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Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究
林夏, 朱元鑫, 付航玮, 李光耀, 陈平     
400042 重庆, 陆军军医大学(第三军医大学)第三附属医院(野战外科研究所)肝胆外科
[摘要] 目的 研究环状RNA hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的表达以及对肝癌细胞生物学功能的影响。方法 利用RT-qPCR检测环状RNA hsa_circ_0000711在肝癌细胞系的表达; 通过小干扰RNA特异性敲低hsa_circ_0000711的表达; 通过CCK-8实验检测肝癌细胞系的增殖情况; 利用流式细胞技术检测细胞周期及细胞凋亡。Western blot检测下调hsa_circ_0000711后Cyclin D1、CDK4、cleavaed Caspase 3及Bcl-2蛋白的表达水平。结果 Hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2和SMMC-7721中明显高表达(P < 0.05)。与对照组相比, hsa_circ_0000711干扰组的肝癌细胞增殖能力显著降低(P < 0.05), 处于G1期细胞增多(P < 0.05), 且凋亡细胞显著增加(P < 0.05)。干扰hsa_circ_0000711的表达后, 肝癌细胞中Cyclin D1、CDK4和Bcl-2的蛋白表达量显著降低(P < 0.05), cleavaed Caspase 3蛋白表达量显著升高(P < 0.05)。结论 Hsa_circ_0000711可能通过调控细胞周期及凋亡影响肝癌细胞的增殖。
[关键词] 肝癌     hsa_circ_0000711     细胞周期     细胞凋亡     细胞增殖    
Function of circular RNA hsa_circ_0000711 in hepatocellular carcinoma cell lines
LIN Xia , ZHU Yuanxin , FU Hangwei , LI Guangyao , CHEN Ping     
Department of Hepatobiliary Surgery, Institute of Surgery Research, Third Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400042, China
Corresponding author: CHEN Ping,E-mail:chenpingsyd@126.com
[Abstract] Objective To explore the expression profile of circular RNA (circRNA), hsa_circ_0000711, in hepatocellular carcinoma (HCC) cell lines and determine the effect of hsa_circ_0000711 on the biological behaviors of HCC cells. Methods The expression level of Hsa_circ_0000711 were detected by real-time polymerase chain reaction assay (RT-qPCR) in HCC cell lines HepG2 and SMMC-7721 and human live cell line L02.Small RNA interference was used to knock down the expression of hsa_circ_0000711.Then CCK-8 assay was employed to detect the proliferation, and flow cytometry for cell cycle and apoptosis.The protein levels of Cyclin D1, CDK4, cleaved Caspase 3 and Bcl-2 were measured by Western blotting. Results Hsa_circ_0000711 was more strongly expressed in the HepG2 and SMMC-7721 cells than the L02 cells (P < 0.05).Down-regulation of hsa_circ_0000711 significantly suppressed the growth rate of HepG2 and SMMC-7721 cells (P < 0.05), arrested the cells at cycle G1 (P < 0.05), and promoted cell apoptosis (P < 0.05).After hsa_circ_0000711 interference, the protein expression levels of Cyclin D1, CDK4 and Bcl-2 were decreased notably (P < 0.05), but that of cleaved Caspase 3 was increased (P < 0.05). Conclusion Hsa_circ_0000711 may affect HCC cell proliferation by regulating cell cycle and cell apoptosis.
[Key words] hepatocellular carcinoma     Hsa_circ_0000711     cell cycle     cell apoptosis     cell proliferation    

肝癌作为全球第5大常见肿瘤, 其病死率居所有恶性肿瘤的第3位[1]。每年新近诊断的肝癌患者约有55%在中国, 这也使中国成为肝癌发病率最高的国家[2]。目前在肝癌的治疗上尚缺乏有效手段, 越来越多的研究集中于运用新的分子生物标志物进行早期阶段的诊断和治疗。深入了解肝癌的发生、发展对人类健康事业具有重要意义。

