2. 400013 重庆, 重庆市人民医院:检验科
2. Department of Clinical Laboratory, Chongqing Municipal People's Hospital, Chongqing, 400013, China
虽然肺气肿和特发性肺间质纤维化(idiopathic pulmonary fibrosis, IPF)有不同的临床和功能定义，以及不同的影像特性和病理表现，越来越多的证据支持上叶肺气肿和肺下叶纤维化可在同一个患者并存，称为肺纤维化合并肺气肿综合征(combined pulmonary fibrosis and emphysema，CPFE)[1]。这个综合征的定义首次被COTTIN等[2]提出，目前还没有达成共识的治疗方法。因其独特的影像学特征且常合并肺动脉高压，从而引起临床上的广泛关注和研究兴趣。最近研究结果提示细胞因子网络在CPFE的发病过程中发挥着重要的作用[3]。发现在该病的发病过程中有多种炎症细胞及细胞因子参与，其中白细胞介素-8(interleukin-8, IL-8)、肿瘤坏死因子-α(tumor necrosis actor-alpha, TNF-α)、转化生长因子-β1(transforming growth factor beta 1, TGF-β1)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)起了重要的作用[4-6]。N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)具有抗氧化和免疫调节作用[7]。本研究用N-乙酰半胱氨酸片治疗CPFE患者，观察其血中炎症细胞因子水平的改变，从细胞因子的角度探讨NAC治疗CPFE的作用机制。
1 对象与方法 1.1 研究对象选择2013年6月至2016年6月在重庆市人民医院呼吸内科门诊及住院的CPFE患者112例，征得患者知情同意后将患者按照入组先后顺序排序，单号为治疗组，双号为对照组，每组各56例。治疗组男性51例，女性5例，年龄65～78(67.5±7.8)岁；对照组男性52例，女性4例，年龄66～80(66.3±8.2)岁。两组患者均排除恶性肿瘤、类风湿关节炎等疾病。两组患者在性别、年龄、吸烟指数、慢性阻塞性肺病(chronic obstructive pulmonary disease, COPD)病程方面，无统计学差异(P>0.05)，具有可比性，见表 1。CPEE综合征患者诊断标准：所有病例均符合国外文献诊断标准[2, 8]，具有肺气肿的各项临床特征，合并肺间质纤维化的部分特点，如湿性罗音、杵状指(趾)等；或临床上符合肺间质纤维化的诊断，但肺体积无明显缩小；影像学检查同时具有肺气肿和肺间质纤维化的改变[9]：①肺气肿：定义为边界清楚的低密度影，无壁或者薄壁(＜1 mm)，或者肺大泡(直径＞1 cm)，病变以上肺野为主；②肺纤维化：表现为肺外周和下肺野为主的网格影，蜂窝肺，肺组织结构破坏、牵张性支气管扩张；可以有局部、少量的磨玻璃影和(或)实变影。排除标准[10]：具有结缔组织疾病相关性间质性肺疾病，药物性肺病、尘肺、结节病、外源性过敏性肺炎、Wegener肉芽肿、肺泡蛋白沉积症、肺出血-肾炎综合征、特发性肺含铁血黄素沉着症、淋巴管血管平滑肌瘤病、肺朗格汉斯细胞组织细胞增多症、慢性嗜酸细胞性肺炎之一者。
| 组别 | n | 年龄(岁) | 男/女 | 吸烟指数 | COPD病程(年) |
| 对照组 | 56 | 67.5±7.8 | 51/5 | 30.3±4.6 | 20.2±6.5 |
| 治疗组 | 56 | 66.3±8.2 | 52/4 | 29.4±6.2 | 21.4±6.2 |
1.2 治疗方法
对照组给予常规抗炎、扩张支气管及氧疗等基本治疗；治疗组患者除了给予基本治疗，还给予乙酰半胱氨酸(海南赞邦制药有限公司，商品名：富露施)，600 mg/次，每日3次，两组患者疗程均为12个月。
1.3 主要试剂和仪器酶标仪(美国BIO-RAD)、UV-7504紫外可见分光光度计(上海欣茂)、37 ℃恒温敷箱(上海一恒仪器有限公司)、恒温水浴锅(上海跃进医疗器械厂)、高速离心机(湖北湘仪实验室仪器开发有限公司)。IL-8、TNF-α、TGF-β1、VEGF试剂盒(南京建成生物工程研究所)。
1.4 观察指标两组患者分别于治疗前，治疗后3、6、9、12个月抽取晨8:00-10:00空腹肘静脉血6 mL，分装于两管，一管标本抗凝，一管标本不抗凝，后标本离心，取上清液，获得血清标本，装于EP管中，置-80 ℃冰箱保存备用。检测细胞因子时在室温融化后2 h测量，保存过程中如有沉淀形成，应再次离心。采用酶联免疫法测两组患者治疗前后IL-8、TNF-α、TGF-β1、VEGF值。
