葡萄膜炎是一种常见的致盲眼病,发病机制复杂,且缺乏理想的治疗手段。内毒素诱导性葡萄膜炎作为一种经典的葡萄膜炎动物模型,通过注射革兰阴性菌细胞壁脂多糖(lipopolysaccharides,LPS)注射至动物足底、腹腔、皮下或玻璃体腔以诱导眼部急性实验性葡萄膜炎。内毒素可增强血管通透性并引起组织炎症反应,但是不同种属动物对内毒素的敏感性不同,而伤寒杆菌内毒素诱导SD大鼠的造模成功率为100%[1],故选为本研究的动物模型。
Slit2作为分泌型蛋白,在全身各器官均有表达[2],属Slit蛋白家族的一个亚型。近年来,有研究发现重组人Slit2蛋白(recombinant human slit2,rhSlit2)可减少小鼠脑缺血模型中白细胞与血管内皮细胞之间的黏附,对缺氧环境中的神经元具有保护作用[3];在大鼠肾小球肾炎模型中,rhSlit2可抑制趋化因子对白细胞的趋化作用,可减轻大鼠肾小球肾炎,改善肾功能[4],我们据此推测,rhSlit2在眼部急性葡萄膜炎中有可能存在相似的作用。而既往的研究表明LPS可通过激活PI3K/Akt信号通路,进而促使炎症因子生成[5-6],本研究在探索rhSlit2对LPS诱导的大鼠急性葡萄膜炎的作用时,进一步对大鼠眼内PI3K/Akt信号通路激活情况进行检测,旨在为葡萄膜炎的治疗寻找新的治疗靶点。
1 材料与方法 1.1 动物及分组采用重庆医科大学动物中心提供的无特定病原体级(specific pathogen free, SPF)SD大鼠,雄性,6~8周龄,体质量150~180 g。随机选择其中的48只,将其完全随机分为6组(n=8),用于临床评分、病理观察和房水检测。分别为:正常对照组;rhSlit2组:未给予LPS足底注射,单纯rhSlit2玻璃体腔注射2 μL(100 ng/眼);LPS+PBS组:双侧足底各注射LPS 50 μL (200 μg/鼠),玻璃体腔注射2 μL PBS;LPS+rhSlit2组:双侧足底各注射LPS 50 μL(200 μg/鼠),玻璃体腔注射2 μL的rhSlit2(分别为10、30、100 ng/眼组)。另24只大鼠用于炎症因子mRNA水平检测,随机分为4组(n=6):正常对照组、rhSlit2组、LPS+PBS组、LPS+rhSlit2(100 ng/眼)组;16只大鼠用于炎症因子和PI3K/Akt信号通路蛋白的检测,分组同前(n=4)。研究所设置的RhSlit2注射剂量梯度参考了JONES等[7]的研究。
1.2 主要试剂及仪器RhSlit2重组蛋白购自美国R & D公司;LPS购自Sigma-Aldrich公司;FAS眼球专用固定液购自武汉赛维尔生物科技有限公司;RIPA蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒和ECL发光试剂盒购自碧云天生物技术有限公司;大鼠IL-6、TNF-α、和内参GAPDH引物购自武汉赛维尔生物科技有限公司;IL-6抗体和TNF-α抗体购自Proteintech公司,Akt和P-Akt抗体购自Cell Signaling Technology (CST)公司,对应的荧光二抗购自Proteintech公司;正置荧光显微镜为德国莱卡DM6000B;倒置荧光显微镜为德国莱卡DMIL4000;多功能微孔板读数仪为Thermo Scientific Varioskan LUX。Trizol Reagent、PrimeScript RT reagent Kit和SYBR Premix Ex Taq Ⅱ购自Takara公司;热循环仪为Applied Biosystems Veriti Thermal Cycler;实时荧光定量PCR为Applied Biosystems 7500 Real-Time PCR System;垂直电泳槽为Bio-Rad Mini PROTEIN Tetra;凝胶发光成像系统为Bio-Rad ChemDoc XRS+。
1.3 临床评分LPS注射后24 h,由2名观察者在裂隙灯下观察各组8只大鼠眼前段情况,并各自按临床评分Hoekzema等[8]的方法进行,临床评分分值为两名观察者评分的均值。具体评分方法见表 1。
1.4 眼球形态学
LPS注射24 h后,随机选择各组3只大鼠,腹腔注射过量戊巴比妥钠安乐死后立即摘除眼球并用FAS眼球专用固定液固定过夜,梯度浓度酒精脱水,二甲苯浸泡后石蜡包埋,再沿瞳孔视神经轴做5 μm厚度的切片,脱蜡水化后行常规HE染色并在正置荧光显微镜下观察并采图。
1.5 房水蛋白测定及房水细胞计数各组剩余的5只大鼠,在腹腔注射3%戊巴比妥钠(40 mg/kg)麻醉后,给予复方托托吡卡胺眼液散瞳,盐酸奥布卡因眼液局部麻醉。在解剖显微镜下使用30G的微量注射器斜面朝向前房,行前房穿刺,并抽取房水。大鼠双眼房水混合作为一个样本进行检测。房水蛋白浓度测定时,将房水稀释30倍后,采用BCA法进行房水蛋白浓度测定。房水细胞计数前,将房水和PBS按照1 :100稀释,将10 μL悬液加入血细胞计数板,在倒置显微镜下(200×)依次计数白细胞计数区的4个大格内炎症细胞数量。前房细胞计数=(4大格细胞总数÷4)×106/mL。