环状RNA(circular RNA, circRNA)主要由RNA前体可变剪接形成[3]。circRNA广泛存在于人体细胞中, 主要在转录水平或者转录后水平对基因发挥调控作用[4]。由于circRNA是一个封闭的环形结构, 可耐受核酸外切酶的降解作用, 比线性RNA稳定, 并且除实质器官外, circRNA还广泛存在于血液、尿液、脑脊液等体液中, 因此可能非常适合作为肿瘤标志物而具有较好的应用前景[5]。目前的研究表明, circRNA在肿瘤的发生、发展中发挥了重要作用[3], 但与HCC相关的circRNA的研究却并不多。因此circRNA与HCC的发生、发展是否存在联系, 以及circRNA能否作为HCC的标志物, 是研究者急需解决的问题。SALZMAN等[6]通过测序技术首次检测到hsa_circ_0000711在HepG2细胞中高表达, 但其功能尚少见报道。为初步探讨hsa_circ_0000711与肝癌的关系, 我们检测hsa_circ_0000711在肝癌细胞的表达情况, 并通过下调hsa_circ_0000711的表达, 探究其对肝癌细胞增殖、细胞周期和细胞凋亡的影响, 以及潜在的调控机制, 为hsa_circ_0000711在肝癌的作用及其分子机制研究奠定基础。

1 材料与方法 1.1 细胞及试剂

正常肝上皮细胞L02及肝癌细胞系(HepG2、SMMC-7721)均购自中国科学研究院上海生物院。南美胎牛血清购自Excell公司, DMEM培养基购自HyClone公司, 青霉素、链霉素购自索莱宝公司, LipoFiterTM脂质体转染试剂盒购自汉恒公司, 细胞周期试剂盒购自碧云天公司, 细胞凋亡试剂盒购自万类生物公司, CCK-8试剂购自东仁公司, 总RNA提取试剂盒购自Progema公司, 反转录试剂盒购自TaKaRa公司, 荧光定量PCR试剂盒购自Qiagen公司, 兔抗大鼠Cyclin D1单克隆抗体、兔抗大鼠cleaved Caspase 3单克隆抗体、兔抗大鼠CDK4单克隆抗体、兔抗大鼠Bcl-2单克隆抗体、小鼠抗大鼠GAPDH单克隆抗体购自Proteintech公司。

1.2 细胞培养及转染

所有细胞用含10%南美胎牛血清、50 U/mL青霉素、50 U/mL链霉素的高糖DMEM培养液培养于6孔板中, 置于37 ℃、5%CO2细胞培养箱。转染前使细胞铺满约60%~70%, 并每孔换液为2 mL的无血清, 无青、链霉素的DMEM培养液。按照LipoFiterTM脂质体转染试剂盒推荐步骤进行转染。将细胞分为阴性对照组(si-NC)、空白组(空载脂质体)及干扰组(si-711)。小干扰RNA(siRNA)序列的设计与合成均由上海生工公司完成。干扰序列见表 1

表 1 siRNA序列与长度
名称 序列 长度
si-711 正义链:5′-AAUCAUCUGGCUCAAGAUCUU-3′
反义链:5′-GAUCUUGAGCCAGAUGAUUGU-3′
21 bp
si-NC 正义链:5′-UUCUCCGAACGUGUCACGUTT-3′
反义链:5′-ACGUGACACGUUCGGAGAATT-3′
21 bp

1.3 RNA提取和RT-qPCR检测

按照试剂盒说明书步骤进行总RNA提取、反转录和荧光定量PCR。以GAPDH为内参检测hsa_circ_0000711的表达情况, PCR引物使用NCBI Primer-BLAST设计, 交由成都擎科公司合成。hsa_circ_0000711及GAPDH引物序列见表 2。采用2-△△Ct法计算目的基因的相对表达量, 具体方法参考文献[7]。hsa_circ_0000711引物序列长度为189 bp。GAPDH引物序列长度为120 bp。

表 2 hsa_circ_0000711及GAPDH引物序列与长度
名称 序列 长度
hsa_circ_0000711 上游:5′-TAGCCGAGGGGCAGTAAAAG-3′
下游:5′-TTGGAGCTGAAACGATGGTGA-3′
189 bp
GAPDH 上游:5′-TTGCCCTCAACGACCACTTT-3′
下游:5′-TGGTCCAGGGGTCTTACTCC-3′
120 bp

1.4 CCK-8细胞增殖实验

细胞转染48 h后收集各组细胞, 制成细胞悬液, 每孔接种约2 000个细胞, 每组设置3个复孔。换液后继续培养24、48、72 h和96 h, 每孔加入约10 μL CCK-8溶液, 置于培养箱中孵育2 h, 用酶标仪测定各孔在波长为450 nm处的光密度值[D(450)], 绘制细胞生长曲线。

1.5 流式细胞术分析细胞周期

细胞转染48 h后, 于4 ℃低速离心收集细胞(1 200 r/min, 4 min), 以预冷的70%乙醇固定, 4 ℃存储1 d。流式细胞分析前, 细胞溶解离心后重悬于含50 μL/mL的PI和250 μL/mL RNase A染色缓冲液, 混匀4 ℃避光反应30 min后, 采用流式细胞仪检测细胞周期。

