2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)军事预防医学系营养与食品卫生学教研室
2. Department of Nutrition and Food Safety, Faculty of Military Preventive Medicine, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
过氧化物酶体增殖物激活受体(peroxisome proliferator- activated receptor, PPAR)是Ⅱ型核受体超家族成员之一,有α、β/δ和γ 3种亚型。尽管各亚型的组织分布及表达量决定其所调节代谢的侧重点有所不同,但都与机体糖脂代谢密切有关,其中PPARγ是临床上常用的糖尿病治疗药物胰岛素增敏剂类药物噻唑烷二酮类的作用靶标。新近研究发现,PPARγ激活不仅具有治疗糖尿病的作用,还具有明显的抗肿瘤作用。PPARγ激动剂罗格列酮、吡格列酮和15d-PGJ2d以及某些黄酮类化合物(如染料木黄酮、木犀草素等)可通过激活PPARγ对胃癌、乳腺癌、前列腺癌等具有明显的抑制增殖、诱导凋亡和抗肿瘤血管生成等作用[1-3]。因此,PPARγ被认为是肿瘤治疗的新靶点,PPARγ激动剂也因此被认为是潜在的肿瘤化疗药物[4-5]。
蛇葡萄素(ampelopsin, AMP)又名二氢杨梅素(dihydromyricetin, DHM),是药食两用植物藤茶中含量极高的一种黄酮类化合物[6]。自古以来,我国壮族和瑶族人民有长期饮用藤茶的习惯,故其饮用安全性已得到充分证实。本课题组前期通过计算机模拟分子对接发现,与已被证实为PPARγ天然激动剂的黄酮类化合物木犀草素一样,AMP能直接与PPARγ的配体结合区结合,提示AMP可能也是一个有效的PPARγ激动剂,能直接与PPARγ的配体结合区结合,增强骨骼肌细胞对糖的摄取能力,进而改善糖尿病大鼠的胰岛素抵抗[3, 7-8]。同时有研究者还发现AMP具有明显的抑制乳腺癌细胞增殖并诱导其凋亡的作用[9-10],但AMP抗乳腺癌作用是否与其激活PPARγ有关,尚不清楚。
本研究拟采用荧光素酶报告基因检测法进一步证实AMP可直接激活PPARγ;其次以MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞为研究对象,探讨PPARγ激活在AMP诱导的乳腺癌细胞增殖抑制和凋亡中的作用,以期为将来应用AMP或饮用藤茶预防和治疗肿瘤及将AMP作为先导化合物研发新型PPARγ激动剂类抗肿瘤药物奠定理论基础。
1 材料与方法 1.1 材料人乳腺癌MCF-7、MDA-MB-231细胞株由中科院上海细胞所提供;AMP(HPLC≥98%)购自成都曼斯特公司;罗格列酮(rosiglitazone,RGZ, PPARγ特异性激动剂)、GW9962(PPARγ特异性拮抗剂)购自美国Sigma公司;荧光素酶报告基因质粒PPRE-TK-Luc由美国索克生物研究所R.Evans教授惠赠;内对照质粒phRL-CMV和双荧光素酶报告基因检测试剂盒购自美国Promega公司;Caspase-3活性检测试剂盒购自南京凯基科技有限公司;Annexin V-FITC购自上海贝博生物公司;CCK-8试剂盒购自日本同人株式会社;Bax、Bcl-2、PETN多克隆抗体购自美国Bioworld公司,Caspase-3抗体购自美国Cell Signaling公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养MCF-7、MDA-MB-231细胞分别接种于含10%小牛血清、青链霉素双抗的RPMI1640完全培养液中,37 ℃、5%CO2、100%饱和湿度条件下常规传代培养,取对数生长期细胞进行后续实验。