1.6 Real-time PCR检测炎性因子mRNA水平在LPS注射24 h后,摘除大鼠眼球,并采用Trizol Reagent提取总RNA,参照PrimeScriptTM RT reagent Kit试剂盒说明对RNA进行逆转录,再采用SYBR ® Premix Ex TaqTM Ⅱ进行PCR荧光定量检测。引物序列见表 2。
引物名称 | 引物序列(5′-3′) | 片段长度/bp |
IL6-S | AGGATACCACCCACAACAGACC | 109 |
IL6-A | TTGCCATTGCACAACTCTTTTC | |
TNF α-S | AACAAGGAGGAGAAGTTCCCAAA | 135 |
TNF α-A | CTCCTCCGCTTGGTGGTTT | |
GAPDH-S | TTCCTACCCCCAATGTATCCG | 281 |
GAPDH-A | CATGAGGTCCACCACCCTGTT |
1.7 Western blot检测大鼠眼内炎症因子IL-6、TNF-α和P-Akt水平
在提取大鼠眼球总蛋白后,采用BCA试剂盒测定蛋白浓度。各组取蛋白40 μg进行凝胶电泳,转膜120 min,5%脱脂牛奶封闭60 min,一抗4 ℃孵育过夜;常温下孵育二抗120 min,暗室显影拍照采图。
1.8 统计学方法采用SPSS 21.0软件对数据进行分析,数据以x±s表示,进行方差齐性检验后,组间均值比较采用LSD-t分析,P<0.05为差异具有显著性。
2 结果 2.1 临床评分在LPS注射24 h后,LPS+rhSlit2(10、30、100 ng/眼)组和LPS+PBS组均可观察到明显的炎症反应;正常对照组和rhSlit2组未观察到炎症表现(见图 1A)。其中,LPS+rhSlit2(30 ng/眼)组和LPS+rhSlit2(100 ng/眼)炎症反应较LPS+PBS组轻,且具有浓度依赖性(P<0.01,图 1B)。
2.2 rhSlit2对EIU大鼠眼球组织形态学的影响
RhSlit2组大鼠未观察到眼内结构破坏,亦未见明显的炎症及其他反应,大鼠眼球内结构层次清晰。LPS造模后24 h,形态学示LPS+PBS组前房内大量纤维素样渗出,睫状体周围及玻璃体腔内可见大量胞核大深染,呈杆状、分叶形或肾形的中性粒细胞(图 2)。LPS+rhSlit2(100 ng/眼)组眼内可观察到少量纤维素及中性粒细胞渗出,与LPS+PBS组相比前房内纤维素样渗出减少,睫状体周围及玻璃体腔内的中性粒细胞数量减少。
2.3 rhSlit2对EIU大鼠房水蛋白浓度和房水细胞计数的影响
LPS注射24 h后,大鼠房水内蛋白浓度急剧升高。LPS+rhSlit2(100 ng/眼)组房水内蛋白浓度较LPS+PBS组明显降低(P<0.01,图 3A)。房水内炎症细胞计数结果呈现相似的趋势(P<0.01,图 3B)。
2.4 rhSlit2对各组大鼠眼内炎症因子IL-6和TNF-α表达的影响
LPS+rhSlit2(100 ng/眼)眼内炎症因子mRNA(P<0.01,图 4A)和蛋白(P<0.01,图 4B、4C)的表达水平较LPS+PBS组均明显下降。
2.5 RhSlit2抑制LPS诱导的PI3K/Akt信号通路的激活
LPS+rhSlit2(100 ng/眼)组大鼠眼内P-Akt较LPS+PBS组明显下降(P<0.01,图 5)。
3 讨论
Slit2作为一种分泌性糖蛋白,人类与大鼠Slit2的同源性约为95%[9]。Slit2在调节新生血管生成和内皮细胞移行中的作用被广泛关注[1];近年来,其在抑制趋化因子对白细胞募集作用方面的研究逐渐增多[2-4]。研究表明Slit2不能直接对白细胞发挥作用,而是通过降低趋化因子对白细胞的趋化作用来抑制炎症[2];KANELLIS等[4]发现rhSlit2不能使已经发生的炎症反应消失,可能只是减少炎症过程中白细胞的募集。Slit2在抑制炎症反应方面显示出了巨大的潜力,研究Slit2对眼部炎症的作用和其可能涉及的机制具有重要意义。
研究发现在LPS注射24 h后,LPS+rhSlit2(100 ng/眼)组无论是在临床表现还是眼球形态学观察中眼部炎症反应均较LPS+PBS组明显减轻。RhSlit2减少了前房和玻璃体炎症细胞浸润,同时降低了房水蛋白浓度,表明rhSlit2具有抑制眼内炎症细胞和蛋白渗出的作用。Slit2既往被认为可抑制LPS引起的血管内皮细胞间紧密连接的破坏,从而降低血管渗透性[11]。我们推测这可能是rhSlit2可对细胞间紧密连接起到保护作用;另一方面其通过抑制趋化因子的趋化作用而引起进入眼内炎症细胞数量减少,使炎症细胞释放到眼内的活性氧代谢产物、IL-6和蛋白水解酶等浓度降低,从而间接减少了血管内皮的损伤,使血管通透性降低,改善LPS诱导的炎症反应。这可能与SHERCHAN等[12]发现rhSlit2可减轻术后脑水肿的机制相一致。
