胞数为1×104/mL,取200 μL接种于96孔培养板内,每组设定4个复孔,分别加入不同浓度的柔红霉素(DNR)、阿霉素(ADM)、阿糖胞苷(Ara-C)和足叶乙甙(VP-16),同时设空白对照组,加入10 μmol/L的寡核苷酸,37 ℃、5% CO2条件下孵育48 h。加入CCK-8,10 μL/孔,37 ℃孵育6 h后,震荡10 min,采用双波长,酶标仪测定490 nm处光密度值[D(490)],取平均值。作线性回归方程,求Kasumi-3细胞对不同药物48 h的IC50值,并计算其耐药系数。
1.2.9 不同培养条件下Kasumi-3细胞对DNR的摄药量收集悬浮培养Kasumi-3细胞和与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞,制成106/mL的细胞悬液,加入DNR 1 μg/mL,37 ℃孵育1 h,PBS离心洗涤2次后流式细胞仪检测单个细胞内DNR含量。DNR可发出广谱化学荧光,在经过流式细胞仪检测时可以测出单个细胞平均荧光强度,因此,选用单个细胞的相对荧光强度反映细胞内DNR的摄药量。
1.3 统计学分析采用SPSS 11.0统计软件,数据以x±s表示。组间均数比较采用单因素方差分析中的Dunnett检验,预先行方差齐性分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 LSCs源性巨噬样细胞体外培养培养获得的AML LSCs源性巨噬样细胞呈多形性,以多角形和椭圆形贴壁细胞为主;胞质染色较深,细胞轮廓较明显。胞核较小,圆形或卵圆形,染色较深。透射电镜下观察发现,AML LSCs源性巨噬样细胞呈椭圆形,胞浆丰富,有较多空泡;近胞核处高尔基体富集;包膜绒毛丰富且较长(图 1)。
2.2 AML LSCs源性巨噬样细胞表面标志物及细胞因子表达
激光共聚焦检测发现其巨噬细胞特异表型CD11b、CD163、CD206呈阳性表达(图 2)。ELISA检测结果显示,其能够分泌一定水平IL-10和IL-13,在培养第8天达到分泌高峰(图 3)。
2.3 细菌吞噬实验验证AML LSCs源性巨噬样细胞生物学功能
荧光显微镜观察显示,AML LSCs源性巨噬样细胞胞浆中有大量呈绿色杆状荧光的E.coli菌,随着孵育时间的延长,吞噬E.coli菌的数量逐渐增多;透射电镜在AML LSCs源性巨噬样细胞胞浆中可见吞噬的E.coli菌(图 4)。
2.4 AML LSCs源性巨噬样细胞对AML细胞耐药蛋白表达及对化疗药物耐药系数的影响
构建AML细胞/AML LSCs源性巨噬样细胞共培养体系,以悬浮培养的AML细胞作为对照,激光共聚焦显微镜观察发现其细胞表面ABC转运蛋白表达明显强于对照组(图 5)。与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞对DNR、ADM、Ara-C和VP-16均有一定的耐药性,其48 h的IC50及耐药系数见表 1。
化疗药物 | 48 h IC50 | 耐药系数 | |
悬浮培养 | 共培养 | ||
DNR | 35.47±4.72 | 192.35±12.63 | 5.42 |
ADM | 62.37±4.15 | 229.54±10.03 | 3.68 |
Ara-C | 232.54±23.19 | 827.93±32.52 | 3.56 |
VP-16 | 15.75±2.33 | 20.59±1.82 | 1.31 |
2.5 不同培养条件下Kasumi-3细胞对DNR的摄药量
收集悬浮培养和与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞,加入1 μg/mL的DNR在37 ℃孵育1 h后经流式细胞仪测定单个细胞内的平均药物浓度即摄药量(用平均荧光强度间接反映)。结果显示:共培养组Kasumi-3细胞的摄药量低于悬浮培养Kasumi-3细胞(54.75±4.28 vs 93.84±3.93,P < 0.01)。
3 讨论AML LSCs是存在于急性髓系白血病患者体内,由一群异质性细胞组成的一个极微量的细胞亚群,仅占白血病细胞总数的0.1%~1.0%,具有CD34+、CD38-、CD71-、HLA-DR-、CD90-、CD117-和CD123+等免疫表型[8]。现有研究发现LSCs具有保持干性和逃避化疗药物杀伤的作用[9-10],成为AML复发的根源。LSCs上述生物学特性的维持与其所在骨髓微环境功能异常密切相关。BOYD等[11]将AML-LSCs与骨髓基质细胞MS5联合培养20周,仍能检测到高比例CD34+CD38- 细胞,说明造血微环境中的骨髓基质细胞具有维持AML-LSCs干性的作用。本课题组长期从事异常造血微环境与残留白血病关系的研究,证明造血微环境基质细胞通过细胞间粘附、分泌高水平SDF-1和细胞间隙连接通讯缺失等方式介导残留白血病细胞耐药和凋亡阻滞[12]。KRAUSE等[13]进一步研究发现骨髓造血微环境通过分泌高水平TGF-β和IL-6参与AML-LSCs干性维持和对化疗药物的耐药,成为AML复发的重要原因。