1.2.2 细胞转染及报告基因活性检测将处于对数生长期的MCF-7、MDA-MB-231细胞常规消化后,调整细胞数为2×105/mL,以每孔200 μL接种于96孔培养板。CO2培养箱内孵育24 h后,将报告基因质粒PPRE-TK-Luc及内对照质粒phRL-CMV转入细胞。12 h后弃上清,以PBS洗涤细胞后,按以下实验分组加入处理因素:溶剂对照组、AMP(20、40、60、80 μmol/L)处理组、RGZ(10 μmol/L)处理组、GW9662(10 μmol/L)处理组、AMP(60 μmol/L)+GW9662(10 μmol/L)联合处理组;RGZ(10 μmol/L)+GW9662(10 μmol/L)联合处理组。联合处理组中,GW9962预处理细胞10 min后再分别加入AMP、罗格列酮。每种受试物均设3个复孔,CO2培养箱内孵育24 h后,弃上清,PBS洗涤细胞后,每孔加入100 μL细胞裂解液裂解细胞。收集细胞裂解产物,取20 μL细胞裂解产物,双荧光素酶报告基因检测试剂盒对各组荧光素酶的活性进行检测,PPARγ转录活性以萤火虫荧光素酶表达值与内对照海肾荧光素酶表达值的比值来表示。
1.2.3 CCK-8检测细胞活力将处于对数生长期的MCF-7、MDA-MB-231细胞常规消化后,调整细胞密度为2×105/mL并接种于96孔培养板,每孔200 μL。CO2培养箱中常规培养24 h后,加入处理因素继续培养。按实验分组对细胞进行相应处理,完毕后加入CCK-8溶液10 μL,培养箱孵育1 h,采用酶标仪在波长450 nm处测其光密度值[D(450)]。每个浓度设3个平行孔。
1.2.4 流式细胞仪检测细胞凋亡取对数期生长的细胞,细胞分组和处理同1.2.2。药物处理后继续培养24 h,收集、洗涤细胞,按照Annexin V-FITC/PI说明书进行。所有样本避光,1 h内用流式细胞仪检测。以上操作重复3次。
1.2.5 Western blot检测细胞分组和处理同1.2.2。收集细胞并提取蛋白,参照BAC蛋白浓度测定试剂盒说明书测定蛋白含量,-70 ℃保存备用。配置分离胶及积层胶,每孔上蛋白量50 μg,80 V积层胶,120 V分离胶电泳分离蛋白质,220 mA恒流冰浴下转移至PVDF膜。室温封闭2 h,一抗(1 :1 000)轻摇孵育过夜,HRP标记的二抗(1 :10 000)室温轻摇孵育1 h。将PVDF膜正面向上平铺于一平皿内,将化学发光底物(按1 :1混匀)加于其上,Vilber多功能成像系统进行曝光。
1.2.6 Caspase-3活性检测细胞分组和处理同1.2.2。收集细胞,按试剂盒说明书进行操作,先加入200 μL冰冷的Lysis Buffer和2 μL DTT,冰浴裂解60 min,4 ℃离心1 min(10 000 r/min),收集上清液。取150 μL细胞裂解上清液,加50 μL 2×Reaction Buffer和0.5 μL DTT,再加20 μL Caspase-3 Substrate反应液,37 ℃避光孵育4 h,用荧光分光光度计测定荧光强度值(激发波长485 nm,发射波长535 nm)。
1.3 统计学分析实验数据以x±s表示,采用GraphPad Prism 5软件进行数据统计分析。单因素变量数据采用单因素方差分析,多重比较采用Dunnett’s t检验。检验水准:α=0.05。各实验均独立重复3次以上。
