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四种中药单体成分体外抑制沙眼衣原体作用的筛查
张燕, 鲜雨琦, 高磊琼, 沈犁, 华子瑜     
重庆 400014,重庆医科大学附属儿童医院儿科研究所,儿童发育疾病研究教育部重点实验室;儿童发育重大疾病国家国际科技合作基地;儿科学重庆市重点实验室
[摘要] 目的 利用沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)菌株Ct-L2/PompA-GFP,快速筛查黄连素、雷公藤红素、黄芩苷、三羟黄酮体外抑制Ct作用。方法 通过CCK-8检测药物细胞毒性作用,得出50%细胞毒性药物浓度(50% cytotoxic concentration,CC50);通过菌株Ct-L2/PompA-GFP快速筛查四种中药体外抑制Ct的效果,得出50%抑制率药物浓度(50% inhibitory concentrations,IC50);使用治疗指数(therapeutic index,TI)综合评估药物安全性和有效性。选择安全药物浓度(≥90%细胞存活率),通过活细胞实时观察、免疫荧光染色和末端包涵体形成单位测定,再次确认药物的细胞毒性和体外抑制Ct作用。结果 黄连素、雷公藤红素、黄芩苷、三羟黄酮的CC50(mean±SD)分别为(97.0±2.2)、(2.0±0.08)、(557.1±29.1)、(205.8±9.1);IC50(mean±SD)分别为(2.73±0.09)、(0.60±0.02)、(260.0±10.2)、(60.9±3.8);TI分别为35.5、3.3、2.1、3.4,提示黄连素更安全有效。黄连素、雷公藤红素、黄芩苷、三羟黄酮安全药物浓度分别为10.0、0.2、80.0、10.0 μmol/L,结果显示黄连素具有明显的Ct抑制作用(P<0.000 1),其他3种药物无明显抑制Ct作用。结论 黄连素可能成为抑制Ct安全有效的药物。
[关键词] 中药     黄连素     沙眼衣原体    
Comparison of inhibitory effects of 4 effective components of traditional Chinese drugs on Chlamydia trachomatis in vitro
ZHANG Yan , XIAN Yuqi , GAO Leiqiong , SHEN Li , HUA Ziyu     
Institute of Pediatrics, Key Laboratory of Child Development and Disorders of Ministry of Education, China International Science and Technology Cooperation Base of Child Development and Critical Disorders, Chongqing Key Laboratory of Pediatrics, Children ' s Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400014, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81370777) and the Sci-tech Project for TCM Research of Chongqing Municipal Health Bureau (ZY201702069)
Corresponding author: HUA Ziyu, E-mail: h_ziyu@163.com
[Abstract] Objective To compare the inhibitory effects of the effective components derived from 4 traditional Chinese drugs, namely berberine (BER), celastrol (CEL), baicalin, and baicalein, on Chlamydia trachomatis (Ct) Ct-L2/PompA-GFP strain in vitro. Methods CCK-8 assay was used to determine the 50% cytotoxic concentration (CC50) of the 4 agents in human cervical cancer HeLa 229 cells according to the dose-cytotoxicity curve. The inhibitory effect of each agent on Ct was estimated by observing the decrease in GFP intensity, and the 50% inhibitory concentration (IC50) of each agent was calculated based on the dose-inhibition curve. The therapeutic index (TI) was used to assess both the safety and efficacy of the 4 agents. Using the safe drug concentration (defined as a ≥90% cell viability in HeLa 229 cells), the safety and efficacy of the agents for inhibiting Ct were further assessed by observing the live cells, immunofluorescence assay (IFA) and endpoint inclusion-forming unit assay (IFUs). Results The CC50s of BER, CEL, baicalin and baicalein were 97.0±2.2, 2.0±0.08, 557.1±29.1, and 205.8±9.1, respectively and their IC50s were 2.73±0.09, 0.60±0.02, 260.0±10.2, and 60.9±3.8, respectively. The TIs of BER, CEL, baicalin and baicalein were 35.5, 3.3, 2.1, and 3.4, respectively, showing a better safety and a stronger efficacy of BER among the 4 agents. The safe concentrations of BER, CEL, baicalin and baicalein in HeLa 229 cells were 10, 0.2, 80, and 10 μmol/L, respectively. The results showed that BER could markedly inhibit Ct (P < 0.0001), while the other 3 agent did not produce obvious inhibitory effect on Ct. Conclusion BER can obviously inhibit Ct in vitro and may serve as a potent anti-chlamydia drug with a good safety profile.
[Key words] traditional Chinese drugs     berberine     Chlamydia trachomatis    