EIU作为经典的人类急性葡萄膜炎模型[13],IL-6[14]和TNF-α[15]在EIU中扮演了重要作用。IL-6作为炎症急性期的促炎因子,参与多种炎症疾病过程,与炎症过程中组织损伤密切相关,其表达水平与炎症严重程度密切相关[16];TNF-α作为广泛参与多种炎症反应的细胞因子,不仅能增加血管通透性,还能诱导IL-6等炎症因子上调,从而进一步加重炎症[17]。EIU炎症改变主要以血-眼屏障破坏为主,炎症因子IL-6和TNF-α[18]参与其中。SD大鼠玻璃体腔内注射rhSlit2后,LPS引起的炎症被明显减轻,炎症因子IL-6、TNF-α眼内mRNA表达水平降低。提示rhSlit2可明显减少EIU大鼠眼内IL-6、TNF-α mRNA的表达;同样的,在炎症因子蛋白水平的检测得到了相似的结论。这表明rhSlit2玻璃体腔注射后对LPS诱导的SD大鼠眼内炎症因子的表达具有抑制作用。然而,rhSlit2对EIU炎症的抑制作用所涉及的具体信号通路尚不明确。为了验证之前的猜测,进一步对各组大鼠眼内磷酸化Akt的水平进行了检测。Akt作为PI3K下游的信号蛋白[19],其参与了多种生理过程,涉及血管生成、增殖和炎症等。在对各组大鼠眼内Akt磷酸化水平进行检测时,发现LPS+PBS组大鼠眼内Akt磷酸化水平较正常对照组和RhSlit2组明显升高;LPS+rhSlit2(100 ng/眼)组大鼠眼内Akt磷酸化水平较LPS+PBS组降低。这说明rhSlit2对LPS诱导的SD大鼠葡萄膜炎的抑制作用可能是通过抑制PI3K/Akt信号通路的磷酸化,从而抑制下游炎症因子的表达来实现的。
目前已知Slit2配体的受体Robo有4种亚型,分别为Robo1、Robo2、Robo3和Robo4,Slit2与不同的受体结合具有不同的生物学作用。在肝癌细胞体外实验证实高表达的Slit2与血管内皮细胞Robo1结合后,可促进血管内皮细胞的移行和管腔形成[20];Slit2与Robo4结合后能抑制神经胶质瘤血管的生成[21]。体外研究发现Slit2与Robo1结合具有促炎作用,而其与Robo4结合具有抑炎作用[22]。RhSlit2抑制EIU炎症反应可能是通过Slit2-Robo4通路发挥作用,在Slit2与受体Robo4结合后,抑制了PI3K/Akt信号通路的磷酸化,从而抑制炎症因子的表达。
目前葡萄膜炎治疗所依赖的糖皮质激素、免疫抑制剂和非甾体抗炎药可能带来水盐代谢紊乱、免疫力降低等不良反应。因此,探寻葡萄膜炎治疗的新方法具有十分重要的意义。本次研究中rhSlit2预处理大鼠不仅减轻了EIU大鼠眼部炎症反应;rhSlit2组在裂隙灯下未观察到明显的眼部炎症、出血和坏死等表现,眼球形态学观察见视网膜各层次清晰,结构正常。这表明该剂量的rhSlit2玻璃体腔注射后,既可减轻EIU的炎症反应,也未引起明显的不良反应,可为葡萄膜炎的治疗提供新方法,具有潜在的临床应用价值。综上所述,我们第一次在眼部炎症模型中证明了rhSlit2可减轻EIU大鼠眼部炎症,减轻前房内纤维蛋白和眼内炎症细胞的渗出,减少眼内IL-6、TNF-α的表达水平。揭示了rhSlit2可能通过抑制LPS诱导的眼内PI3K/Akt信号通路的磷酸化,从而对EIU起到抑制作用。课题计划在细胞水平进一步研究rhSlit2发挥抑制炎症作用的机制,为葡萄膜炎的治疗提供新手段。
[1] |
马翠萍, 金浩丽, 杨培增, 等. 伤寒杆菌内毒素诱导的SD大鼠全葡萄膜炎[J].
中山大学学报(医学科学版), 2001, 22(6): 451–453.
MA C P, JIN H L, YANG P Z, et al. Panuveitis induced by Salmonella typhimurium lipopolysaccharide in Sprague- Dawley rats[J]. Acad J SUM S, 2001, 22(6): 451–453. DOI:10.13471/j.cnki.j.sun.yat-sen.univ(med.sci).2001.0154 |
[2] | WU J Y, FENG L, PARK H T, et al. The neuronal repellent Slit inhibits leukocyte chemotaxis induced by chemotactic factors[J]. Nature, 2001, 410(6831): 948–952. DOI:10.1038/35073616 |
[3] | ALTAY T, MCLAUGHLIN B A, WU J Y, et al. Slit modulates cerebrovascular inflammation and mediates neuroprotection against global cerebral ischemia[J]. Exp Neurol, 2007, 207(2): 186–194. DOI:10.1016/j.expneurol.2007.06.028 |
