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碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白在Origami2体系中的可溶表达及二者促成骨的协同效应
涂兵1, 叶吉星1, 甘翼搏1, 张立泰1, 欧阳斌1, 罗向东2, 周强1     
1. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院:全军矫形外科中心,组织工程国家地方联合工程实验室,重庆市再生重建医学工程技术研究中心,重庆市组织工程实验室;
2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院:全军烧伤研究所,创伤、烧伤与复合伤国家重点试验室
[摘要] 目的 建立优化高效的碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)、骨形态发生蛋白2(bone morphogenetic protein,BMP-2)蛋白重组方法,阐明二者在促成骨中的协同效应。方法 优化bFGF和BMP-2成熟肽的基因序列密码子,获得适用于大肠杆菌Origami2体系表达的bFGF及BMP-2成熟肽cDNA片段;利用PCR法将bFGF成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pColdⅡ中,构建重组原核表达质粒pColdⅡ-bFGF;利用PCR法将BMP-2成熟肽cDNA片段插入原核表达质粒pET-30a(+)中,构建重组原核表达质粒pET-30a(+)-BMP-2,转入大肠杆菌Origami2中表达纯化;运用双酶切、质粒测序及Western blot技术证明Origami2表达体系的构建效果;进行细胞增殖实验、碱性磷酸酶(alkaline phosphates, ALP)染色观察和体内成骨效率检测等,探索bFGF、BMP-2在促成骨中的协同效应。结果 双酶切和质粒测序鉴定证明成功构建重组大肠杆菌pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,Western blot检测发现蛋白正确表达。经过Ni-NTA亲和层析纯化后bFGF及BMP-2纯度高达90%。通过对二者比例的优化筛选,发现40 ng/mL bFGF+40 ng/mL rhBMP-2时,大鼠骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)增殖效率、ALP活性及体内成骨效率最高,是二者促成骨的最优效组合。结论 成功构建高效表达的pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,实现了bFGF及BMP-2的高效表达。bFGF和BMP-2的优化联合应用具有促成骨协同效应。
[关键词] 碱性成纤维细胞生长因子     骨形态发生蛋白2     基因重组     协同效应     成骨    
Soluble expression of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein in Origami2 system and their synergistic effect to promote osteogenesis
TU Bing1 , YE Jixing1 , GAN Yibo1 , ZHANG Litai1 , OUYANG Bin1 , LUO Xiangdong2 , ZHOU Qiang1     
1. Department of Orthopedics, National & Regional United Engineering Laboratory of Tissue Engineering, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China;
2. Stace Key Laboratory of Trauma, Burns and Combined Injury, Institution of Burn Research, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
Supported by the Key Project of Military Logistics(BWS13C014-1), the Military Medical Innovation Plan of Southwest Hospital (SWH2016JSZD-01) and the Preresearch Fund of Military Medicine of Third Military Medical University (SWH2013JS04)
Corresponding author: ZHOU Qiang, E-mail: zq_tlh@163.com
[Abstract] Objective To establish recombinant expression systems for basic fibroblast growth factor (bFGF) and bone morphogenetic protein (BMP-2) and investigate the synergetic effect of bFGF and BMP-2 in promoting osteogenesis. Methods The codons encoding mature peptide sequences of bFGF and BMP-2 gene were optimized and their cDNA fragments capable of expressions in E.coli Origami2 system were obtained. Using PCR method, the mature peptide cDNA fragments of bFGF and BMP-2 were separately inserted in the prokaryotic expression plasmids pColdⅡ and pET-30a (+) to construct the recombinant expression plasmids pColdⅡ-bFGF and pET-30a (+)-BMP-2, respectively. The plasmids were transferred into E.coli Origami2 for expression and the products were purified. Double enzyme digestion, sequencing analysis and Western blotting were used to verify the established Origami2 expression systems. The synergetic effect of the recombinant bFGF and BMP-2 proteins in promoting osteogenesis was tested by observing their effect on proliferation of rat one marrow mesenchymal stem cells (BMSCs), ALP activity in mouse C2C12 myoblasts and osteogenesis of BMSCs in rat quadriceps femoris in vivo. Results Double enzyme digestion and sequencing analysis verified successful construction of recombinant E.coli pColdⅡ-bFGF/Origami2 and pET30a (+)-BMP-2/Origami2 expression systems. Western blotting demonstrated expressions of the two target proteins in the expression systems, and after purification with Ni-NTA affinity chromatography, the expressed bFGF and BMP-2 proteins reached a purity as high as 90%. At the optimized ratio, bFGF (40 ng/mL) combined with rhBMP2 (40 ng/mL) obviously promoted the proliferation of rat BMSCs, enhanced ALP activity in C2C12 myoblasts, and efficiently promoted ectopic osteogenesis of BMSCs in rat quadriceps femoris. Conclusion We successfully constructed pColdⅡ-bFGF/Origami2 and pET30a (+)-BMP-2/Origami2 expression systems for efficient expression of bFGF and BMP-2. At the optimized ratio, bFGF and BMP-2 produce a synergistic effect to promote osteogenesis of BMSCs.
[Key words] basic fibroblast growth factor     bone morphogenetic protein     genetic recombination     synergistic effect     osteogenesis    