沙眼衣原体(Chlamydia trachomatis, Ct)是一种专性胞内寄生菌,可在宿主细胞内形成包涵体,为其提供生长繁殖所需的特殊微环境。包涵体内有不同发育周期的Ct,包括原体(elementary body,EB)和网状体(reticulate body,RB)。EB能够黏附并侵入敏感宿主细胞,是沙眼衣原体的感染传播形式。EB侵入宿主细胞后很快转化成RB,RB的特征是高代谢状态并进行反复二分裂增殖,是沙眼衣原体的扩增形式。最后RB又分化为EB,EB和RB相互转化,形成Ct特殊的双相发育周期[1-4]。由于Ct属于严格胞内寄生菌,一定程度上限制了对其致病机制的研究,2011年有研究报道了Ct转化系统,通过穿梭质粒实现对Ct的基因操控,从而加速了对Ct生长发育及致病机制的研究[5],不过该研究报道的穿梭质粒的启动子(nmP)是来源于脑膜炎双球菌(Neisseria meningitidis)启动子,不是Ct自身表达的启动子。2013年AGAISSE报道了Ct自身蛋白IncD的启动子实现对Ct用绿色荧光蛋白(GFP)标记[6]。我们前期报道了Ct-L2/PompA-GFP菌株,它不仅是Ct自身蛋白ompA的启动子调控表达的,而且能够在Ct发育各个时期实现比AGAISSE的菌株更高荧光强度的GFP表达[7]。由于GFP的动态表达代表Ct的生长发育,GFP的变化可作为抑制Ct药物效果的报告分子,实现抑制Ct生长发育潜在药物的快速大量筛选[8],这种方法相较于传统方法更加方便快捷。

另一方面,Ct反复感染及合并多重感染情况下,出现异型性抗生素抵抗而引起的治疗失败的报道亦不少见[9-11],表明衣原体感染疾病的防治工作仍面临巨大挑战,因此寻找关于衣原体新的治疗方法十分重要。中药凝聚了数千年来我国历代人民的智慧,在沙眼衣原体疾病治疗上,有学者筛选了多种利水中药对Ct的抑制作用,发现有不同程度的体外抗Ct作用[12],也有学者报道了对28种中草药进行Ct的敏感性体外筛选[13],但是这些中药体外抗衣原体的有效成分仍不清楚。黄连素(Berberine Chloride,BER)、雷公藤红素(Celastrol,CES)、黄芩苷(Baicalin)、三羟黄酮(Baicalein)分别是中草药黄连、雷公藤、黄芩的单体成分,其中黄芩苷水解产生三羟黄酮[14-15]。文献报道它们具有抗炎、抗病毒、抗菌作用,提示它们可能抑制Ct生长发育,但以上四种中药单体成分体外抑制Ct生长发育的效果尚不清楚。本文旨在通过评估药物的细胞毒性作用以及利用Ct-L2/PompA-GFP菌株对以上四种中药单体成分体外抑制Ct作用效果进行筛查评估,希望可以发现抑制Ct生长发育的药物。