本课题组在前期研究中发现AML-M2患者骨髓活检片中有大量CD68呈强阳性表达的细胞,这些细胞与白血病细胞混合存在[6]。在此基础上,我们回顾性分析了本中心63例初诊AML(M0-2)患者,对其流式分型结果分析发现,上述三种亚型的AML患者,在CD34+CD33+的AML细胞群中存在不同水平的CD115+CD11b+细胞成分,其中10例患者在复发时监测CD34+CD33+CD115+CD11b+细胞成分较初诊显著增高。这群共表达巨噬细胞标志物的AML细胞从何而来,是否具有特殊的生物学作用?为什么这群细胞比例在复发阶段显著高于初诊阶段,其在AML复发中是否发挥作用?这些问题值得深入研究。
本研究结果发现,CD34+CD38-CD123+ AML LSCs可以在特定培养条件下分化成具有巨噬细胞形态和免疫表型的细胞,我们称之为AML LSCs源性巨噬样细胞。E.coli细菌吞噬实验发现上述细胞具有明确的吞噬作用,随共培养时间的延长,吞噬E.coli细菌逐渐增多。免疫荧光染色和ELISA分析发现AML LSCs源性巨噬样细胞具有与经典M2型巨噬细胞类似的免疫表型和分泌细胞因子特点。M2型巨噬细胞是由IL-4、IL-13及免疫复合物活化得到的巨噬细胞,表达高水平CD163、CD206和半乳糖受体表型,具有抑制炎症反应,促进血管生成、组织重构和创伤修复的作用[14]。近年在实体瘤领域研究发现,在肿瘤细胞的诱导下,起源于骨髓的单核细胞可分化形成具有M2表型的巨噬细胞。这些巨噬细胞可促进肿瘤细胞的增殖、抑制T细胞和自然杀伤细胞的抗肿瘤活性,继而促成肿瘤的复发和转移,被称为肿瘤相关巨噬细胞(tumor-associated macrophages,TAMs)[15]。TAMs可通过产生多种细胞因子、生长因子及蛋白酶,对肿瘤细胞增殖、侵袭和转移发挥作用[16-17]。TAMs是否在肿瘤干细胞干性维持和耐药复发中发挥关键作用?FAN等[18]研究发现在肝癌干细胞附近存在CD68+巨噬细胞,与巨噬细胞共培养的肝癌细胞,其代表肿瘤干性特征的凋亡调节蛋白Bmi1和转录因子Klf4表达显著上调;JINUSHI等[19]发现TAMs通过产生IL-6和MFG-E8协同激活肿瘤干细胞Stat3和Hedgehog通路,促进肿瘤发生和肿瘤耐药;DE GRAAUW等[20]报道TAMs通过分泌高水平TGF-β,上调Smad转录途径,继而下调E-cadhrein表达和改变表观遗传学水平,促进肿瘤细胞发生上皮间质转化获得侵袭及迁移的能力。TAMs在肿瘤干细胞干性维持、侵袭耐药中的积极作用,显示出其介导肿瘤复发的潜在能力。TAMs与白血病发生、发展的关系目前尚不清楚。KOMOHARA等[21-22]发现CD68+CD163+ TAMs可分泌C5a、肿瘤坏死因子α(TNF-α)、CCL1/I-309和IL-6,具有显著促进ATLL细胞增殖的作用。2016年,德国AL-MATARY等[23]研究发现TAMs在AML疾病进展中同样发挥重要作用,独立生长因子-1在巨噬细胞极化中发挥关键作用。
本研究中与AML LSCs源性巨噬样细胞共培养的Kasumi-3细胞对DNR、ADM、Ara-C和VP-16的耐药系数分别为5.42、3.68、3.56和1.31,提示AML LSCs源性巨噬样细胞有助于AML多药耐药的产生。免疫荧光染色和Kasumi-3细胞DNR摄药量分析发现共培养后AML细胞表面ABC转运蛋白表达明显增高,DNR可通过ABC转运蛋白主动泵出细胞,部分解释了AML LSCs源性巨噬样细胞促进AML细胞多药耐药产生的原因。
本研究从细胞形态、表面分子标记和初步生物学功能探讨了AML LSCs源性巨噬样细胞的生物学特点。后续将进一步扩大样本验证LSCs源性巨噬样细胞生物学功能,在此基础上,重点采用体内示踪技术明确LSCs源性巨噬样细胞在AML复发中的作用,对其参与LSCs干性维持和耐药复发的作用和可能机制进行深入的研究。为全面认识LSCs源性巨噬样细胞在AML复发中的作用,阐明AML异常造血微环境形成的机制提供理论依据,也为AML白血病新型治疗模式的探索提供可行的设计思路。
[1] | PERL A E. The role of targeted therapy in the management of patients with AML[J]. Hematol Am Soc Hematol Educ Program, 2017, 2017(1): 54–65. DOI:10.1182/asheducation-2017.1.54 |
[2] | ZUCKERMAN T, ROWE J M. Transplantation in acute myeloid leukemia[J]. Hematol Oncol Clin North Am, 2014, 28(6): 983–994. DOI:10.1016/j.hoc.2014.08.016 |
[3] | DING Y, GAO H, ZHANG Q. The biomarkers of leukemia stem cells in acute myeloid leukemia[J]. Stem Cell Investig, 2017, 4(19): 1–5. DOI:10.21037/sci.2017.02.10 |