1.5 统计学方法采用SPSS 19.0与SAS 9.0软件进行统计学分析，选用重复测量的方差分析，包含多变量方差分析、Mauchly球形检验、主体内对比的检验(重复测量资料随时间的变化趋势)、主体间效应的检验，比较两组治疗前后炎症细胞因子水平。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 组间效应、时间因素及交互作用分析多变量方差分析结果显示，时间因素差异有统计学意义(P=0.00 < 0.05)；测量时间与测试组(对照组、治疗组)的交互作用差异有统计学意义(P=0.00 < 0.05)。可认为治疗组与对照组各指标之间不全相同，差异有统计学意义；不同时间之间各指标水平不全相同，差异有统计学意义，且时间因素与分组因素之间存在交互作用。
2.2 球形度检验结果Mauchly球形检验结果显示：近似卡方值=25.91，P=0.00 < 0.05，资料的协方差矩阵不满足球形对称条件，因此需要采用校正系数。校正后的自由度依次为2.121(0.707×3)，2.546(0.849×3)，1.000(0.333×3)。检验结果显示：测试时间差异有统计学意义，时间与测试组差异有统计学意义。通过对组内对比的检验，重复测量资料随时间的变化趋势表现为：重复测量后测试组的水平数据与时间变化存在差异性(P < 0.001)。
2.3 治疗前及治疗后不同时间两组各指标差异分析综合治疗组与对照组在5个测试时间点的重复测量方差分析结果发现，两组在IL-8、TNF、TGF、VEGF因子水平上呈现统计学差异(P < 0.001)，这种显著性差异随着治疗时间推移逐渐增强。
IL-8水平数据在两组患者治疗前和治疗后存在下降趋势；治疗前和治疗3个月后的下降水平差异性不强；6个月后，治疗组IL-8水平数据呈现持续下降趋势，下降幅度明显大于对照组，差异性逐渐增强(P < 0.001)，见表 2。
| 组别 | 治疗前 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 |
| 治疗组 | 41.18±8.11 | 38.82±8.92 | 33.87±4.50ab | 28.54±4.35ac | 24.56±3.44ad |
| 对照组 | 39.93±7.92 | 37.64±8.02 | 35.87±5.21 | 34.14±4.89 | 32.85±4.83 |
| a: P < 0.001，与对照组比较；b: P < 0.001，与治疗组3个月比较；c: P < 0.001，与治疗组6个月比较；d: P < 0.001，与治疗组9个月比较 | |||||
TNF-α水平数据在两组患者治疗前和治疗后存在下降趋势；治疗前和治疗3个月后的下降水平存在差异，但差异无统计学意义(P>0.05)；6个月后，治疗组TNF-α水平数据呈现持续下降趋势，下降幅度明显大于对照组，存在统计学差异(P < 0.001)，见表 3。
| 组别 | 治疗前 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 |
| 治疗组 | 24.51±6.41 | 22.85±5.03 | 19.86±4.51ab | 15.62±3.31ac | 11.42±3.02ad |
| 对照组 | 24.61±5.03 | 23.06±5.21 | 22.42±5.27 | 20.56±4.05 | 19.25±3.62 |
| a: P < 0.001，与对照组比较；b: P < 0.001，与治疗组3个月比较；c: P < 0.001，与治疗组6个月比较；d: P < 0.001，与治疗组9个月比较 | |||||
TGF-β水平数据在两组患者治疗前和治疗3个月下降水平存在差异，但无统计学意义(P>0.05)；6个月后，治疗组与对照组TGF-β水平均呈现下降趋势，治疗组TGF-β呈现下降趋势明显，幅度大于对照组，有统计学差异(P < 0.001)，见表 4。
| 组别 | 治疗前 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 |
| 治疗组 | 18.59±3.42 | 17.28±4.03 | 15.68±3.20ab | 13.72±2.91ac | 11.61±2.52ad |
| 对照组 | 19.19±3.83 | 18.62±4.10 | 17.73±3.15 | 16.89±3.02 | 15.98±2.66 |
| a: P < 0.001，与对照组比较；b: P < 0.001，与治疗组3个月比较；c: P < 0.001，与治疗组6个月比较；d: P < 0.001，与治疗组9个月比较 | |||||
VEGF水平数据在两组患者治疗前和治疗3个月之间差异无统计学意义(P>0.05)；第3个月后治疗组与对照组VEGF水平均呈现上升趋势，治疗组VEGF上升坡度大于对照组，上升趋势明显，有统计学差异(P < 0.001)，见表 5。
| 组别 | 治疗前 | 3个月 | 6个月 | 9个月 | 12个月 |
| 治疗组 | 84.51±9.21 | 86.28±9.56 | 89.81±9.03ab | 93.51±9.16ac | 96.98±9.13ad |
| 对照组 | 82.04±8.22 | 84.42±8.81 | 85.91±9.46 | 86.79±9.35 | 89.01±9.24 |