1.6 流式细胞术分析细胞凋亡

同上, 各组细胞胰蛋白酶化后, 于500 μL缓冲液中充分重悬。随后细胞分别加入10 μL的PI及5 μL Annexin V-FITC, 混匀后室温避光孵育15 min, 在1 h内采用流式细胞仪检测细胞凋亡。

1.7 Western blot检测

细胞转染72 h后, 用RIPA裂解液制备细胞裂解液, 离心后取上清, BCA法测定总蛋白浓度。行聚丙烯酰胺凝胶电泳, PVDF膜转膜, 5%脱脂牛奶常温封闭2 h后, 依次孵育一抗及二抗, 用化学发光试剂ECL显色液显影检测各蛋白的表达。

1.8 统计学分析

采用SPSS 17.0统计软件, 计量资料以x±s表示。两组间采用独立样本t检验, 多组间采用单因素方差分析。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 hsa_circ_0000711在肝癌细胞系中的表达

采用RT-qPCR检测hsa_circ_0000711在2株肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721及1株正常肝细胞系L02的表达情况, 结果显示:hsa_circ_0000711在肝癌细胞HepG2及SMMC-7721中的表达均明显高于正常肝细胞L02, 且分别是L02细胞的2.3倍和7.3倍(图 1), 差异具有统计学意义(P < 0.05)。基于以上结果, 我们选择HepG2、SMMC-7721细胞系为研究对象, 进而探究hsa_circ_0000711对肝癌细胞生物功能的影响。

1:L02细胞, 2:HepG2细胞, 3:SMMC-7721细胞; a:P < 0.05, 与L02细胞比较 图 1 RT-qPCR检测Hsa_circ_0000711在细胞系中的表达水平

2.2 si-771转染HepG2、SMMC-7721细胞后表达验证

将肝癌细胞HepG2、SMMC-7721分为阴性对照组(si-NC)、空白组(空载脂质体)及干扰组(si-711)。各组细胞转染48 h后, 提取细胞RNA后采用RT-qPCR检测siRNA的干扰效率。结果显示:HepG2、SMMC-7721细胞中干扰组hsa_circ_0000711的表达量相较阴性对照组明显降低(图 2), 与阴性对照组比较, 差异具有统计学意义(P < 0.05), 而HepG2、SMMC-7721细胞中空白组hsa_circ_0000711的表达量相较阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05)。

A:HepG2细胞; B:SMMC-7721细胞; 1:空白组, 2:阴性对照组, 3:干扰组; a:P < 0.05, 与阴性对照组比较 图 2 RT-qPCR检测转染siRNA后hsa_circ_0000711的表达水平

2.3 下调hsa_circ_0000711的表达后对肝癌细胞增殖的影响

在肝癌细胞系HepG2、SMMC-7721中下调hsa_circ_0000711的表达后, 通过CCK-8增殖实验检测细胞增殖情况, 并绘制细胞生长曲线。结果显示:与阴性对照组相比, HepG2及SMMC-7721干扰组细胞增殖能力明显降低(图 3), 差异具有统计学意义(P < 0.05)。与阴性对照组相比, HepG2及SMMC-7721空白组细胞增殖能力差异无统计学意义(P>0.05)。

A:HepG2细胞; B:SMMC-7721细胞; a:P < 0.05, 与阴性对照组比较 图 3 CCK-8检测hsa_circ_0000711对肝癌细胞的增殖影响

2.4 下调hsa_circ_0000711的表达对肝癌细胞周期的影响

利用流式细胞术检测下调hsa_circ_0000711后对HepG2、SMMC-7721细胞周期分布的影响。结果显示:在HepG2细胞中, 干扰组相较阴性对照组的G1期细胞数量明显增多, 而空白组与阴性对照组G1期细胞数量相比差异无统计学意义(P>0.05)。同样, 在SMMC-7721细胞中, 干扰组相比阴性对照组的G1期细胞数量也明显增多, 空白组与阴性对照组G1期细胞数量相较差异无统计学意义(P>0.05, 图 4)。结果提示下调hsa_circ_0000711可以阻滞细胞周期进程, 抑制细胞增殖。

