放射技术在生活中应用日益广泛，急性放射病防治研究越发受到重视，人体受到中剂量的放射会发生严重骨髓抑制，重者危及生命[1]。骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells, BM-MSCs)是成人骨髓内具有多向分化潜能的干细胞，可分化为骨、软骨、脂肪，是骨髓微环境的重要组成部分[2]。相比造血干细胞，BM-MSCs具有较强的辐射抵抗性，在急性放射后仍然可存活[3]，是放射后机体造血恢复的重要造血支持细胞，但是其功能受到不可逆的损伤，放射后出现细胞衰老，促成了造血微环境的异常，影响造血恢复[4]。因此，研究急性放射损伤导致BM-MSCs衰老的机制对于骨髓型急性放射病的防治有着重要意义。目前放射损伤导致BM-MSCs衰老的机制尚未完全阐明，放射后BM-MSCs短期内会出现DNA损伤修复，并耐受高剂量的辐射而存活，但是随后会不可逆地进入衰老，并出现功能减低，主要表现为分化功能异常[5]、增殖能力减弱、造血支持功能减低[4]，相关机制有待进一步研究。本研究通过构建放射损伤导致BM-MSCs衰老的体外模型，以及体外操控BM-MSCs中lncRNA-TUG1的表达水平，观察lncRNA-TUG1在放射损伤导致的BM-MSCs衰老进程中所起的作用，为干预放射导致的BM-MSCs的衰老提供可能靶点。
1 材料与方法 1.1 BM-MSCs细胞系来源与培养人骨髓间充质干细胞(HMSC-bm)购自ScienCell公司，已验证CD73+、CD90+、CD105+，并可在体外诱导分化，符合国际细胞治疗协会(International Society for Cellular Therapy，ISCT) [6]制定的间充质干细胞标准。在人骨髓间充质干细胞培养液(HUXMA-90011，Cyagen)中，37 ℃、5% CO2条件下培养，细胞贴壁生长达＞80%融合后，以0.25%胰酶消化细胞，按1:2~1:4传代。
1.2 放射处理采用9 Gy剂量(Co60)γ射线对BM-MSCs放射，放射剂量率为700 cGy/min。
1.3 细胞蛋白提取与免疫印迹在冰上用细胞刮刮下细胞，离心收集后加入现配的RIPA和PMSF裂解液，涡旋2 min，4 ℃ 10 000×g离心15 min，收集上清，将提取的细胞总蛋白分别进行SDS-PAGE电泳，转膜与免疫印迹，所用抗体包括p53(ab1101)、γ-H2AX (ab26350)(Abcam)。
1.4 RNA提取，反转录及实时荧光定量PCR总RNA通过TRIzol试剂(10296010，Invitrogen)按照说明书进行提取，通过反转录试剂盒(First Strand cDNA Synthesis Kit, FSK-100，TOYOBO)得到cDNA，qPCR通过FastStart Universal SYBR Green Master Mix (04913850001，Roche)试剂盒在20 μL体系一式三份下进行，程序为94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s。lncRNA-TUG1 PCR引物序列：lncRNA-TUG1上游5′-TAGCAGTTCCCCAATCCTTG -3′，下游5′-CACAAATTCCCATCATTCCC-3′，片段大小76 bp；β-actin上游5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′，下游5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′，片段大小190 bp。
1.5 Lnc-RNA TUG1 shRNA慢病毒载体转染BM-MSCs在NCBI查询下载lncRNA-TUG1的序列，干扰RNA的序列，lncRNA-TUG1-1：5′-GGATATAGCCAGAGAACAA-3′；lncRNA-TUG1-2：5′-GCUUGGCUUCUAUUCUGAAUCCUUU-3′。提取慢病毒包装系统中质粒DNA，溶于除菌的TE中，以紫外光吸收法测定其浓度及纯度，保证所提质粒DNA的D(260)/D(280)为1.8~2.0。将过表达片段、干扰片段、质粒经酶切、连接并转化到感受态细胞中，培养细菌并提取质粒。将构建好的质粒转染293T细胞，收集病毒，进行滴度测定。将构建的shRNA病毒液感染BM-MSCs，48 h后在荧光显微镜下观察转染效率，puromycin进一步筛选阳性细胞后qRT-PCR检测lncRNA-TUG1抑制效率。
1.6 SA-β-gal染色检测BM-MSCs放射前后细胞衰老用细胞衰老β-半乳糖苷酶染色试剂盒(C0602，碧云天)对处理的BM-MSCs进行染色处理。
1.7 CCK-8检测BM-MSCs细胞增殖96孔板中每孔接入3 000个细胞，37 ℃、5% CO2孵育24 h后进行处理，按说明书加入CCK-8试剂[CK04，东仁化学科技(上海)]处理，酶标仪检测450 nm处吸光度值[D(450)]反映细胞增殖活性。