| a: P < 0.001，与对照组比较；b: P < 0.001，与治疗组3个月比较；c: P < 0.001，与治疗组6个月比较；d: P < 0.001，与治疗组9个月比较 | |||||
3 讨论
肺气肿是COPD在组织病理方面的表现，指终末细支气管远端发生持久性异常的气腔扩大，肺泡壁破坏而无明显纤维化。传统的观点曾认为肺纤维化和肺气肿是两种相互独立的、不能并存的疾病类型，它们的临床特征，病理改变，治疗和预后都不相同。近年研究表明，在COPD的病理转变中，肺间质纤维化是COPD极其普遍的病理性结局和必然趋势[11]。细胞因子是机体免疫系统的重要调节系统。IL-8在慢性肺损伤过程中起着极其重要的直接和间接作用，它可直接破坏肺的结构和促进中性粒细胞、巨噬细胞、单核细胞及淋巴细胞等炎症细胞的趋化、黏附、聚集、激活及脱颗粒并释放溶酶体酶、蛋白水解酶等炎性介质，实现针对气道、肺泡壁、肺实质和肺血管的慢性损伤[12]。TNF-α是一种有明显的纤维化活性的多功能细胞因子，它被认为是引起不同呼吸系统疾病的各种肺部和全身症状的重要介质。无论是在人类和动物模型，已发现在慢性阻塞性肺病患者中痰、支气管肺泡灌洗液和外周血中TNF-α的高水平表达。TNF-α是一种细胞毒细胞因子，涉及肺纤维化的多个方面。一方面它可促进炎症细胞的聚集、浸润，增加超氧化物剂，破坏溶酶体，导致溶酶体酶释放，破坏肺组织结构；另一方面可间接通过TGF-β1或PDGF诱导途径，介导其他炎症因子和细胞因子的表达，放大并扩展其自身的免疫效应，还可刺激成纤维细胞的增殖，最后导致纤维化[13]。在动物实验中由于肺部TNF-α的过度表达，产生了这种纤维化和肺气肿的复合物的表型[14]。大量基础实验和临床研究表明，TGF-β是最有效的促纤维化因子之一，在IPF的发病机制中起着非常重要的作用。TGF-β1诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞，上皮细胞向成纤维细胞转化，细胞外基质分子的合成，最终形成肺间质的胶原沉积等纤维化的病理学改变[15]。此外TGF-β1可趋化炎症细胞、成纤维细胞等细胞，使炎性细胞因子增多，同时产生更多的TGF-β，有自身扩增的作用[16]。VEGF是一种特异地作用于血管内皮细胞的生长因子，具有促进血管内皮细胞增殖、刺激体内新生血管生成、促进血管通透性增加及维持血管正常状态和完整性的功能，它通过细胞凋亡的机制在COPD和肺纤维化的形成中起重要作用[17]。多种因素如吸烟、低氧、炎症刺激物TNF-α等可促进VEGF及其受体表达[18]。上述因素反复刺激气道上皮细胞及血管内皮细胞，在早期能代偿性增生并大量分泌VEGF。但是，对于CPFE患者，因为肺部实质细胞严重破坏，VEGF作为一种保护细胞免于被凋亡的因子而显著下降[19]。
N-乙酰半胱氨酸(N-acetylcysteine, NAC)是一种黏液溶解剂，随着对N-乙酰半胱氨酸药理作用的深入研究，发现它除了有溶解痰液作用，还拥有较强的抗炎、抗氧化和抗纤维化作用。N-乙酰半胱氨酸能抑制人呼吸道上皮细胞的核因子(NF-κB)，肿瘤坏死因子(TNF-α)的激活，阻止炎性细胞因子的启动，阻断上皮细胞和巨噬细胞释放炎症因子，中性粒细胞在肺的聚集受到抑制，对吞噬细胞和中性粒细胞所产生的活性代谢所致的肺部损伤NAC起到了保护作用。本研究采用多变量重复测定方差分析观察了N-乙酰半胱氨酸对CPFE患者血清炎症细胞因子的影响。本研究分析了两测试组细胞因子在不同时间点上总体差异性，结果也显示随着治疗时间的推移，各个因子水平也在发生变化，且这种变化与治疗时间的变化是存在相关性的，且治疗时间在6个月后，这种相关性更显著。
结果表明，对于CPFE患者，NAC的效果随着时间的推移发生变化，具体体现在因子IL-8、TNF-α、TGF-β1、VEGF水平。IL-8、TNF-α、TGF-β1是促炎、促纤维化因子，VEGF也与炎症反应有关。本研究表明，治疗组第3个月，因子IL-8、TNF-α、TGF-β1、VEGF水平与治疗组治疗前和对照组治疗第3个月比较均无明显差异。CPFE患者由于可能存在持续的炎症反应和纤维化过程，虽然NAC有抗炎、抗纤维化的作用，但在治疗早期，由于NAC干预时间不够，NAC的抗炎、抗氧化作用不足以使IL-8、TNF-α、TGF-β1、VEGF水平有明显的改善，使我们从细胞因子的角度看不出NAC对CPFE的效果。随着服药时间的延长，因子IL-8、TNF-α、TGF-β1水平在治疗组第6个月分别与治疗组第3个月比较明显下降，同时与对照组第6个月比较下降有统计学意义；VEGF水平在治疗组第6个月与治疗组第3个月比较明显上升，同时与对照组第6个月比较上升有统计学意义。且随着服药时间的延长，治疗组因子IL-8、TNF-α、TGF-β1水平与治疗前一时间点水平比较下降越明显，因子IL-8、TNF-α、TGF-β1水平在第9个月和第12个月分别与对照组同一时间点比较下降有统计学意义；VEGF水平与治疗前一时间点水平比较上升越明显，VEGF水平第9个月和第12个月与对照组同一时间点比较升高有统计学意义。表明用NAC治疗达到6个月以后，对于CPFE患者，NAC抗炎、抗纤维化的作用逐渐体现出来，NAC对CPFE患者血清上述炎症细胞因子的表达改善越明显，从而使我们从细胞因子的角度看出NAC对CPFE显著的抗炎、抗纤维化效果。由此可以推断，NAC对CPFE患者的抗炎、抗纤维化的作用机制，可能与降低血清中IL-8、TNF-α、TGF-β1等细胞因子，提高VEGF等细胞因子有关，还与NAC的疗程有关。抑制IL-8、TNF-α、TGF-β1，增强VEGF可能是NAC对于CPFE患者抗炎、抗纤维化的作用机制之一。因此，对于CPFE患者，在临床应用NAC时，可根据患者情况尽可能长疗程的使用NAC，推荐治疗剂量为600 mg/次，每日3次，疗程6个月以上。
