目前针对病态窦房结综合征及Ⅲ°房室传导阻滞等严重缓慢性心律失常的主要治疗策略是植入人工心脏起搏器，虽然挽救了无数患者的生命，但仍存在一些不足与缺陷，如电极脱位、囊袋感染、易受周围强电磁信号的干扰、缺乏对自主神经的反应等[1]。因此，“心脏生物起搏”成为探索治疗缓慢性心律失常的一个新方向。目前研究较为理想的方法是将具有起搏功能的基因转染至干细胞，并导入受损的窦房结或心脏传导系统中，以恢复心脏的起搏或传导功能。已有研究[2]证实，用超极化激活环核苷酸门控阳离子通道4(hyperpolarization-activated cyclic nucleotide-gated channel 4, HCN4)基因转染至犬骨髓间充质干细胞(mesenchymal stem cells, MSCs)，并将其植入Ⅲ°房室传导阻滞模型犬的心室肌后，可检测到起源于移植部位的平均自主节律[(59±5)/min]较未移植对照组[(38±2)/min]明显升高，但随时间推移，来源于移植部位的自主节律开始逐渐降低。分析其原因，可能与移植细胞凋亡、流失或未能与周围心肌细胞形成良好的电机械偶联相关。
缝隙连接蛋白(connexin, Cx), 作为相邻心肌细胞间电机械偶联的物质结构基础，在心肌细胞间的通讯及心肌同步化收缩中发挥重要作用。人和动物心脏主要表达有Cx40、Cx43、Cx45。且在心脏不同部位表达不同的亚型。其中Cx45主要表达于窦房结、房室结中，Cx43主要表达于心房肌、心室肌中[3-4]。
本研究将编码Cx45的缝隙连接蛋白α7(gap junction protein-alpha 7，GJA7)基因转染至大鼠骨髓间充质干细胞(rat mesenchymal stem cells, rMSCs)，使其过表达Cx45，并与乳鼠心肌细胞(neonatal rat ventricular myocytes, NRVMs)共培养，模拟心脏内部微环境刺激，促进rMSCs与周围心肌细胞形成良好的电机械偶联传导通路，探索解决生物起搏细胞移植入心脏后搏动频率减低的可能方法。
1 材料与方法 1.1 实验动物4周龄健康SD大鼠(10只，体质量80~100 g，雌雄不限)及出生24 h的SD大鼠(15只，体质量6.0~7.0 g，雌雄不限)均购自陆军军医大学(第三军医大学)实验动物中心。
1.2 试剂和仪器 1.2.1 主要试剂包括α-MEM培养基、D-MEM/F12培养基(美国HyClone公司)，胎牛血清(美国Gibco公司)，青霉素/链霉素(中国碧云天公司)，助转剂聚凝胺(polybrene)、胰蛋白酶、嘌呤霉素(美国Sigma公司), Ⅱ型胶原酶(美国Worthington Biochemical公司)，CD29、CD34、CD44、CD45抗体(美国eBioscience公司)，TRIzol、cDNA第1链合成试剂盒、SYBR染料法荧光定量PCR试剂盒(中国北京艾德莱公司)。
1.2.2 主要仪器倒置相差显微镜(日本Olympus公司)，5804R型冷冻离心机(德国eppendorf公司)，流式细胞仪、荧光定量PCR仪(美国BD公司)，膜片钳记录系统(美国AXON公司)。
1.3 实验方法 1.3.1 rMSCs的分离、培养和鉴定取4周龄健康SD大鼠, 1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)腹腔麻醉后处死，无菌分离四肢长骨，用培养基反复冲洗骨髓腔，1 000 r/min离心5 min，弃上清，用完全培养基重悬后，种入培养皿中。利用贴壁筛选分离法，纯化rMSCs。原代培养7~10 d后，贴壁细胞生长密度达70%~80%，即可进行传代[2, 5]。
取第3代rMSCs经0.25%胰蛋白酶消化后，用PBS重悬清洗，分管依次加入抗体CD29、CD34、CD44、CD45，同时每管设立空白对照组，之后避光孵育30 min, 再次用PBS清洗重悬，流式细胞仪检测各组细胞抗体标记的百分率[6]。