碱性成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,bFGF)属成纤维细胞生长因子家族之一[1]。bFGF可促进成纤维细胞、血管内皮细胞及骨髓间充质干细胞(bone marrow mesenchymal stem cells,BMSCs)高效增殖,增强新生毛细血管的形成,显著增加新生肉芽组织中毛细血管数量和血液流量,提供充足的氧和营养物质,为组织修复和再生提供适宜的微环境[2-3]。骨形态发生蛋白(bone morphogenetic protein,BMP)属于转化生长因子(TGF-β)超家族成员,是由骨基质分泌的一种疏水性蛋白[4]。其中,BMP-2是目前研究最为广泛、诱导成骨活性效果最好的BMP之一,具有促进BMSCs向成骨中心募集以及向成骨细胞分化的作用[5],同时可使成肌细胞、成纤维细胞及骨髓的基细胞逆转分化为骨系细胞,进而诱导异位骨形成和促进骨折愈合[6]。近年bFGF和BMP-2的应用领域不断拓展和延伸[7],但bFGF和BMP-2因子的合成方法效率低下、价格昂贵,给实验研究及临床应用带来一定的局限。本研究成功构建了简便、快捷、高效表达的重组大肠杆菌pColdⅡ-bFGF/Origami2和pET30a(+)-BMP-2/Origami2表达体系,可提高bFGF和BMP-2产量、缩短合成时间、降低成本,有利于bFGF和BMP-2的产业化。通过验证表达蛋白的生物学活性,优化bFGF和BMP-2的最优组合,协同促进体外BMSCs增殖、成骨分化和体内成骨[8],以期为骨组织工程仿生骨的研制打下基础。

1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂

NdeⅠ、XhoⅠ、Nde1、BamH1内切酶、T4连接酶和Taq DNA聚合酶(货号分别为1618、1635、6022和R001A)均购自宝生物工程有限公司,凝胶回收试剂盒(货号D2500)、质粒提取试剂盒(货号D6943)购自OMEGA公司,大肠杆菌Origami2感受态细胞(货号71346)购自Millipore公司,Ni-NTA纯化柱(货号17-5268-01)购自GE公司,小鼠成肌细胞C2C12(货号CL-0044)购自武汉普诺赛生命科技有限公司,碱性磷酸酶检测试剂盒(货号A059)购自南京建成生物工程研究所,DNA测序与引物合成由北京六合华大基因科技有限公司完成,其他试剂为国产分析纯。

1.2 bFGF、BMP-2目的基因与引物的设计与合成

依据GenBank公布bFGF、BMP-2成熟肽基因序列,优化密码子使其符合原核表达系统,并在N端插入6个组氨酸标签及在两端添加酶切位点序列,最终得到bFGF、BMP-2目的基因cDNA。利用Primer Premier 5.0软件设计引物。bFGF上游引物为5′-CCGGCTCTGCCGGAAGAT-3′,下游引物为5′-CATCGGCAGAAACAGAATCG-3′,片段大小为18 bp;BMP-2上游引物为5′-CAAGCAAGCGAAACACAAACAG-3′,下游引物为5′-CTCAGCGACAACCGCAGCCTT-3′,片段大小为22 bp。将设计的cDNA和引物送北京六合华大基因科技有限公司合成。

1.3 重组载体质粒pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2的构建

pColdⅡ质粒与bFGF目的基因cDNA用NdeⅠ、XhoⅠ酶切体系双酶切,pET30a质粒与BMP-2目的基因cDNA用Nde1、BamH1酶切体系双酶切,产物用1%琼脂糖凝胶电泳并回收电泳条带。将酶切产物按照10×T4 Buffer 2.5 μL、BMP-2 0.3 pmol、pET30a 0.03 pmol、T4 ligase 1 μL、去离子水25 μL连接体系连接,涡旋混匀,放入16 ℃水浴连接过夜。将连接好的质粒转化入感受态细胞Top10中保存,并提取10 μL菌液送北京六合华大基因科技有限公司测序。利用DNAMAN软件分析测序结果,与bFGF、BMP-2基因序列比对,选择完全正确的质粒命名为pColdⅡ-bFGF、pET30a (+)-BMP-2。