| [1] | LIN H, JIANG S. Combined pulmonary fibrosis and emphysema (CPFE):an entity different from emphysema or pulmonary fibrosis alone[J]. J Thorac Dis, 2015, 7(4): 767–779. DOI:10.3978/j.issn.2072-1439.2015.04.17 |
| [2] | COTTIN V, NUNES H, BRILLET P Y, et al. Combined pulmonary fibrosis and emphysema:a distinct underrecognised entity[J]. Eur Respir J, 2005, 26(4): 586–593. DOI:10.1183/09031936.05.00021005 |
| [3] | TASAKA S, MIZOGUCHI K, FUNATSU Y, et al. Cytokine profile of bronchoalveolar lavage fluid in patients with combined pulmonary fibrosis and emphysema[J]. Respirology, 2012, 17(5): 814–820. DOI:10.1111/j.1440-1843.2012.02182.x |
| [4] | EL-MEGHARBEL S M, HAMZA R Z, REFAT M S. Synthesis, chemical identification, antioxidant capacities and immunological evaluation studies of a novel silver(I) carbocysteine complex[J]. Chem Biol Interact, 2014, 220: 169–180. DOI:10.1016/j.cbi.2014.06.024 |
| [5] | JANKOWICH M D, SHARON R. Combined pulmonary fibrosis and emphysema alters physiology but has similar mortality to pulmonary fibrosis without emphysema[J]. Lung, 2010(5): 365–373. DOI:10.1007/s00408-010-9251-6 |
| [6] | XU L, BIAN W, GU X H, et al. Differing expression of cytokines and tumor markers in combined pulmonary fibrosis and emphysema compared to emphysema and pulmonary fibrosis[J]. COPD, 2017, 14(2): 245–250. DOI:10.1080/15412555.2017.1278753 |
| [7] | FAGHIHI M, ALIZADEH A M, KHORI V, et al. The role of nitric oxide, reactive oxygen species, and protein kinase C in oxytocin-induced cardioprotection in ischemic rat heart[J]. Peptides, 2012, 37(2): 314–319. DOI:10.1016/j.peptides.2012.08.001 |
| [8] | CICCARESE F, ATTINÁ D, ZOMPATORI M. Combined pulmonary fibrosis and emphysema (CPFE):what radiologist should know[J]. Radiol Med, 2016, 121(7): 564–572. DOI:10.1007/s11547-016-0627-4 |
| [9] |
中华医学会呼吸病学分会. 特发性肺(间质)纤维化诊断和治疗指南(草案)[J].