1.8 统计学分析采用GraphPad Prism 6统计软件，计量资料数据以x±s表示，组间比较采用t检验分析，P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 放射诱导BM-MSCs高表达lncRNA-TUG1，短期出现DNA损伤修复及细胞衰老放射后BM-MSCs中lncRNA-TUG1表达显著增高，4、24 h分别上升至原来的1.56倍(P < 0.05)和2.00倍(P < 0.01)。放射后4 h内磷酸化γ-H2AX显著增高，提示DNA损伤发生，24 h后磷酸化γ-H2AX减低，表明DNA损伤逐渐修复，但仍然存在DNA损伤，与此同时，衰老相关蛋白p53随着时间延长显著增高(图 1)。放射损伤后2 d，与未放射组[衰老细胞百分率为(7.3±0.9)]比较，放射[衰老细胞百分率为(69.0± 2.0)]显著增加BM-MSCs细胞衰老(P < 0.01，图 2)。放射损伤后72 h CCK-8检测显示BM-MSCs细胞增殖减低40%(P < 0.01)，表明放射显著抑制BM-MSCs细胞增殖。
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| 1：放射后0 h；2：放射后4 h；3：放射后24 h 图 1 放射后0、4、24 h BM-MSCs中γ-H2AX、p53变化 |
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| A：对照组；B：放射组 图 2 放射2 d后BM-MSCs衰老显著增加(β-半乳糖苷酶染色，×200) |
2.2 抑制lncRNA-TUG1促进BM-MSCs放射后的DNA损伤修复，减少细胞衰老
为研究lncRNA-TUG1在放射损伤导致的衰老中的作用，我们同时将转染空载体慢病毒的对照组BM-MSCs与干扰lncRNA-TUG1的干扰组BM-MSCs进行放射处理后提取RNA、总蛋白，并进行β-半乳糖苷酶染色。放射诱导干扰组BM-MSCs表达lncRNA-TUG1升高，但显著低于对照组(图 3)。
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| a：P < 0.01，与同时间对照组比较 图 3 放射后0、4、24 h内BM-MSCs和干扰组中lncRNA-TUG1变化 |
2.3 放射后BM-MSCs和干扰组中p-53和γ-H2AX的变化
放射后4 h，干扰组与对照组r-H2AX水平均升高，两组无明显差异。放射后24 h，干扰组r-H2AX水平与放射前比无明显差异，对照组r-H2AX水平明显高于放射前，提示干扰lncRNA-TUG1可能促进BM-MSCs在放射损伤后的DNA修复。放射后24 h，干扰组细胞衰老相关蛋白p53显著低于对照组，提示干扰组细胞衰老程度较低(图 4)。放射后2 d，干扰lncRNA-TUG1组衰老细胞百分率显著低于对照组(P < 0.01，图 5、6)，表明干扰lncRNA-TUG1显著减少放射导致的BM-MSCs衰老。
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| 1:未放射对照组；2：未放射干扰组；3：放射后4 h对照组；4：放射后4 h干扰组；5：放射后24 h对照组；6：放射后24 h干扰组 图 4 放射后0、4、24 h内对照组BM-MSCs和干扰组中p-53和γ-H2AX变化 |
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| A:未放射对照组；B:放射后对照组；C:未放射干扰组；D:放射后干扰组 图 5 放射2 d后对照组和干扰lncRNA-TUG1组BM-MSCs的衰老检测(β-半乳糖苷酶染色×200) |
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| a：P < 0.01，与未放射组及放射干扰组比较 图 6 放射后2 d β-半乳糖苷酶染色检测各组细胞衰老百分率 |
3 讨论
BM-MSCs是成人骨髓内具有多向分化潜能的干细胞，是骨髓造血的重要支持细胞，相比造血干细胞，具有较强的放射抵抗性，但是其功能受到不可逆的损伤，出现细胞衰老，促成了造血微环境的异常，影响放射后的造血恢复，研究放射引起BM-MSCs衰老的机制对急性放射病的防治有重要意义。
长链非编码RNA(long noncoding RNA，lncRNA)是一类转录本长度超过200 nt、不编码蛋白的RNA，过去被认为是无功能的转录“噪音”，然而越来越多的研究表明其在细胞的生命活动中发挥着重要的作用。大量lncRNA的功能与作用仍不清楚，在近年来越来越受到重视[7]。早期研究报道lncRNA-TUG1可能参与小鼠的视网膜发育[8]；在肿瘤细胞研究中报道，lncRNA-TUG1的上游受直接p53调控[9]，调控p53介导的多种细胞效应；近年发现lncRNA-TUG1在多种肿瘤中异常表达，影响肿瘤细胞的增殖、凋亡，并与部分肿瘤患者的预后相关[9-14]，表明lncRNA-TUG1可能在细胞的功能中发挥重要作用。本研究中lncRNA-TUG1在放射后显著增高，BM-MSCs出现DNA损伤修复，细胞衰老显著增加；而干扰lncRNA-TUG1后，BM-MSCs在放射后DNA损伤修复明显加快，细胞衰老显著减低，表明lncRNA-TUG1是BM-MSCs放射损伤修复过程中的一个抑制因素，而干预lncRNA-TUG1表达可以促进BM-MSCs的损伤修复并减少衰老。
本研究发现lncRNA-TUG1在放射致BM-MSCs损伤过程中发挥重要的调控作用并促进放射诱导BM-MSCs衰老进程，为深入研究放射致BM-MSCs损伤发生的机制研究提供了新的思路。然而lnc-RNA TUG1如何参与放射对BM-MSCs的衰老具体机制尚不清楚，仍然有待进一步的研究探索。
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