1.3.2 NRVMs的提取和培养采用酶解法及差速贴壁法[7-8]分离提取NRVMs。取出生24 h的SD大鼠，用75%乙醇浸泡3 min消毒后，双蒸水冲洗。而后颈椎脱臼处死，手术剪剪开胸腔，取出心脏，浸泡于提前预冷的HBSS中，剪除心脏周围多余结缔组织后，将心脏剪碎至1 mm3大小。加入0.1%胰蛋白酶过夜摇床震荡消化12~14 h。完全培养基终止消化，离心去除上清液后，用0.06%~0.08% Ⅱ型胶原酶继续消化3~5次，每次约10 min，消化液加入至完全培养基终止消化。离心混合液，弃上清，用20%完全培养基重悬，接种于培养皿中，放入37 ℃、5% CO2培养箱中孵育。30~45 min后，将培养皿中未贴壁的细胞，以5×105/mL接种于新的培养皿中，得到纯化的心肌细胞。前3 d，培养基中加入5-溴脱氧尿嘧啶核苷(5-Bromo-2-Deoxyuridine, BrdU)，抑制成纤维细胞生长，从而进一步纯化心肌细胞[9]。
1.3.3 携带GJA7基因的慢病毒载体构建GJA7基因碱基序列由基因文库查询获得，人工合成cDNA序列后，行PCR扩增，用BamHⅠ和EcoRⅠ将此序列与慢病毒空载体进行酶切，而后用TDNA连接酶连接后得到重组慢病毒载体质粒，对质粒进行测序鉴定后，转染293T细胞包装慢病毒，命名为pLentis-GJA7-RFP。PCR检测慢病毒液滴度为2.13×108 TU/mL，对照组pLentis-RFP慢病毒液滴度为5.06×108 TU/mL。慢病毒载体内，带有嘌呤霉素抗性基因，可用于病毒转染rMSCs后目的细胞的筛选纯化。
1.3.4 慢病毒转染和纯化选取处于对数生长期的第3代rMSCs，以0.75×105/孔接种至6孔板。24 h后，观察细胞生长密度，待生长融合达到50%~60%时，进行慢病毒转染。按照预实验确定的最佳转染复数(Lentis-GJA7-RFP组：MOI=50；pLentis-RFP组：MOI=20)，同时加入polybrene(6 μg/mL)和慢病毒液(Lentis-GJA7-RFP、pLentis-RFP)转染rMSCs。24 h后，更换培养基[10]。72 h后，荧光显微镜下可见红色荧光表达，提示慢病毒转染成功。继续培养并扩增传1代后，用嘌呤霉素(2 μg/mL)筛选3 d，得到纯化的携带GJA7或RFP的目标细胞。
1.3.5 实验分组与共培养分为4组。A组：RFP-rMSCs组；B组：GJA7-RFP-rMSCs组；C组：RFP-rMSCs与NRVMs共培养组(RFP-rMSCs+NRVMs组)；D组：GJA7-RFP-rMSCs与NRVMs共培养组(GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs组)。
rMSCs与NRVMs共培养方法：在原代NRVMs提取、培养24 h后，以4:1比例加入已纯化的慢病毒转染细胞(A、B组)进行共培养[5]。共培养期间隔天更换1次培养基，培养5 d后，往各组细胞中加入嘌呤霉素(5 μg/mL)进行加压筛选，得到两组经心肌细胞共培养诱导的慢病毒转染细胞(C、D组)。
1.3.6 Real-time qPCR检测收集经筛选纯化后的各组慢病毒转染细胞，用TRIzol提取总RNA。核酸蛋白检测仪测定RNA浓度，按说明书使用cDNA第1链合成试剂盒逆转录合成cDNA，使用SYBR染料法实时荧光定量PCR试剂盒进行扩增, PCR数据分析采用2-ΔΔCt处理，分别检测HCN4、GJA7、Tbx3、Tbx18、Cx43、Nkx2.5的mRNA表达。内参采用GAPDH，使用引物见表 1。
| 基因 | 引物序列 | 扩增片段(bp) |
| HCN4 | 上游5′- GGCACCATTGGCAAGAAGAT -3′ | 118 |
| 下游5′- TCAGCAGGCAGATCTCTCCA -3′ | ||
| GJA7 | 上游5′- ACGGAGGAGGACAACGAAGA -3′ | 109 |
| 下游5′- GTCGGCCATCATGCTTAGGT -3′ | ||