1 材料和方法 1.1 主要试剂及仪器

DMEM购于Hyclone公司;胎牛血清购于GIBCO公司;氨苄青霉素、黄连素(Berberine chroride)、雷公藤红素(Celastrol)、黄芩苷(Baicalin)、三羟黄酮(baicalein)试剂购于Sigma公司;CCK-8试剂购于碧云天公司。MOMP单克隆抗体由波士顿大学张友逊教授赠。酶标仪(BioTek),激光扫描共聚焦显微镜(Nikon,A1R si),倒置荧光显微镜(Nikon,Ti-S)。

1.2 菌株和细胞

本实验用菌株为沙眼衣原体Ct-L2/PompA-GFP。细胞为HeLa 229人类宫颈癌细胞系(CCL2,ATCC)。

1.3 Ct感染

将适量Ct-L2/PompA-GFP的EB加入对数生长期HeLa 229细胞,控制感染率为50%,37 ℃,2 800×g,离心45 min。离心完成后弃上清,更换为5 μg/mL氨苄青霉素,10%FBS DMEM培养基,置于37 ℃,5% CO2孵箱中继续培养。

1.4 细胞毒性检测方法

96孔板按每孔5×103接种细胞,细胞达对数生长期时,加入或不加入Ct感染处理,吸弃上清然后加入不同浓度的药物,42 h后,加入CCK-8试剂,1 h后酶标仪测定450 nm光密度。根据对照组计算细胞存活百分率。

1.5 吸光光度计快速检测绿色荧光(GFP)强度方法

将各个实验组及对照组Ct感染的细胞,培养到预定时间,吸弃上清洗涤后更换为PBS,置于吸光光度计上,将激发光波长设定为480 nm,发射光波长设定为520 nm读取GFP荧光强度。

1.6 免疫荧光检测(immunofluorescence assays,IFA)

Ct感染的HeLa 229细胞用2%多聚甲醛室温固定30 min,0.1% Triton X-100透膜30 min。PBS洗3遍后,3%BSA封闭室温1 h,抗MOMP一抗(L21-45)4 ℃过夜孵育。PBST洗3遍后,荧光二抗室温作用2 h,PBST洗3遍后,封片激光扫描共聚焦显微镜拍照。

1.7 活细胞实时观察(Live image)

Ct感染的HeLa 229细胞,用药干预处理或未处理组,作用42 h后,加入Hoechst 33342,直接激光扫描共聚焦显微镜拍照。

1.8 末端包涵体形成单位测定(endpoint inclusion-forming unit assay, IFUs)

Ct感染的HeLa 229细胞,用药干预处理或未处理组,作用42 h后,裂解收获,然后系列稀释感染HeLa 229细胞。42 h后,IFA染色,荧光显微镜观察计数IFUs,计算每1 mL IFUs。

1.9 统计学方法

数据以x±s表示,采用GraphPad Prism软件进行线性及非线性回归分析,计算CC50、IC50及非配对t检验统计分析。P<0.05表示有显著性差异。

2 结果 2.1 四种中药单体成分细胞毒性及体外抑制沙眼衣原体作用

将不同浓度梯度的4种中药(结构式详见图 1A)分别加入HeLa 229细胞中,通过CCK-8方法检测活细胞水平,与溶剂对照组相比,评估药物的细胞毒性作用。由于各个药物本身特性的原因,对细胞的毒性及Ct抑制效果有很大不同,根据前期预实验确定各种药物浓度范围:黄连素为0~150 μmol/L(抑制Ct实验为0~20 μmol/L);雷公藤红素为0~3.5 μmol/L;黄芩苷为0~1 000 μmol/L;三羟黄酮为0~1 000 μmol/L。不同药物浓度与其对应的活细胞百分比绘制药物浓度-细胞毒性曲线(图 1),计算50%细胞毒性药物浓度(50% cytotoxic concentration,CC50)(详见表 1)。用不同浓度的四种中药分别处理Ct感染的HeLa 229细胞,通过读取GFP荧光强度,与溶剂处理对照组GFP荧光强度对比,计算GFP抑制率。由于GFP代表Ct,通过不同药物浓度及其对应的GFP抑制率绘制药物抑制Ct曲线(图 1B),计算得出各个药物50%抑制率药物浓度(50% inhibition concentration,IC50)(详见表 1)。