2 结果 2.1 AMP对PPARγ报告基因的活化呈剂量依赖关系不同浓度的AMP(20、40、60、80 μmol/L)均可明显增强MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞的荧光素酶报告基因表达活性(P<0.05),该作用与PPARγ特异性激动剂罗格列酮类似,且AMP对PPARγ报告基因的活化存在明显的剂量依赖性效应趋势(P<0.05)。PPARγ特异性抑制剂GW9662(10 μmol/L)预处理可显著降低AMP诱导的荧光素酶报告基因表达活性(P<0.05,图 1)。结果表明:与PPARγ特异性激动剂剂罗格列酮一样,AMP能激活乳腺癌细胞的PPARγ信号途径,提示AMP可能也是PPARγ天然激动剂。
2.2 AMP对乳腺癌细胞增殖和凋亡的影响
与PPARγ激动剂罗格列酮一样,分别以20、40、60、80 μmol/L处理细胞24 h后,AMP可显著抑制MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞增殖,该作用存在明显的剂量效应关系(P<0.05)。预先给予PPARγ特异性抑制剂GW9662可显著降低AMP或罗格列酮诱导的乳腺癌细胞增殖抑制(P<0.05,图 2、3)。
与PPARγ激动剂罗格列酮一样,不同浓度的AMP均可显著诱导MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞凋亡,该作用存在明显的剂量效应关系(P<0.05),GW9662预处理可显著抑制AMP、罗格列酮诱导的乳腺癌细胞凋亡作用(P<0.05,图 4、5)。
以上结果提示:与罗格列酮一样,AMP抗乳腺癌作用可能与其激活PPARγ信号通路有关。
2.3 AMP对乳腺癌细胞凋亡相关蛋白表达的影响Western blot检测结果显示,不同浓度AMP(20、40、60、80 μmol/L)、RGZ(10 μmol/L)分别处理MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞24 h后,与对照组比较,Bax、人第10号染色体缺失的磷酸酶(phosphatase and tensin homolog deleted on chromosome ten,PTEN)蛋白水平明显升高,Bcl-2蛋白水平及Bcl-2/Bax比值显著下降;AMP对Bax、PTEN、Bcl-2表达的影响存在明显的剂量效应关系(图 6)。而GW9662预处理后,与单独处理组比较,Bcl-2蛋白水平及Bcl-2/Bax比值显著上升,而Bax、PTEN表达明显下降(图 7)。以上结果提示:与PPARγ特异性激动剂罗格列酮一样,AMP可上调乳腺癌细胞中促凋亡基因Bax、PTEN蛋白表达,而显著降低抑制凋亡基因Bcl-2蛋白表达水平,且该作用与AMP诱导的PPARγ激活有关。
2.4 AMP对乳腺癌细胞Caspase-3活性的影响
结果显示,AMP、RGZ分别单独处理MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞24 h后,Caspase-3的活性较对照组均显著升高(P<0.05),同时AMP诱导的Caspase-3的活性增强存在明显的剂量效应关系;而AMP+GW9662、RGZ+GW9662联合处理细胞时,Caspase-3的活性较对应的单独处理组明显降低(P<0.05,表 1)。Western blot检测结果显示,与罗格列酮一样,AMP可明显上调Cleaved Caspase-3(即活化的Caspase-3)的表达,该作用可被GW9662减弱(图 8)。以上结果提示:AMP可显著增加乳腺癌细胞中凋亡蛋白酶Caspase-3的活性,该作用与罗格列酮类似,而且增强Caspase-3的活性与AMP诱导的PPARγ激活有关。
组别 | MDA-MB-231 | MCF-7 |