| Tbx3 | 上游5′- AGATGCGGATGATGATGTGA -3′ | 124 |
| 下游5′- CACGCTGATGACTCCTGTGT -3′ | ||
| Tbx18 | 上游5′- TCTTCTCCTGCCTTCCATCTG -3′ | 122 |
| 下游5′- TCAGCCAAGGAGGTGCTGTA -3′ | ||
| Cx43 | 上游5′- GGAAGCACCATCTCCAACTC -3′ | 115 |
| 下游5′- GCTGGTCCACAATGGCTAGT -3′ | ||
| Nkx2.5 | 上游5′- CAAGTGTGCGCCTGCATTTC -3′ | 88 |
| 下游5′- ATCAGCTCGAGGGTCCTTGG -3′ |
1.3.7 全细胞膜片钳检测
收集经筛选纯化后的各组慢病毒转染细胞，按本实验室建立的方法[11]，配置好电极内液与细胞外液。将各组细胞用胰酶消化10 s后，置于膜片钳系统中检测。采用Clampex 10.5程序采样，封接细胞，形成全细胞膜片钳记录模式。设置钳制电压为-30 mV，以10 mV步阶电压，从-40 mV超极化至-160 mV, 末端再钳制至+20 mV，记录尾电流，拟合激活曲线，求算出半数激活电压和曲线的斜率。当记录到超极化激活的内向电流后，将细胞外液换成Cscl(4 mmol/L)，以相同钳制电压记录电流变化情况。根据检测结果判断其是否具有起搏电流(If)的特性。采用电压钳模式，设置钳制电压为-30 mV，先超极化至-150 mV, 再以10 mV步阶电压，从-150 mV去极化至+20 mV, 末端再钳制至-10 mV，记录尾电流，测定反转电位。
1.4 统计学分析采用SPSS 19.0统计软件进行分析，计量资料数据以x±s表示，组间比较采用单因素方差分析。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 rMSCs的培养和鉴定提取的原代rMSCs初始贴壁呈圆球形，培养3 d后可见贴壁细胞呈细杆状生长，5 d后细胞生长速度明显加快，逐渐长成长梭形、多角形。至培养7~9 d，rMSCs生长融合达90%以上，呈集落样或“洋葱样”生长，可进行传代培养。
流式细胞术检测第3代rMSCs表面标记物CD29、CD34、CD44、CD45。结果显示CD29、CD44表达率较高，分别为(98.41±1.13)%、(97.67±2.52)%；CD34、CD45表达率较低，分别为(0.28±0.06)%、(0.63±0.11)%。
2.2 慢病毒转染rMSCs选取处于对数生长期的rMSCs进行慢病毒转染，72 h后倒置荧光显微镜下可观察到红色荧光表达，慢病毒转染效率达70%~80%。流式细胞学荧光检测结果显示，RFP-rMSCs组与GJA7-RFP-rMSCs组转染效率差异无统计学意义[(74.15±4.16)% vs (72.37± 3.57)%, P>0.05，图 1]。通过流式细胞分选及嘌呤霉素筛选纯化5 d，两组慢病毒转染效率均可提高至95%左右，细胞生长状态未见明显改变。
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A、D：倒置显微镜下观察；B、E：荧光显微镜下观察；C：A、B二者合成图像；F：D、E二者合成图像 A~C：pLentis-GJA7-RFP转染骨髓间充质干细胞；D~F：pLentis-RFP转染骨髓间充质干细胞 图 1 慢病毒转染骨髓间充质干细胞 |
2.3 慢病毒转染rMSCs与NRVMs共培养
将慢病毒转染rMSCs与NRVMs按1:4比例共培养，3 d后，荧光显微镜下可见表达红色荧光的慢病毒转染细胞与NRVMs重叠分布，融合生长，一起搏动。共培养5 d后，可见两种细胞交织成簇生长，形成同步搏动的细胞团，且经共培养诱导后的rMSCs体积较前略有增大，呈纺锤形、分叉型生长(图 2)。