图 1 四种中药单体成分化学结构式、药物浓度-细胞毒性曲线图及药物浓度-抑制曲线图

A:对照(DMSO),B:黄连素,C:雷公藤红素,D:黄芩苷,E:三羟黄酮 图 2 四种药物安全药物浓度处理Ct感染 HeLa 229细胞的活细胞实时成像

表 1 四种中药单体成分CC50、IC50和TI汇总
药物名称 CC50(x±s) IC50(x±s) TI(CC50/IC50)
黄连素 97.0±2.2 2.7±0.09 35.5
雷公藤红素 2.0±0.08 0.6±0.02 3.3
黄芩苷 557.1±29.1 260.0±10.2 2.1
三羟黄酮 205.8±9.1 60.9±3.8 3.4

2.2 四种中药单体成分安全浓度下的细胞毒性作用及体外抑制沙眼衣原体作用

治疗指数(therapeutic index,TI)可评估一个药物的安全有效性,根据TI=CC50/IC50,可计算得出四种中药的TI,结果显示黄连素的TI值较其他三种药物更高(详见表 1)。药物有应用价值的前提是安全有效,选择90%细胞存活率的药物浓度作为安全药物浓度,黄连素、雷公藤红素、黄芩苷、三羟黄酮的安全药物浓度分别为20、0.2、80、10 μmol/L。由于黄连素IC50为(2.73±0.09),为了更加安全,黄连素的安全药物浓度为10 μmol/L。使用各个药物的安全药物浓度分别处理Ct感染的HeLa 229细胞,42 h后,通过活细胞实时观察,发现4种中药在安全浓度下对细胞无明显毒性作用,黄连素处理组几乎观察不到绿色荧光蛋白表达,提示黄连素可以抑制Ct。同时通过经典的免疫荧光方法(IFA)标记Ct特异的MOMP蛋白,观察药物对Ct生长发育的影响,结果与活细胞实时观察的情况一致(图 3)。运用末端包涵体形成单位测定方法检测药物处理Ct感染的HeLa 229细胞后,子代EB滴度的变化,定量分析药物对Ct的抑制作用。发现黄连素对Ct的生长发育有明显抑制作用,其他3种药物对Ct生长发育无明显抑制作用(图 4)。

图 3 四种药物安全药物浓度处理Ct感染HeLa 229细胞的IFA染色

A:对照(DMSO), B:黄连素, C:雷公藤红素, D:黄芩苷, E:三羟黄酮;a: P<0.000 1,与黄连素组比较 图 4 四种药物安全药物浓度处理Ct感染的HeLa 229细胞后,IFUs检测子代EB滴度

2.3 不同感染滴度条件下黄连素体外对沙眼衣原体的抑制作用

考虑到药物抑制Ct的作用可受到多方面的影响,如感染滴度,感染状态等,我们检测了不同感染滴度下(500~50 000 IFUs)10 μmol/L黄连素对Ct生长发育的影响,发现GFP荧光强度抑制率均可达90%以上,提示黄连素对不同滴度的Ct感染均有明显的抑制作用(图 5)。