A:HepG2空白组; B:HepG2阴性对照组; C:HepG2干扰组; D:SMMC-7721空白组; E:SMMC-7721阴性对照组; F:SMMC-7721干扰组 图 4 流式细胞术检测下调hsa_circ_0000711对HepG2和SMMC-7721细胞周期的影响

2.5 下调hsa_circ_0000711的表达对肝癌细胞凋亡的影响

在肝癌细胞HepG2、SMMC-7721中下调hsa_circ_0000711表达后, 采用流式细胞术分析细胞凋亡。结果显示:在HepG2细胞中, 干扰组细胞凋亡率(19.2%)相较阴性对照组细胞凋亡率(7.7%)明显升高, 而空白组凋亡率(6.4%)与阴性对照组(7.7%)相较差异无统计学意义。同样, 在SMMC-7721细胞中, 干扰组细胞凋亡率(23.9%)相较阴性对照组(6.0%)也明显升高, 空白组凋亡率(5.3%)与阴性对照组(6.0%)相比差异无统计学意义(图 5)。结果提示下调hsa_circ_0000711的表达可以促进细胞凋亡。

A:HepG2空白组; B:HepG2阴性对照组; C:HepG2干扰组; D:SMMC-7721空白组; E:SMMC-7721阴性对照组; F:SMMC-7721干扰组 图 5 流式细胞术检测下调hsa_circ_0000711对HepG2和SMMC-7721细胞凋亡的影响

2.6 下调hsa_circ_0000711的表达对细胞周期及凋亡相关蛋白表达水平的影响

分别检测HepG2、SMMC-7721细胞中下调hsa_circ_0000711对CDK4、Cyclin D1、Bcl-2及cleaved Caspase 3蛋白表达的影响。Western blot检测结果显示, 与阴性对照组相比, 在HepG2、SMMC-7721细胞干扰组中下调hsa_circ_0000711后, Cyclin D1、CDK4及Bcl-2蛋白的表达水平降低, 而cleaved Caspase 3蛋白的表达水平升高。在HepG2、SMMC-7721细胞空白组中, 与阴性对照组相比上述蛋白的表达水平差异无统计学意义(P>0.05)。结果表明抑制hsa_circ_0000711的表达可以通过影响调控CDK4、Cyclin D1、Bcl-2及cleaved Caspase 3蛋白的表达, 影响细胞周期及细胞凋亡(图 6)。

1:HepG2空白组; 2:HepG2阴性对照组; 3:HepG2干扰组; 4:SMMC-7721空白组; 5:SMMC-7721阴性对照组; 6:SMMC-7721干扰组 图 6 下调hsa_circ_0000711对HepG2和SMMC-7721周期凋亡相关蛋白表达量的影响

3 讨论

circRNA自1976年被发现以来, 一度被视为在基因转录过程中产生的“垃圾RNA”而缺乏深入的研究[4]。随着RNA测序(RNA sequencing, RNA-seq)和生物信息学等技术的蓬勃发展, 人们在大规模研究转录组数据时发现, circRNA并非像之前所报道是一种极其罕见的现象, 而是大量存在于真核细胞中[8]。有些circRNA具有天然miRNA海绵作用, 可通过与miRNA结合而抑制其活性, 从而调控miRNA标靶发挥作用, 参与多种疾病的发生、发展[9]。已经有大量证据显示circRNA作为一种新的调控因子参与癌症的发生、发展过程。当前, 已经发现有与肝癌相关的circRNA, 如hsa_circ_0001649、hsa_circ_0005075和hsa_circ_0005986可以成为肝癌潜在的临床标志物[1012]。但是更多的其他肝癌相关的circRNA还有待进一步发掘。

SALZMAN等[6]通过测序首次检测到hsa_circ_0000711在HepG2中高表达, 但其在肝癌中的功能尚未了解。目前少见hsa_circ_0000711在任何肿瘤中作用的相关报道, 因此有必要对hsa_circ_0000711在肝癌中的作用进行探索。本研究通过RT-qPCR验证了hsa_circ_0000711在HepG2和SMMC-7721细胞中高表达, 与SALZMAN[6]所报道的结果一致, 因此推测hsa_circ_0000711在肝癌中很有可能发挥促癌基因的作用。本研究主要从hsa_circ_0000711对HepG2、SMMC-7721细胞增殖、周期及凋亡的功能影响进行探讨。结果显示:下调hsa_circ_0000711的表达可以明显抑制肝癌细胞的增殖能力、阻滞细胞周期进程以及促进细胞凋亡。