对照组 | 0.56±0.04 | 0.61±0.03 |
GW9662处理组 | 0.42±0.05 | 0.49±0.04 |
RGZ处理组 | 2.93±0.26ab | 2.89±0.19ab |
AMP(20 μmol/L)处理组 | 0.87±0.82ab | 0.83±0.64ab |
AMP(40 μmol/L)处理组 | 1.47±0.59ab | 1.36±0.46ab |
AMP(60 μmol/L)处理组 | 2.03±0.73ab | 1.94±0.53ab |
AMP(80 μmol/L)处理组 | 2.72±0.81ab | 2.67±0.62ab |
AMP(60 μmol/L)+GW9662处理组 | 0.82±0.06 | 0.73±0.05 |
RGZ+GW9662处理组 | 0.87±0.03c | 0.79±0.04c |
a:P<0.05,与对照组比较;b:P<0.05,与AMP(60 μmol/L)+ GW9662处理组比较;c:P<0.05,与RGZ处理组比较 |
3 讨论
PPARγ与其相应的配体结合进而被激活,激活后的PPARγ与靶基因启动子上的过氧化物酶体增殖物反应元件结合,调控靶基因表达水平,从而参与机体脂质代谢、糖代谢、炎症反应等多种生理功能的调节。基于PPARγ对糖脂代谢的重要调控作用,以PPARγ为靶标的罗格列酮、吡格列酮、曲格列酮等2型糖尿病治疗药物已广泛用于临床。近年来,有研究发现PPARγ在多种器官来源的恶性肿瘤细胞中有表达,其中在乳腺癌组织PPARγ的阳性率为42%,多表达于分化程度高的乳腺癌中,但表达水平远低于正常乳腺组织[11],由此推测PPARγ可能与肿瘤的发生、发展密切有关。研究表明,化学合成的PPARγ激动剂(如罗格列酮等)和某些天然植物来源的PPARγ激动剂黄酮类化合物(如白藜芦醇、染料木黄酮、木犀草素等)可通过激活PPARγ而对不同器官来源的肿瘤细胞(如胃癌、乳腺癌、前列腺癌、结肠癌、肝癌、肺癌等)具有明显的抑制增殖、诱导细胞凋亡和抗肿瘤血管生成等作用;而RNA干扰技术沉默PPARγ基因或PPARγ特异性拮抗剂GW9662预处理等可显著抑制PPARγ激活,进而抑制PPARγ激动剂的抗肿瘤作用[1-5]。PPARγ被认为是肿瘤治疗的新靶点,因此PPARγ激动剂也已被认为是潜在的肿瘤化疗药物,目前曲格列酮的抗乳腺癌和前列腺癌的研究已进入Ⅱ期临床试验,PPARγ激动剂的抗胰腺癌研究已完成Ⅰ期临床试验[4-5]。
广泛存在于蔬菜、水果中的某些黄酮类化合物(如木犀草素、山奈酚、槲皮素、染料木黄酮等)先后已被证实为PPARγ的天然激动剂,而且都被证实具有抗肿瘤作用[1-3]。这些天然植物性食物来源的PPARγ的激动剂具有安全性高、来源丰富等特点,同时还可作为先导化合物研发更高效的PPARγ激动剂类糖尿病和肿瘤治疗药物,因而备受关注。AMP是药食两用植物藤茶(也称霉茶)中含量极高的黄酮类化合物,在嫩茎叶中含量高达20%以上(以干质量计)[6]。据调查,自古以来我国壮族和瑶族人民将其幼嫩茎叶制成保健茶长期饮用,故其安全性已得到充分证实。AMP与已被证实为PPARγ激动剂的木犀草素、槲皮素等同属于黄酮醇类,它们的分子结构特征非常相似,从结构-效应关系理论推理,这些黄酮类化合物可能具有相同的生物学效应,但是木犀草素、槲皮素等黄酮类化合物在天然食物中的含量远远低于AMP,表明AMP的研发极具实际应用价值。AMP是否为PPARγ天然激动剂以及其抗乳腺癌作用是否与其激活PPARγ有关,尚不清楚。