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| A：倒置显微镜下观察乳鼠心肌细胞；B：荧光显微镜下观察GJA7-RFP-rMSCs；C：A、B两者合成图像 图 2 慢病毒转染细胞与乳鼠心肌细胞共培养 |
2.4 GJA7基因转染rMSCs后起搏相关基因mRNA的表达
检测各实验组起搏相关基因mRNA表达显示：GJA7-RFP-rMSCs组和GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs组均过表达GJA7，说明GJA7基因成功转染rMSCs。而GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs组经NRVMs共培养诱导后，其HCN4、Tbx3、Tbx18表达较其他组明显升高(P < 0.05)，而Cx43、Nkx2.5表达明显减少(P < 0.05)。RFP-rMSCs+NRVMs组显示Nkx2.5、Cx43表达升高(P < 0.05)。见表 2。
| 组别 | HCN4 | GJA7 | Tbx3 | Tbx18 | Cx43 | Nkx2.5 |
| RFP-rMSCs组 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 | 1.00±0.00 |
| RFP-rMSCs+NRVMs共培养组 | 1.07±0.15 | 1.47±0.18 | 1.41±0.14 | 1.62±0.10 | 7.61±0.56a | 16.11±2.93a |
| GJA7-RFP-rMSCs组 | 1.62±0.34 | 114.94±12.57ab | 3.97±0.76ab | 2.36±0.43ab | 0.62±0.09ab | 0.32±0.06ab |
| GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs共培养组 | 2.71±0.37abc | 152.78±17.88abc | 10.13±1.59abc | 3.25±0.41abc | 0.16±0.03abc | 0.13±0.02abc |
| a：P < 0.05，与RFP-rMSCs组比较；b：P < 0.05，与RFP-rMSCs+NRVMs组比较; c：P < 0.05，与GJA7-RFP-rMSCs组比较 | ||||||
2.5 全细胞膜片钳记录If电流
对各组细胞进行全细胞膜片钳检测显示，仅有GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs组记录到了超极化激活的内向电流，该电流具有明显的时间电压依赖性。且该电流在细胞外液更换为Cscl后，被特异性阻断，而冲洗Cscl后，重新出现超极化激活的内向电流，符合If电流特性(图 3)。采用电压钳模式，记录尾电流，构建反转电位曲线和激活曲线，测得反转电位为(-28.4± 3.2)mV，半数激活电压为(-103.6±4.5)mV，斜率为(-15.1±1.3)。而GJA7-RFP-rMSCs组、RFP-rMSCs+NRVMs组、RFP-rMSCs组均未检测到类似超极化激活的If电流。
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| A：GJA7-RFP-rMSCs+NRVMs记录的内向电流；B、C：Cscl的阻断和洗脱 图 3 膜片钳记录的超极化激活的内向电流及相关曲线 |
3 讨论
心脏生物起搏治疗是指利用细胞生物学及基因工程等技术，将具有起搏功能的细胞导入受损的窦房结或者传导系统中，使之恢复心脏起搏或传导功能。主要方式包括：基因生物起搏、细胞生物起搏及基因联合细胞生物起搏[1, 12]。目前心脏生物起搏研究主要聚焦于转染起搏基因(HCN2、HCN4、Shox2等)，构建具备产生If电流的干细胞，并将其移植入动物模型心脏中，评价起搏效能。但对于移植后，起搏效能不够理想甚或逐渐下降的原因机制，尚不明确。本实验从移植细胞与周围心肌细胞电信号传导倚赖的缝隙连接蛋白入手，将表达缝隙连接蛋白Cx45的目的基因GJA7转染至rMSCs，并通过与NRVMs共培养模拟心脏微环境。膜片钳及RT-qPCR检测结果显示，经GJA7修饰的rMSCs，具备了产生起搏电流的能力，同时有向心脏起搏样细胞分化的趋势，为心脏生物起搏提供了新的研究思路。
