原发性肝癌是全球范围致死率高的肿瘤之一,也是肿瘤相关病死率排第三的疾病。全球每年新增患者626 000人[1]。目前肝癌治疗方法包括手术切除、肝移植、射频消融、化疗栓塞和口服肝癌靶向药物索拉菲尼[2]。临床大部分患者被诊断为肝癌时都处于肝癌晚期,错过了最佳治疗时间,严重限制了其治疗方法的选择[3]。因此,肝癌的准确分期、准确判断是否转移对临床制定合适的治疗方案十分重要。千金藤素(cepharanthine,CEP)是从防己科植物千金藤属植物头花千金藤中提取分离的一种单体化合物,盐酸千金藤碱(cepharanthine hydrochloride,CEH)由CEP经半合成成盐而成。CEH具有膜稳定、免疫调节和促进骨髓组织增生、逆转肿瘤多药耐药的作用[4]。目前,CEH对肝癌转移的抑制作用及机制尚不清楚;关于肝癌向肾脏、睾丸转移的报道均为临床案例[5-7]。本研究通过小动物活体成像技术研究了CEH对肝癌细胞向肾脏、睾丸转移抑制作用及其分子机制,旨在为进一步研究肝癌向肾脏、睾丸转移机制及药物干预奠定基础。
1 材料与方法 1.1 细胞与动物人肝癌细胞株SMMC-7721、HEK293T细胞购自中科院上海细胞库。6~8周龄雄性BALB/c裸鼠20只,体质量20~22 g,购自北京维通利华实验动物技术有限公司,饲养于温度20 ~25 ℃,相对湿度为40% ~70%的独立通气笼(individual ventilated cages,IVC),IVC维持每天光照和黑暗交替12 h,自由摄食、饮水。实验前适应7 d。
1.2 药品、试剂及仪器盐酸千金藤碱由河南省医药科学研究院提供;pLVX-IRES-Neo购自Clontech公司;慢病毒包装试剂盒购自北京丰锐生物技术有限公司;DMEM高糖培养基购自北京索莱宝科技有限公司;胎牛血清购自美国Gemini公司;嘌呤霉素购自美国Sigma-Aldrich公司;N-cadherin、基质金属蛋白酶-7(matrix metalloproteinase-7, MMP-7)、E-cadherin一抗及二抗购自Cell Signaling Technology公司;小动物成像系统为PerkinElmer IVIS Lumina XRMS Series Ⅲ。
1.3 实验方法 1.3.1 慢病毒载体pLVX-Luc的构建根据载体pGL3-basic中的Luc基因序列设计引物,在上、下游分别引入EcoRⅠ、BamHⅠ酶切位点。PCR扩增Luc全长基因,1%琼脂糖凝胶电泳,进行胶回收、纯化。将纯化后的PCR产物和pMD18-T载体连接并转化大肠杆菌DH5α感受态细胞,挑取阳性克隆,获得pMD18-T-Luc。将重组质粒分别用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切,获得Luc基因;再用EcoRⅠ和BamHⅠ内切酶处理载体pLVX-IRESNeo,产物进行1%琼脂糖凝胶电泳、回收纯化。分别取3 μL片段、1 μL载体,加入1 μL T4连接酶,室温反应30 min。连接产物转化大肠杆菌Stbl3感受态细胞,氨苄青霉素筛选阳性克隆,提取后用EcoRⅠ和BamHⅠ酶切、测定DNA序列分析鉴定,获得pLVX-Luc。
1.3.2 稳定表达Luc肝癌细胞的建立用HEK293T细胞包装pLVX-Luc慢病毒,收集细胞上清液。收集对数期生长的SMMC-7721细胞,接种至6孔板中,过夜贴壁,待其汇合度至60%左右,将培养基更换成含5 μg/mL的聚凝胺(polybrene)感染增强溶液的培养基,加入pLVX-Luc慢病毒,感染SMMC-7721细胞。24 h后,更换成含有2 μg/mL嘌呤霉素的DMEM培养基,进行抗性筛选。采用有限稀释法将细胞接种于96孔板,继续进行抗性筛选,获得稳定表达荧光的肝癌细胞株SMMC-7721-Luc。
