2. 610041 成都,四川大学华西医院病理研究室
2. Department of Pathology, West China Hospital, Sichuan University, Chengdu, Sichuan Province, 610041, China
心力衰竭(heart failure, HF)是由于多种心脏结构或功能异常所导致心室充盈或心脏射血功能受阻的一组临床综合征,是心血管疾病发生、发展的最终阶段,严重威胁人类健康,病死率在确诊5年内高达50%[1]。心室重构(ventricular remodeling, VR)作为目前心衰的主要发病基础,是心肌细胞与细胞间质在特殊条件下发生的使心室肌弹性下降,收缩受阻的现象,主要表现为室腔内径与室壁厚度的改变,因而成为影响心衰病死率的关键因素[2]。
近年研究证明,心衰的发生、发展源于遗传、环境等多方面因素的相互作用。遗传信息的延续依靠DNA乙酰化、甲基化、磷酸化等修饰,其中乙酰化的过程离不开组蛋白去乙酰化酶的重要作用[3]。组蛋白去乙酰化酶(histone deacetylase, HDACs)参与调节包括心律失常、肥厚型心肌病、心肌梗死、心力衰竭等诸多心血管疾病[4-6]。组蛋白去乙酰化酶在人类主要分为3型,其中Ⅰ型存在于细胞核中,分为HDAC1、HDAC2、HDAC3、HDAC8。对小鼠胚胎期发育的研究结果显示,Hdac1、Hdac2、Hdac3基因的缺失会引起小鼠心脏发育缺陷,从而导致胚胎死亡,因而认为Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶主要参与心肌细胞的增殖与分化[7-9]。另有研究发现,小鼠心脏特异性过表达Hdac2基因通过抑制多磷酸肌醇-5-磷酸酶F(Inpp5f)能够引起心肌肥厚;而小鼠心脏特异性过表达Hdac3基因则通过抑制细胞周期依赖性蛋白激酶抑制物引起心肌细胞增殖,抑制心肌肥厚[10-11]。由于Hdac3基因在调节心肌肥厚方面与Hdac2基因发挥截然相反的作用,仅通过基因过表达技术并不能完整地阐述Hdac3基因在心脏中的相关作用机制,且以往研究多致力于小鼠心脏发育阶段。因此,本研究通过构建成年小鼠心脏特异性Hdac3基因敲除模型,进一步研究Hdac3基因在心脏中的作用。
1 材料与方法 1.1 实验动物Hdac3loxp/loxp小鼠与Myh6-creERT小鼠均由四川大学华西医院病理研究室提供,饲养条件严格按照SPF级饲养标准,动物合格证号:SCXK(川)2015-030。通过Cre/Loxp基因重组系统Hdac3loxp/loxp小鼠与Myh6-creERT小鼠进行杂交筛选获得Myh6-creERT/Hdac3loxp/loxp小鼠,均为8周龄,雄性,体质量(25±5)g。
1.2 主要实验试剂他莫昔芬购自美国Sigma公司,Hdac3抗体购自美国Novus公司,H3抗体、γH2AX抗体、β-actin抗体购自美国Cell Signaling Technology公司,WGA抗体购自美国Life Technology公司,DAPI抗体、荧光二抗购自美国Invitrogen公司,辣根过氧化物酶标记养抗兔IgG购自北京中杉金桥生物科技有限公司,HE染色试剂盒、Masson三色染色试剂盒购自珠海贝索生物技术有限公司,天狼星红染色试剂盒购自上海源叶生物科技有限公司,TUNEL凋亡试剂盒购自瑞士Roche公司。
1.3 实验动物操作方法按随机数字表法将28只8周龄雄性Myh6-creERT/Hdac3loxp/loxp小鼠分为2组:对照组、模型组,每组14只。模型组小鼠腹腔注射0.2 mL他莫昔芬(溶剂为玉米油),40 mg/mL,每天1次,连续注射5 d;对照组腹腔注射0.2 mL玉米油。停药7 d以清除他莫昔芬,7 d后进行下一步检测。