本实验采用的HIV-Ⅰ型慢病毒载体系统为双链RNA病毒。携带特定目的基因的慢病毒载体系统感染宿主细胞后，以病毒RNA为模板，合成cDNA后整合到宿主细胞的基因组中并长期稳定表达其携带的目的基因[13]。慢病毒载体系统本身具有较高的转染效率，无论是分裂细胞或非分裂细胞均可进行转染，且转染后转录表达效率高、安全性好。MSCs本身易于提取、分离，自我复制、增殖能力强，且具有多向或定向分化的潜能。由于其免疫源性低，不易引起免疫排斥反应，已被广泛应用于干细胞治疗的基础及临床试验研究[14]。本研究采用慢病毒载体系统包被目的基因GJA7，并转染至rMSCs，72 h后荧光显微镜下即可见红色荧光，流式细胞术检测，转染效率可达70%~80%，转染效率较高。由于转染目的基因后的rMSCs, 细胞生长状态良好，可稳定进行传代，满足了后续实验的需求。
既往研究证实，与NRVMs共培养，可促使MSCs向心肌细胞分化，其与细胞间相互牵拉、电机械刺激、心肌细胞微环境提供细胞因子、激素刺激信号等密切相关[15]。已知窦房结细胞产生自律性的机制主要在于其动作电位4期自动去极化，而由超极化激活环化核苷酸门控阳离子通道(HCN)家族编码的If电流在其中起重要的作用。已有研究证实HCN4在哺乳动物窦房结组织中显著表达，是目前公认的重要的起搏基因[16]。本实验中，RT-qPCR结果显示GJA7-RFP-cMSCs+ NRVMs组HCN4基因表达明显上调，全细胞膜片钳检测证实该组细胞产生了超极化激活的If电流，说明经心肌细胞共培养诱导刺激后，该组细胞已具备心脏起搏样细胞的功能。Cx作为相邻心肌细胞间紧密连接的物质基础，构成了心肌细胞电机械偶联传递通路。其亚型Cx45主要表达于窦房结和房室结中，而Cx43则主要表达于心房肌和心室肌中。DESPLANTEZ等[17]发现，心肌细胞间电机械偶联传递效率与Cx的种类及传播方向相关。其中Cx45→Cx43电机械偶联传递效率高于Cx43→Cx45。本实验在共培养模式下，GJA7-RFP-rMSCs过表达的Cx45与周围心肌细胞形成Cx45→Cx43高效的电机械偶联，更有利于起搏电流的传导。
窦房结发育的本身是一个相当复杂的过程，涉及多种转录因子的相互作用。其中Tbx3、Tbx18作为T-box家族成员，在窦房结特异性表达。Tbx3突变能导致窦性停搏、窦性心动过缓和猝死。功能性实验结果显示Tbx3能抑制Cx43、Cx40及Nppa的表达[18]。转录因子Tbx18在胚胎窦房结头部发育过程中有重要作用，可特异性地抑制心肌细胞标志物Cx43的表达[19]，而转录因子Nkx2.5、Cx43则被认为是工作心肌分化的标志。既往研究表明，过表达Nkx2.5可使窦房结细胞向工作心肌细胞转变，将异位表达Cx40和Nppa, 同时下调Tbx3和HCN4表达[20]。本实验结果显示，GJA7-RFP-rMSCs组Tbx3、Tbx18表达上调, 而Nkx2.5、Cx43表达下降。与NRVMs共培养后这种趋势更加明显，并且上调了HCN4的表达，说明在心肌细胞微环境诱导下，可进一步促进rMSCs向心脏起搏样细胞方向分化，有利于心脏生物起搏功能的构建。
本实验主要对转染GJA7的rMSCs的起搏功能和起搏相关基因表达进行了检测，未对其电信号传导功能进行检测，未进一步将rMSCs移植入动物心脏中进行在体实验，缺乏全面综合评价过表达GJA7后rMSCs的起搏效能情况，我们将在后续实验中进一步研究。
综上所述，将GJA7转染rMSCs，并与NRVMs共培养，体外诱导产生了起搏电流，并促使rMSCs朝心脏起搏样细胞方向分化。而Cx45过表达及NRVMs微环境的刺激在其中发挥了重要作用。
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