1.3.3 SMMC-7721-Luc细胞体内外生长曲线收集对数生长期的SMMC-7721和SMMC-7721-Luc细胞,4 000/孔接种于96孔板中,过夜贴壁后,分别于0、12、24、48、72 h和96 h加入10 μL CCK-8溶液,孵育30 min后用酶标仪在波长450 nm处检测光密度值,绘制细胞生长曲线。取雄性BABL/c裸鼠5只,于右侧肩胛部位皮下注入0.2 mL SMMC-7721-Luc细胞悬液,密度为1×107个/mL,每3天用游标卡尺测量1次肿瘤的长度和宽度,计算肿瘤体积,绘制肿瘤生长曲线。肿瘤体积=1/2×a×b2,其中a表示肿瘤最大直径(mm),b表示肿瘤最小直径(mm)。
1.3.4 盐酸千金藤碱对裸鼠原位肝癌肾脏、睾丸转移的影响待裸鼠皮下肿瘤长至约100 mm3时,颈椎脱臼处死,无菌解剖,分离瘤体,剔除肿瘤包膜,切成约2 mm×1 mm×1 mm大小的瘤块。另取裸鼠腹腔注射5%水合氯醛(0.007 mL/g)麻醉,仰卧位固定,碘酒消毒,自剑突下沿腹中线开腹,暴露肝脏。用棉棒轻轻拨出肝左叶,用眼科镊制造皮下隧道,植入瘤块,压迫止血后逐层缝合。7 d后按照随机数字表法分为4组,每组5只,分别腹腔注射生理盐水和盐酸千金藤碱(2.5、5、10 mg/kg)。每7天用小动物活体成像系统观察1次肿瘤肾脏、睾丸转移情况。裸鼠给药21 d后,解剖取肿瘤组织用于检测蛋白表达,同时取肝脏、肾脏、睾丸等组织,用10%中性甲醛固定,进行病理分析。
1.3.5 Western blot检测蛋白表达将肿瘤组织剪碎、匀浆,加入裂解液,冰上裂解30 min后在4 ℃条件下12 000 r/min离心15 min(离心半径8 cm)后取上清液。取50 μg蛋白加入上样缓冲液,水浴煮沸10 min。12%聚丙烯酰胺-SDS凝胶电泳后,电转移至硝酸纤维素膜。5%脱脂奶粉封闭后依次加入一、二抗,室温孵育2 h,TBST缓冲液洗涤,凝胶成像系统获取图像。
2 结果 2.1 慢病毒载体pLVX-Luc的构建T载体以EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切后,将Luc基因克隆入pLVX慢病毒表达载体中,转化大肠杆菌DH5α感受态细胞。氨苄青霉素平板筛选获得阳性菌落,收集菌液进行PCR扩增,获得Luc基因。提取质粒,用EcoRⅠ和BamHⅠ双酶切,进行1%琼脂糖凝胶电泳,发现在8 000 bp和1 700 bp有2条条带(图 1),同时经测序表明所得DNA序列完全正确,说明慢病毒载体pLVX-Luc构建成功。
2.2 稳定表达Luc肝癌细胞的建立
携带Luc基因的慢病毒载体成功感染SMMC-7721细胞。经过嘌呤霉素抗性筛选、稳定传代后,加入D-荧光素(150 μg/mL)孵育5 min,采用小动物活体成像系统检测荧光强度。结果显示,SMMC-7721-Luc细胞能够在体外稳定表达绿色荧光,表达强度较高且表达率稳定(图 2)。
2.3 SMMC-7721-Luc细胞内外生长情况
SMMC-7721和慢病毒转染后,SMMC-7721-Luc细胞均贴壁生长,细胞形态未发生改变,二者生长趋势基本一致,生长速度接近,没有出现生长抑制,表明慢病毒转染过程没有对细胞的形态、生长产生明显的影响(图 3A)。SMMC-7721-Luc细胞裸鼠皮下成瘤率为100%,接种10 d后平均瘤体积约100 mm3,随着时间延长肿瘤体积增加,接种28 d时肿瘤体积约1 300 mm3 (图 3B),表明慢病毒转染后的SMMC-7721-Luc在裸鼠体内能稳定生长。