1.4 相关检测指标 1.4.1 小鼠超声心动图检测Hdac3基因敲除后对2组小鼠进行心功能检测。小鼠腹腔注射1%戊巴比妥钠(50 mg/kg)进行全身麻醉,仰卧位固定于操作台上,全程维持体温,用线阵探头经胸进行心脏超声检测。测量舒张末期室间隔厚度(diastolic interventricular septum,IVSd)、舒张末期左室后壁厚度(diastolic interventricular septum,LVPWd)、射血分数(ejection fraction, EF)、左室短轴缩短率(fractional shortening, FS)指标。每次连续采集10个心动周期的动态图像并进行分析。超声检测完毕后,在麻醉条件下处死小鼠,开胸后迅速获取完整的心脏组织进行称量。手术刀对称切开心室部分,一半组织浸泡于10%中性福尔马林固定48 h,用于病理学分析;另一半放置于-80 ℃保存,用于相关蛋白检测。
1.4.2 心脏大体观检测获取小鼠心脏组织,观察心脏大体外观情况,并称量心脏质量,计算心脏质量(mg)/小鼠体质量(g)的比值。
1.4.3 Western blot检测电子天平称取20~30 mg小鼠心脏组织置于匀浆管内,加入组织强裂解混合液进行匀浆,4 ℃冰箱内静置1 h后,4 ℃离心机离心(离心半径6 cm),提取上清液进行分装保存,BCA检测试剂盒检测总蛋白浓度后,加入缓冲液,于沸水浴6~8 min。采用SDS-PAGE配置凝胶,蛋白上样量为30~40 μg,经过电泳、转膜、封闭后,添加一抗(1 :1 000)过夜孵育,二抗(1 :5 000)孵育1 h,ECL显影,凝胶成像仪器曝光。采用Image Lab软件分析条带灰度值,检测蛋白含量。
1.4.4 组织病理学检测组织固定后经石蜡包埋、切片,脱蜡后根据试剂盒说明书进行HE染色、Masson三色染色、天狼星红染色。WGA免疫荧光染色显示心肌细胞膜,抗体浓度为1 :100,缓冲甘油封片后于高倍镜视野(×400)随机选取5个视野,采用Image-Pro Plus测量心肌细胞大小。
1.4.5 TUNEL免疫荧光染色切片脱蜡后根据试剂盒说明书进行相关操作,缓冲甘油封片后于高倍镜视野(×400)随机选取5个视野,计数每视野下阳性细胞数(n)、总细胞数(N),细胞凋亡阳性率=n/N×100%。
1.5 统计学方法数据以x±s表示,采用统计软件Graph Prism 6.0及SPSS 22.0进行分析,两组间比较采用t检验,多组比较采用单因素方差分析。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 小鼠基因型鉴定与心脏Hdac3敲除率检测诱导性心肌特异性Myh6-creERT/Hdac3loxp/loxp小鼠由带有Loxp位点的Hdac3loxp/loxp小鼠与心肌特异性启动子的Myh6-creERT小鼠杂交获得,通过PCR鉴定小鼠基因型(图 1)。
Western blot检测结果显示,模型组小鼠Hdac3蛋白表达量较对照组显著降低(P<0.05),表明Hdac3基因在小鼠心肌细胞中得到有效的敲除(图 2)。
2.2 小鼠超声心动图检测
建模后第1周与第4周,两组小鼠均接受超声心动图检测。结果显示:与对照组小鼠比较,模型组小鼠心腔扩大,心室壁增厚,心脏泵血功能明显降低,IVSd、LVPWd逐渐增加(P<0.05),EF、FS逐渐降低(P<0.05,图 3)。
2.3 小鼠心脏大体观检测
建模后第1周与第4周,小鼠心脏外观明显增大。与对照组相比,模型组心脏质量/体质量比值也明显增大(P<0.05,图 4)。
2.4 小鼠相关病理学检测
心肌特异性敲除Hdac3基因会引起心室重塑,并随着时间的递增逐渐加重。通过HE染色、Masson三色染色、天狼星红染色、WGA免疫荧光染色结果显示:与对照组小鼠相比,模型组小鼠于敲除后第1周,心肌细胞排列紊乱,伴有少量的炎性细胞浸润,间质纤维化增多,心脏横断面显示心肌细胞肥大;敲除后第4周,模型组小鼠心肌细胞排列丧失原有的正常组织结构,心肌细胞肥大不规则,弥漫的心肌纤维化致使心脏组织呈现大小不均的细胞状态(图 5)。
2.5 小鼠心肌细胞凋亡与DNA损伤检测
心肌特异性敲除Hdac3基因还会引起心肌细胞凋亡与DNA损伤(图 6)。TUNEL免疫荧光染色结果显示:模型组小鼠可见增多的凋亡阳性细胞,于敲除后第4周阳性率约为3%(P<0.05),而对照组的阳性率不足1%(P<0.05)。Western blot检测结果显示模型组于第1周与第4周γH2AX蛋白表达量明显高于对照组(P<0.05)。