[4] | KANELLIS J, GARCIA G E, LI P, et al. Modulation of inflammation by Slit protein in vivo in experimental crescentic glomerulonephritis[J]. Am J of Pathol, 2004, 165(1): 341–352. DOI:10.1016/S0002-9440(10)63301-9 |
[5] | SÄEmann m d, weichhart t, zeyda m, et al. Tamm-Horsfall glycoprotein links innate immune cell activation with adaptive immunity via a Toll-like receptor-4-dependent mechanism[J]. J Clin Invest, 2005, 115(2): 468–475. DOI:10.1172/JCI22720 |
[6] | JANSSENS S, BEYAERT R. Role of Toll-like receptors in pathogen recognition[J]. Clin Microbiol Rev, 2003, 16(4): 637–646. DOI:10.1128/CMR.16.4.637-646.2003 |
[7] | JONES C A, LONDON N R, CHEN H, et al. Robo4 stabilizes the vascular network by inhibiting pathologic angiogenesis and endothelial hyperpermeability[J]. Nat Med, 2008, 14(4): 448–453. DOI:10.1038/nm1742 |
[8] | HOEKZEMA R, MURRAY P I, VAN HAREN M A, et al. Analysis of interleukin-6 in endotoxin-induced uveitis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32(1): 88–95. |
[9] | LI H S, CHEN J H, WU W, et al. Vertebrate slit, a secreted ligand for the transmembrane protein roundabout, is a repellent for olfactory bulb axons[J]. Cell, 1999, 96(6): 807–818. DOI:10.1016/S0092-8674(00)80591-7 |
[10] | GUO S W, ZHENG Y, LU Y, et al. Slit2 overexpression results in increased microvessel density and lesion size in mice with induced endometriosis[J]. Reproduct Sci, 2013, 20(3): 285–298. DOI:10.1177/1933719112452940 |
[11] | ZHANG X, YU J, KUZONTKOSKI P M, et al. Slit2/Robo4 signaling modulates HIV-1 gp120-induced lymphatic hyperpermeability[J]. PLoS Pathogens, 2012, 8(1): e1002461. DOI:10.1371/journal.ppat.1002461 |
[12] | SHERCHAN P, HUANG L, WANG Y, et al. Recombinant Slit2 attenuates neuroinflammation after surgical brain injury by inhibiting peripheral immune cell infiltration via Robo1-srGAP1 pathway in a rat model[J]. Neurobiol Dis, 2016, 85(12): 164. DOI:10.1016/j.nbd.2015.11.003 |
[13] | ROSENBAUM J T, MCDEVITT H O, GUSS R B, et al. Endotoxin-induced uveitis in rats as a model for human disease[J]. Nature, 1980, 286(5773): 611–613. DOI:10.1038/286611a0 |