本课题组前期通过计算机模拟的分子对接发现:与木犀草素一样,AMP能直接与PPARγ的配体结合区结合[7]。本研究进一步采用荧光素酶报告基因检测方法,结果显示,与罗格列酮一样,AMP可剂量依赖性地增强MCF-7、MDA-MB-231乳腺癌细胞的荧光素酶报告基因表达活性,且该作用能被PPARγ特异性抑制剂GW9662减弱,提示AMP对PPARγ有直接激活作用,可能也是PPARγ的天然激动剂。另外,本研究结果显示,与罗格列酮一样,AMP具有抑制乳腺癌细胞增殖并诱导细胞凋亡的作用,且该作用具有明显的剂量效应关系;PPARγ特异性抑制剂GW9662预处理可显著减弱AMP、罗格列酮诱导的乳腺癌细胞增殖抑制和凋亡作用,提示AMP的抗乳腺癌作用与其激活PPARγ相关。
PTEN是继p53后新发现的又一重要抑癌基因,其启动子中含有PPRE序列,研究已证实:PPARγ配体可通过激活PPARγ,然后直接作用于PPRE序列而上调PTEN表达水平,进而抑制细胞增殖和诱导细胞凋亡;沉默PTEN基因后,PPARγ激动剂罗格列酮、KR-62980等诱导的肿瘤细胞增殖抑制和凋亡、迁移抑制作用被阻断。已有研究表明,染料木黄酮、槲皮素和白黎芦醇可明显上调乳腺癌细胞PTEN的表达水平、下游靶分子p27的表达水平和Akt的磷酸化水平;沉默PTEN基因后,染料木黄酮诱导细胞凋亡以及上调p21表达的作用均被明显抑制[12-14]。这提示PTEN作为直接受PPARγ转录激活调控的靶基因可能是介导PPARγ和其激动剂抗肿瘤作用的关键分子。本实验结果显示,AMP、罗格列酮可显著上调PTEN蛋白表达水平,该作用可被GW9662削弱,提示AMP抗乳腺癌作用可能与其激活PPARγ,进而上调PTEN蛋白表达有关。
在细胞凋亡过程中,Bcl-2家族成员起着至关重要的作用,Bcl-2、Bax调节细胞凋亡不仅取决于各自表达水平的高低,还与Bcl-2/Bax比值有关(当比值降低时,细胞趋于凋亡)。Caspase是一组与细胞凋亡过程密切相关的半胱氨酸蛋白酶,在Caspase家族成员中Caspase-3是细胞凋亡执行的主要蛋白酶,Caspase-3活化最终引起细胞凋亡。有研究发现,罗格列酮增强氟尿嘧啶诱导结肠癌细胞凋亡的作用与其降低Bcl-2表达和上调Bax表达有关;PPARγ配体吡格列酮、15d-PGJ2可降低乙肝病毒相关的人肝癌细胞Bcl-2表达水平,促进肝癌细胞凋亡。本研究Western blot检测结果显示,与罗格列酮一样,AMP在上调乳腺癌细胞中Bax、活化的Caspase-3蛋白表达水平的同时下调Bcl-2蛋白水平以及Bcl-2/Bax比值;激活活性检测发现AMP可显著增强Caspase-3活性,以上作用均存在明显的剂量效应关系;GW9662预处理可明显削弱AMP和罗格列酮的上述作用,表明AMP诱导乳腺癌细胞凋亡与其激活PPARγ、调节Bcl-2家族成员表达水平及凋亡执行蛋白酶Caspase-3活性密切有关。另有研究发现,凋亡抵抗的乳腺癌MCF-7/ADR细胞转染PTEN质粒后,转染组细胞凋亡率明显升高,同时细胞中Bcl-2表达水平降低,并能检测到活化的Caspase-3裂解片段,提示PTEN对Bcl-2表达具有调节作用[15]。氧化苦参碱可在体外通过上调PTEN表达,下调p-AKT、MMP-2、MMP-9表达和Bcl-2/Bax比值,进而发挥抗原发性胆囊癌的作用[16]。由此推测,AMP上调乳腺癌Bax表达和降低Bcl-2表达,可能是PTEN介导的。
综上所述,AMP可能也是一种天然的PPARγ激动剂,其可通过激活PPARγ,调控细胞凋亡相关蛋白PTEN、Bcl-2、Bax等表达水平以及活化凋亡执行蛋白酶Caspase-3,进而发挥抗乳腺癌作用。以上研究结果为探讨AMP抗肿瘤作用的分子机制提供了新的思路,但其具体的分子机制还需进一步研究。
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