中华结核和呼吸杂志, 2002, 25(7): 387–389.
The Chinese Medical Association for Respiratory Diseases. Guidelines for the diagnosis and treatment of idiopathic pulmonary(interstitial)fibrosis (Draft)[J]. Chin J Tuberc Respir Dis, 2002, 25(7): 387–389. |
| [10] |
杨天芸, 宋琳, 蔡蓉, 等. 肺纤维化合并肺气肿的临床表现及影像学特点[J].
临床肺科杂志, 2015, 20(11): 2017–2019, 2020.
YANG T Y, SONG L, CAI R, et al. The clinical and imaging features of combined pulmonary fibrosis and emphysema[J]. Clin Pulmonary J, 2015, 20(11): 2017–2019, 2020. DOI:10.3969/j.issn.1009-6663.2015.11.025 |
| [11] |
胡安邦, 李卫青. 慢性阻塞性肺疾病合并肺纤维化的中西医研究进展[J].
山西中医, 2012, 28(6): 57–58, 62.
HUA B, LI W Q. The progress of Chinese and Western Medicine on chronic obstructive pulmonary disease combined with pulmonary fibrosis[J]. Shanxi Chin Med, 2012, 28(6): 57–58, 62. DOI:10.3969/j.issn.1000-7156.2012.06.031 |
| [12] | GAO J, ZHAN B. The effects of Ang-1, IL-8 and TGF-β1 on the pathogenesis of COPD[J]. Mol Med Rep, 2012, 6(5): 1155–1159. DOI:10.3892/mmr.2012.1059 |
| [13] | ROGLIANI P, MURA M, MATTIA P, et al. HRCT and histopathological evaluation of fibrosis and tissue destruction in IPF associated with pulmonary emphysema[J]. Respir Med, 2008, 102(12): 1753–1761. DOI:10.1016/j.rmed.2008.07.010 |
| [14] | LUNDBLAD L K A, Thompson-Figueroa J, Leclair T, et al. Tumor necrosis factor-α overexpression in lung disease[J]. Am J Respir Critical Care Med, 2005, 171(12): 1363–1370. DOI:10.1164/rccm.200410-1349oc |
| [15] | WILLIS B C, BOROK Z. TGF-beta-induced EMT:mechanisms and implications for fibrotic lung disease[J]. Am J Physiol Lung Cell Mol Physiol, 2007, 293(3): L525–L534. DOI:10.1152/ajplung.00163.2007 |
| [16] | LI X, LIU L, SHEN Y, et al. MicroRNA-26a modulates transforming growth factor beta-1-induced proliferation in human fetal lung fibroblasts[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2014, 454(4): 512–517. DOI:10.1016/j.bbrc.2014.10.106 |
| [17] |
郑洪. 血管内皮生长因子与呼吸系统疾病[J].
临床荟萃, 2008, 23(4): 302–304.
ZHENG H. Vascular endothelial growth factor and respiratory system disease[J]. Clin Metatol, 2008, 23(4): 302–304. DOI:10.3969/j.issn.1004-583X.2008.04.044 |
| [18] | KRISTAN S S, MARC M M, KERN I, et al. Airway angiogenesis in stable and exacerbated chronic obstructive pulmonary disease[J]. Scand J Immunol, 2012, 75(1): 109–114. DOI:10.1111/j.1365-3083.2011.02623.x |
| [19] |
郭瑛, 李燕芹, 刘斌, 等. 血管内皮功能变化与慢性阻塞性肺疾病的关系[J].
上海交通大学学报(医学版), 2010, 30(9): 1152–1155.
GUO Y, LI Y Q, LIU B, et al. Relationship between vascular endothelial function and chronic obstructive pulmonary disease[J]. J Shanghai Jiaotong Univ(Med Sci), 2010, 30(9): 1152–1155. DOI:10.3969/j.issn.1674-8115.2010.09.032 |