3 讨论近年研究表明,Ⅰ型组蛋白去乙酰化酶在心血管疾病中发挥着重要的作用,尤其对于Hdac1、Hdac2基因在心脏中的诸多靶基因与相关机制进行了详细的阐述[12]。本研究通过可诱导性敲除心肌特异性Hdac3基因形成心室重塑,利用该模型研究Hdac3基因在成年小鼠心脏中的主要作用机制。结果显示,Hdac3的缺失能够引起严重的间质纤维化、心肌肥厚等心室重构的现象,还通过超声心动图观察到室腔扩张、室壁增厚、收缩功能下降等结果。尤其重要的是,Hdac3基因的缺失能够引起DNA损伤,诱导心肌细胞凋亡。因此,尽管Hdac1、Hdac2与Hdac3之间的同源性程度很高,但是Hdac3基因在维持心脏结构与功能方面具有独特的作用。
作为拮抗心肌肥厚的重要介质,Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶的作用机制主要是结合并抑制成年小鼠心脏中的肌细胞增强因子2(myocyte enhancer factor, MEF2)及其他转录因子[13]。因为Ⅱ型组蛋白去乙酰化酶不具备内在的去乙酰化酶活性,所以它需要招募NCoR/SMRT-Hdac3复合物介导去乙酰化与转录抑制[14-15]。Hdac3基因的缺失会影响Hdac3-NCoR/SMRT复合物的形成,从而不能发挥其特有的去乙酰化酶活性,对于与复合物相结合的转录因子所产生的抑制作用会得到解除,因而拮抗心肌肥厚的作用受到抑制,促进心肌肥厚的作用得到激活。
此外,已有研究表明Hdac3直接与MEF2结合,并介导MEF2的去乙酰化,从而调节MEF2的活性,而心脏特异性过表达MEF2会引起伴有广泛纤维化的心肌病[16-17]。MONTGOMERY等[18]通过在小鼠胚胎期第9.5天(E9.5)敲除Hdac3发现,基因的缺失会引起胚胎的死亡,少量存活的小鼠在出生后发生严重的心肌纤维化,并伴有MEF2活性的增加,说明心脏特异性敲除Hdac3打破了MEF2乙酰化与去乙酰化的动态平衡,促使MEF2活性增强,在其高表达的情况下诱导心脏纤维化逐渐加重。
心室重构作为影响心衰进展的主要机制之一,一方面包括心肌细胞凋亡、坏死等在内的心肌细胞死亡;另一方面主要为神经内分泌系统的激活[19-20]。我们在心脏慢性病理性改变的基础上,发现心肌细胞凋亡的增加,进一步证实了由Hdac3基因缺失所引起的心室重构。DNA损伤作为引发细胞凋亡的有效诱导剂,通过信号传导激活众多相关通路,对关键蛋白的转录后修饰,发挥下游参与基因的凋亡执行机制[21]。不同于HDAC1、HDAC2,HDAC3能够与核受体辅阻遏物(NCoR)以及类视黄醇和甲状腺激素受体沉默介质(SMRT)相结合,维持染色质结构和基因组稳定性,因而Hdac3基因对高效的DNA复制和DNA损伤控制至关重要[22]。BHASKARA等[23]还在成纤维细胞以及肝细胞中进一步证实Hdac3的敲除能够损害DNA修复,并严重降低染色质紧密状态和异染色质含量,从而引起DNA损伤。本研究结果提示,心脏的病理性重构与心肌细胞凋亡的增加可能是由于小鼠Hdac3的缺失通过DNA损伤所致。
NCoR/SMRT-Hdac3抑制复合物能够与甲状腺受体、视黄酸受体、维生素D受体、雄激素受体、糖皮质激素受体等众多核受体相互作用,其中可能存在受体之间的相互影响;Hdac3的缺失不仅会引起抑制复合物的解离,而且还会促进活化复合物的结合作用,激活众多基因的转录[24],因而需要我们进一步探讨Hdac3在心脏重塑中的作用机制。
综上所述,在小鼠心脏特异性基因敲除模型中,Hdc3基因的缺失会引起DNA损伤的发生,促使心肌细胞凋亡的增加,引起心脏的慢性病理性改变,降低心脏的收缩功能。本研究结果能够为心脏重塑的基因靶向治疗提供新的方向,从而防止心力衰竭的发生、发展。Ⅰ型HDACs作为HDAC抑制剂的主要靶点能够治疗多种疾病状态,然而其中的特异性仍未得到明确阐述,通过Hdac3基因缺失所产生的小鼠心脏表型可知,在应用Ⅰ型HDAC抑制剂的过程中需要重视避免对HDAC3的抑制作用,从而预防产生心脏毒性作用。
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