[4] | MOHAMMADI S, NIKBAKHT M, SAJJADI S M, et al. Reciprocal interactions of leukemic cells with bone marrow stromal cells promote enrichment of leukemic stem cell compartments in response to curcumin and daunorubicin[J]. Asian Pac J Cancer Prev, 2017, 18(3): 831–840. DOI:10.22034/APJCP.2017.18.3.831 |
[5] | LIU Y, CHEN X H, SI Y J, et al. Reconstruction of hematopoietic inductive microenvironment after transplantation of VCAM-1-modified human umbilical cord blood stromal cells[J]. PLoS One, 2012, 7(2): e31741. DOI:10.1371/journal.pone.0031741 |
[6] | GAO L, YU S, ZHANG X. Hypothesis:Tim-3/galectin-9, a new pathway for leukemia stem cells survival by promoting expansion of myeloid-derived suppressor cells and differentiating into tumor-associated macrophages[J]. Cell Biochem Biophys, 2014, 70(1): 273–277. DOI:10.1007/s12013-014-9900-0 |
[7] | LIU Y, WEN Q, CHEN X L, et al. All-trans retinoic acid arrests cell cycle in leukemic bone marrow stromal cells by increasing intercellular communication through connexin 43-mediated gap junction[J]. J Hematol Oncol, 2015, 8: 110–118. DOI:10.1186/s13045-015-0212-7 |
[8] | ITO S, BARRETT A J, DUTRA A, et al. Long term maintenance of myeloid leukemic stem cells cultured with unrelated human mesenchymal stromal cells[J]. Stem Cell Res, 2014, 14(1): 95–104. DOI:10.1016/j.scr.2014.11.007 |
[9] | SHE M, NIU X, CHEN X, et al. Resistance of leukemic stem-like cells in AML cell line KG1a to natural killer cell-mediated cytotoxicity[J]. Cancer Lett, 2012, 318(2): 173–179. DOI:10.1016/j.canlet.2011.12.017 |
[10] | GEZER D, VUKOVIC M, SOGA T, et al. Concise review:genetic dissection of hypoxia signaling pathways in normal and leukemic stem cells[J]. Stem Cells, 2014, 32(6): 1390–1397. DOI:10.1002/stem.1657 |
[11] | BOYD A L, CAMPBELL C J, HOPKINS C I, et al. Niche displacement of human leukemic stem cells uniquely allows their competitive replacement with healthy HSPCs[J]. J Exp Med, 2014, 211(10): 1925–1935. DOI:10.1084/jem.20140131 |
[12] | ZENG D, WANG J, KONG P, et al. Ginsenoside Rg3 inhibits HIF-1α and VEGF expression in patient with acute leukemia via inhibiting the activation of PI3K/Akt and ERK1/2 pathways[J]. Int J Clin Exp Pathol, 2014, 7(5): 2172–2178. |
[13] | KRAUSE D S, FULZELE K, CATIC A, et al. Differential regulation of myeloid leukemia by the bone marrow microenvironment[J]. Nat Med, 2013, 19(11): 1513–1517. DOI:10.1038/nm.3364 |