图 5 黄连素对不同感染滴度Ct的抑制作用

3 讨论

Ct是一种严格胞内寄生菌,目前尚无疫苗,其治疗方法主要使用胞内穿透性抗菌药物,如阿奇霉素和多西环素等。文献报道衣原体感染有12.8%阿奇霉素治疗失败[16],其具体原因尚未明确。另外,在Ct反复感染及合并多重感染情况下,可出现部分Ct对抗生素敏感,部分Ct对抗生素不敏感的现象,即异型性抗生素抵抗,从而引起治疗失败[9-11],说明Ct防治仍面临很大挑战,急需开发新的有效药物。考虑到Ct致病性主要是引起机体免疫炎症反应,提示抗炎、抗菌、抗病毒药物可能对Ct有抑制作用。因此,选取了黄连素、雷公藤红素、黄芩苷、三羟黄酮四种中药单体成分,筛查其体外对Ct的抑制作用。传统的Ct药物作用效果评价筛选方法是通过裂解药物作用感染Ct的细胞,梯度稀释后再次感染细胞,待完成发育周期后固定细胞并通过使用荧光标记抗体标记Ct特异的抗原,荧光显微镜下计数Ct子代数目实现评估。该方法费时费力,不利于多个药物简单快速地筛选。得益于Ct相关基因操作技术的发现,陆续报道了GFP标记Ct的各种方法。课题组前期报道了通过基因工程转化得到Ct-L2/PompA-GFP菌株,该菌株有两大优势:①Ct自身携带的启动子控制GFP的表达,且这个启动子表达于Ct发育周期中各个时期;②该启动子启动表达的GFP荧光强度较强可以敏感地代表反映Ct有无[7]。本文主要利用该菌株体外快速筛选潜在抑制Ct的四种中药药物[8]。首先评估药物的安全性和有效性,通过治疗指数综合评价药物,治疗指数大的药物相对治疗指数小的药物安全[17]。发现黄连素的TI较高,雷公藤红素、黄芩苷、三羟黄酮的TI均较低,提示黄连素相较于其他三种药物更安全有效。在安全药物使用浓度下,通过活细胞实时观察、免疫荧光染色和末端包涵体形成单位测定明确了黄连素可以明显抑制Ct,其他3种药物对Ct无明显抑制作用。此外,不同Ct感染滴度下,黄连素均可明显抑制Ct的作用。因此,黄连素是治疗Ct的潜在药物。文献报道黄连素临床用药治疗非淋菌性尿道炎及临床血清检测治疗效果一致,沙眼衣原体清除率为100%。另有文献报道,32例确诊沙眼衣原体感染患者,黄连素治疗有效率为0.2%[18]。考虑到Ct的隐性感染及高复发,需要更长时间更严谨的观察和检测来评估黄连素体内抑制Ct的效果。黄连素价格低廉、口服易吸收且作用广泛,是中西医临床常用药[19]。如若明确黄连素体内抑制衣原体效果,黄连素将会广泛应用于衣原体感染治疗,为衣原体治疗提供一种新的方式。另外,黄连素抑制Ct的具体作用机制尚不明确。有文献报道黄连素可以通过PI3K下调MMP3和MMP9抑制肺炎衣原体感染诱导的血管平滑肌迁移[20]。另有文献报道黄连素具有直接的抑菌作用,但机制目前不清[21]。除此之外,黄连素可以抑制mTOR依赖的HIF-1α蛋白合成减缓葡萄糖代谢、抑制MEK/ERK信号通路发挥抗病毒作用、诱导细胞发生自噬性细胞死亡或细胞凋亡[22-24]。事实上,作为严格胞内寄生菌,Ct的存活依赖于宿主细胞的能量、原料供应,Ct为了利于其存活可以激活调控宿主细胞内信号通路,如PI3K通路、稳定肿瘤基因MYC等方式实现抵抗宿主细胞凋亡[25-27]。黄连素是直接抑制Ct生长发育还是通过诱导宿主细胞凋亡,拮抗Ct作用,改变Ct赖以生存的宿主细胞内环境状态间接抑制Ct生长发育,接下来的工作我们将进一步探讨。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201712245
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张燕, 鲜雨琦, 高磊琼, 沈犁, 华子瑜.
ZHANG Yan, XIAN Yuqi, GAO Leiqiong, SHEN Li, HUA Ziyu.
四种中药单体成分体外抑制沙眼衣原体作用的筛查
Comparison of inhibitory effects of 4 effective components of traditional Chinese drugs on Chlamydia trachomatis in vitro
第三军医大学学报, 2018, 40(14): 1271-1278
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(14): 1271-1278
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201712245

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收稿: 2017-12-27
修回: 2018-04-13

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