2.4 原位肝癌的肾脏、睾丸转移
裸鼠肝原位接种SMMC-7721-Luc细胞7 d后肝脏能够检测到较强荧光,14 d后荧光强度增加,肿瘤向肝内转移,21 d后荧光区域进一步扩大,向肠系膜转移(图 4)。28 d后解剖发现对照组裸鼠肝脏肿瘤较为明显,呈鱼肉白,部分裸鼠出现肝肿瘤多发瘤块融合,同时在肠系膜、肾脏和睾丸肉眼可见白色转移灶,未见肺部转移灶(图 5)。HE染色结果显示肝脏、肠系膜、肾脏和睾丸肿瘤细胞呈弥漫性排列,细胞大小、形态不一,细胞核大、深染,异型性明显,核仁明显,核分裂象较多(图 6)。病理结果与活体成像系统检测结果一致。
2.5 盐酸千金藤碱抑制原位肝癌的肾脏、睾丸转移
活体成像系统结果显示,裸鼠腹腔注射盐酸千金藤碱后明显抑制了肝原位肿瘤向肾脏和睾丸的转移,并呈剂量依赖性(图 7)。Western blot检测结果显示,与对照组相比,盐酸千金藤碱治疗组N-cadherin和MMP-7蛋白的表达明显降低,并呈剂量依赖性,而E-cadherin的表达则呈剂量依赖性增加(图 8)。盐酸千金藤碱通过调控肿瘤转移相关蛋白,抑制原位肝癌的肾脏、睾丸转移。
3 讨论
肝癌是常见的恶性肿瘤之一,其较高的转移率和复发率是影响预后的主要因素[8]。由于肝癌的转移和复发从原发灶的单个细胞脱落开始,因此准确地追踪肿瘤细胞就显得尤为重要。目前,活体成像技术成为直观、准确检测肿瘤细胞和基因行为的主要技术,包括生物发光和荧光成像[9]。生物发光指的是利用荧光素酶基因标记细胞,在有氧和Mg2+存在的条件下消耗ATP,将底物荧光素氧化,产生发光现象。与荧光成像技术相比,生物发光具有特异性强、信号干扰小、成像本底较低且组织穿透力强等优点,特别适用于动物成像[10-11]。
本研究通过慢病毒载体转染SMMC-7721细胞,建立稳定表达Luc基因的SMMC-7721-Luc细胞株,结果表明其感染效率高、稳定性好。SMMC-7721-Luc细胞株在体内外长期培养后均能产生较强荧光,表明该细胞株可以稳定表达Luc基因并连续传代,实现了对细胞长期、稳定的标记。肝癌原位异种移植的方式一般有以下3种:①直接注射肝癌细胞液至肝被膜;②皮下移植肿瘤细胞形成瘤块后,解剖分离切成小块再塞入肝脏;③将肿瘤细胞经脾脏注射,转移至肝脏[12]。方法①容易出现细胞液反流,方法③需要进行脾脏切除手术,限制了涉及脾脏研究的应用[13]。本研究进行先皮下移植成瘤,然后解剖分离瘤体,切成瘤块植入肝脏包膜,避免了上述两种方法的缺点。已报道的动物原位肝癌模型主要是肺转移,尚少见在动物水平研究肝癌肾脏、睾丸转移的报道[5-7]。本研究建立了原位肝癌向肾脏、睾丸转移的动物模型,为进一步研究肝癌肾脏、睾丸转移机制和抗肿瘤药物筛选奠定了基础。
cadherin介导细胞连接、参与细胞分化、调控细胞迁移等,其家族共有3个成员:E-cadherin、N-cadherin和p-cadherin。癌组织中细胞表面的E-cadherin减少或消失导致癌细胞从原发灶脱落,发生侵袭与转移[14]。盐酸千金藤碱能够引起E-cadherin上调及N-cadherin下调,通过调控cadherin表达产生抗SMMC-7721细胞转移的作用。肿瘤细胞分泌基质金属蛋白酶与肿瘤侵袭、转移过程关系密切,特别是MMP-7通过降解周围基质,使原发部位脱离的肿瘤细胞进入血液循环或淋巴循环[15]。本实验结果表明盐酸千金藤碱能降低MMP-7的表达,提示盐酸千金藤碱抑制SMMC-7721细胞转移的分子机制也与MMP-7表达降低有关。
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