[14] | MURAILLE E, LEO O, MOSER M. TH1/TH2 paradigm extended:macrophage polarization as an unappreciated pathogen-driven escape mechanism?[J]. Front Immunol, 2014, 5: 603. DOI:10.3389/fimmu.2014.00603 |
[15] | KUDO M. Immuno-Oncology in Hepatocellular Carcinoma:2017 Update[J]. Oncology, 2017, 93(Suppl 1): 147–159. DOI:10.1159/000481245 |
[16] | BECKER M, MVLLER C B, DE BASTIANI M A, et al. The prognostic impact of tumor-associated macrophages and intra-tumoral apoptosis in non-small cell lung cancer[J]. Histol Histopathol, 2014, 29(1): 21–31. DOI:10.14670/HH-29.21 |
[17] | JEANNIN P, PAOLINI L, ADAM C, et al. The roles of CSFs on the functional polarization of tumor-associated macrophages[J]. FEBS J, 2018, 285(4): 680–699. DOI:10.1111/febs.14343 |
[18] | FAN Q, JING Y, YU G, et al. Tumor-associated macrophages promote cancer stem cell-like properties via transforming growth factor-beta1-induced epithelial-mesenchymal transition in hepatocellular carcinoma[J]. Cancer Lett, 2014, 352(2): 160–168. DOI:10.1016/j.canlet.2014.05.008 |
[19] | JINUSHI M, CHIBA S, YOSHIYAMA H, et al. Tumor-associated macrophages regulate tumorigenicity and anticancer drug responses of cancer stem/initiating cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2011, 108(30): 12425–12430. DOI:10.1073/pnas.1106645108 |
[20] | DE GRAAUW M, VAN MILTENBURG M H, SCHMIDT M K, et al. Annexin A1 regulates TGF-beta signaling and promotes metastasis formation of basal-like breast cancer cells[J]. Proc Natl Acad Sci USA, 2010, 107(14): 6340–6345. DOI:10.1073/pnas.0913360107 |
[21] | SAITO Y, KOMOHARA Y, NⅡNO D, et al. Role of CD204-positive tumor-associated macrophages in adult T-cell leukemia/lymphoma[J]. J Clin Exp Hematop, 2014, 54(1): 59–65. DOI:10.3960/jslrt.54.59 |
[22] | KOMOHARA Y, NⅡNO D, SAITO Y, et al. Clinical significance of CD163+ tumor-associated macrophages in patients with adult T-cell leukemia/lymphoma[J]. Cancer Sci, 2013, 104(6): 945–951. DOI:10.1111/cas.12167 |
[23] | AL-MATARY Y S, BOTEZATU L, OPALKA B, et al. Acute myeloid leukemia cells polarize macrophages towards a leukemia supporting state in a growth factor independence 1 dependent manner[J]. Haematologica, 2016, 101(10): 1216–1227. DOI:10.3324/haematol.2016.143180 |