[14] | Hoekzema R, Murray P I, van Haren M A, et al. Analysis of interleukin-6 in endotoxin-induced uveitis[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 1991, 32(1): 88–95. |
[15] | KOIZUMI K, POULAKI V, DOEHMEN S, et al. Contribution of TNF-alpha to leukocyte adhesion, vascular leakage, and apoptotic cell death in endotoxin-induced uveitis in vivo[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci, 2003, 44(5): 2184–2191. DOI:10.1167/iovs.02-0589 |
[16] | LEU J I, CRISSEY M A S, LEU J P, et al. Interleukin-6-induced STAT3 and AP-1 amplify hepatocyte nuclear factor 1-mediated transactivation of hepatic genes, an adaptive response to liver injury[J]. Mol Cell Biol, 2001, 21(2): 414–424. DOI:10.1128/MCB.21.2.414-424.2001 |
[17] | UTSUNOMIYA I, ITO M, OHISHI S. Generation of inflammatory cytokines in zymosan-induced pleurisy in rats: TNF induces IL-6 and cytokine-induced neutrophil chemoattractant (CINC) in vivo[J]. Cytokine, 1998, 10(12): 956–963. DOI:10.1006/cyto.1998.0376 |
[18] |
邱一果, 杨红霞, 杨培增, 等. 三氮脒减轻内毒素诱导性小鼠葡萄膜炎的研究[J].
第三军医大学学报, 2013, 35(20): 2195–2198.
QIU Y G, YANG H X, YANG P Z, et al. Diminazene aceturate ameliorates endotoxin-induced uveitis in mice[J]. J Third Mil Med Univ, 2013, 35(20): 2195–2198. DOI:10.16016/j.1000-5404.2013.20.011 |
[19] | SHENG S, QIAO M, PARDEE A B. Metastasis and AKT activation[J]. J Cell Physiol, 2009, 7(19): 2991–2996. DOI:10.1002/jcp.21616 |
[20] | AO J Y, CHAI Z T, ZHANG Y Y, et al. Robo1 promotes angiogenesis in hepatocellular carcinoma through the Rho family of guanosine triphosphatases' signaling pathway[J]. Tumour Biol, 2015, 36(11): 8413–8424. DOI:10.1007/s13277-015-3601-1 |
[21] | CAI H, XUE Y, LI Z, et al. Roundabout 4 suppresses glioma-induced endothelial cell proliferation, migration and tube formation in vitro by inhibiting VEGR2-mediated PI3K/AKT and FAK signaling pathways[J]. Cell Physiol Biochem, 2015, 35(5): 1689–1705. DOI:10.1159/000373982 |
[22] | ZHAO H, ANAND A R, GANJU R K. Slit2-Robo4 pathway modulates LPS-induced endothelial inflammation and its expression is dysregulated during endotoxemia[J]. J Immunol, 2014, 192(1): 385–393. DOI:10.4049/jimmunol.1302021 |