近年, 越来越多的证据表明circRNA在肿瘤增殖过程中发挥了至关重要的作用。例如, hsa_circ_0005986可作为miRNA海绵, 解除miR-129-5p对Notch1的负向调控, 而下调的hsa_circ_0005986可促进肿瘤细胞增殖[12]。另有研究表明, circZKSCAN1可以抑制HCC的增殖、迁移和侵袭, 并且是通过不同的信号通路[13]。本研究探究了hsa_circ_0000711对肝癌细胞增殖的作用, 研究结果初步表明, 抑制hsa_circ_0000711的表达可以抑制肝癌细胞的增殖。

生命的平衡是由出生、生长、分化和死亡的细胞周期来维持的。多细胞生物中的细胞凋亡是消除有害或不必要的细胞的有效方法之一, 可能与肿瘤的发生有关。已有研究表明, 细胞周期、细胞凋亡改变与circRNA有着密切的联系。例如在结肠癌中, circ_001569可作为miRNA海绵, 解除miR-145对下游E2F5、BAG4和FMNL2的负向调控, 加速细胞周期进程, 抑制细胞凋亡从而促进肿瘤细胞增殖[14]。GUO等[15]发现hsa_circ_0000069在结肠癌组织及结肠癌细胞中高表达, 敲低hsa_circ_0000069可以阻滞结肠癌细胞周期进程, 抑制结肠癌细胞增殖。LUO等[16]发现hsa_circ_0000064一方面作用于细胞周期相关蛋白(P21、Cyclin D1、CDK 6)及细胞凋亡相关蛋白(Bcl-2、Bax、Caspase 3)加速肺癌细胞增殖, 另一方面hsa_circ_0000064可作用MMP-2、MMP-9蛋白参与肺癌的转移。我们研究发现, 在肝癌细胞中下调hsa_circ_0000711也可通过阻滞细胞周期进程, 促进细胞凋亡来抑制细胞增殖。这一结果提示, hsa_circ_0000711可能在肝癌细胞中的恶性生物学行为中扮演一定作用。

Cyclin D1和CDK4被认为在细胞周期G1期到S期转换过程中发挥了极为重要的作用[17], Cyclin D1和CDK4在G1期结合形成复合物, 通过N末端的LECXE基序与pRB结合, 使pRB的丝氨酸和络氨酸残基磷酸化, 释放出转录因子E2F, 驱动细胞由G1期进入S期, 促进细胞增殖。目前已经证实cleaved Caspase 3在细胞凋亡中发挥重要作用, cleaved Caspase 3在细胞凋亡过程中不仅作为凋亡执行者水解激活相关凋亡蛋白, 还能水解激活凋亡启动性Caspase酶原而使凋亡信号级联放大, 从而发挥重要作用[18]。Bcl-2可以通过改变线粒体巯基的氧化还原状态, 调节线粒体膜对一些凋亡蛋白前体的通透性等机制抑制细胞凋亡。

Western blot检测结果显示下调hsa_circ_0000711后, HepG2和SMMC-7721细胞中CDK4、Cyclin D1及Bcl-2蛋白表达量均明显低于阴性对照组, 而cleaved Caspase 3蛋白表达量明显高于阴性对照组。空白组与阴性对照组相比, 上述蛋白表达量差异无统计学意义。这说明抑制hsa_circ_0000711的表达可以通过影响调控CDK4、Cyclin D1、Bcl-2及cleaved Caspase 3蛋白表达, 影响细胞周期及细胞凋亡。

本研究还存在一定的局限性。首先, 本研究未纳入临床病例标本, 未探究hsa_circ_0000711在肝癌组织中的表达水平。其次, 本研究的结果仅限于细胞水平, 并未进行裸鼠体内实验验证。综上所述, 我们发现hsa_circ_0000711在肝癌细胞的增殖中发挥了一定的促进作用, 可能在肝癌的发生、发展中起到促进肿瘤增殖的作用。因此, 未来我们将继续研究hsa_circ_0000711发挥促癌作用的具体机制, 以期为肝癌的防治提供新的思路和方法。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201712097
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

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林夏, 朱元鑫, 付航玮, 李光耀, 陈平.
LIN Xia, ZHU Yuanxin, FU Hangwei, LI Guangyao, CHEN Ping.
Hsa_circ_0000711在人肝癌细胞系中的功能研究
Function of circular RNA hsa_circ_0000711 in hepatocellular carcinoma cell lines
第三军医大学学报, 2018, 40(9): 788-794
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(9): 788-794
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201712097

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收稿: 2017-12-11
修回: 2018-01-04

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