1.4 表达菌株pColdⅡ-bFGF/Origami2、pET30a(+)-BMP-2/Origami2的构建

取实验室保存的Origami2菌液,解冻,用接种针蘸取后在含有氯霉素的LB平板上划线,37 ℃培养过夜。挑取单菌接种到10 mL含氯霉素的LB培养基,37 ℃摇床,250 r/min培养14 h。取1 mL菌液加到100 mL不含抗生素的LB培养基中,37 ℃,250 r/min震荡培养至波长600 nm处的吸光度值[D(600)]达到0.3~0.5。将鉴定出的阳性克隆子pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2转化到Origami2感受态细胞中,取50 μL培养的菌液涂布在含有卡拉霉素及氯霉素的LB平板上,37 ℃培养14 h,至有白色的单个菌落出现。挑取单菌加到10 μL的ddH2O中,进行PCR检测,PCR反应条件:95 ℃反应5 min;95 ℃变性30 s,63 ℃退火30 s,72 ℃延伸90 s,共30个循环;72 ℃延伸10 min,4 ℃保存。紫外光下验证,若对应位置有目的条带出现,证明阳性克隆子已转化进入大肠杆菌Origami2中。

1.5 重组质粒pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2在Origami2体系的表达

将10 μL分别含有pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2的大肠杆菌Origami2接种到10 mL LB培养基中,培养过夜。分别取1 mL菌液转入20 mL LB培养基中,37 ℃,250 r/min离心2 h,培养至D(600)值=0.4~0.5时,在冰水中冷却培养液到15 ℃,放置30 min。加入异丙基β-D-硫代半乳糖苷(IPTG)至终浓度为1 mmol/L,15 ℃,诱导表达14 h。10 000 r/min离心10 min收集沉淀,用PBS洗涤后超声破碎,再次10 000 r/min离心10 min,取上清保存。取10 μL上清进行SDS-PAGE电泳,考马斯蓝亮蓝染色30 min,脱色液脱色过夜,在凝胶电泳成像系统下观察是否有条带,若有特异条带,表明重组蛋白已表达,并根据条带颜色的深浅及宽度判断最适的表达时间。同时,将目的条带的蛋白送公司检测氨基酸序列,并与预期的氨基酸序列比对,检测表达的准确性。

1.6 重组蛋白bFGF、BMP-2的纯化

把表达获得的重组蛋白bFGF、BMP-2上清分别加入含1 mL Ni-NTA的纯化柱中,流速0.5 mL/min,待上清全部流出后,加入4 mL Wash Buffer,重复4次,然后依次加入2.5 mL Elution Buffer,开始收集洗脱液。将纯化后的洗脱液过脱盐柱,用4 mL去离子水洗脱得到BMP-2蛋白样品。并对蛋白进行SDS-PAGE检测,BCA法测定纯化蛋白的浓度,根据浓度用浓缩管对洗脱液进行浓缩。经无菌过滤后,-20 ℃保存。

1.7 蛋白质免疫印迹法(Western blot)鉴定重组蛋白bFGF、BMP-2

纯化后的bFGF、BMP-2蛋白样品用5×上样缓冲液稀释使上样量为20 μL,煮沸变性10 min,上样后进行SDS-PAGE电泳,5%浓缩胶80 V、30 min,12%分离胶110 V、60 min,聚偏二氟乙烯膜于冰浴中转膜(250 mA、45 min),将聚偏二氟乙烯膜置于5%脱脂奶粉中,摇床室温封闭1 h,加裁剪开模分别加入bFGF、BMP-2一抗体封闭过夜。TBST洗膜4次,每次10 min,37 ℃孵育二抗1 h,TBST洗膜4次,每次10 min,显影直至目的条带清晰。

1.8 成骨相关研究的实验分组

组1:等体积的PBS作为空白对照;组2:培养液中加入80 ng/mL bFGF;组3:培养液中加入80 ng/mL BMP-2;组4:培养液中含20 ng/mL bFGF+60 ng/mL BMP-2;组5:培养液中含60 ng/mL bFGF+20 ng/mL BMP-2;组6:培养液中含40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2。

1.9 细胞增殖实验检测bFGF、BMP-2协同促进BMSCs增殖实验

将鼠BMSCs制成悬液并计数,按1×103/孔接种于24孔板,分组加入不同浓度bFGF、BMP-2 1 mL。每日在倒置显微镜下观察计数各组细胞,绘制生长曲线并用MTT细胞增殖检测试剂盒检测BMSCs第1、3、5天的增殖活性。

1.10 碱性磷酸酶(alkaline phosphates, ALP)染色

培养小鼠成肌细胞C2C12,按1×103/孔接种于24孔板,分组加入不同浓度bFGF、BMP-2 1 mL。诱导培养4 d后收集细胞,用PBS缓冲液洗涤2次后利用ALP检测试剂盒测定酶活力,通过标准曲线计算ALP活力。相同条件下诱导培养4 d的细胞,用ALP染色试剂盒进行染色实验。每一个实验重复3次。

1.11 bFGF、BMP-2协同成骨动物实验

将吸入上述溶液的明胶海绵冻干埋入大鼠的股四头肌内,手术过程如下:7%水合氯醛腹腔内注射麻醉,成功后备皮,常规消毒铺巾,选取SD大鼠右大腿后方中上侧,作一切口长约1 cm,分离筋膜后暴露股四头肌,在肌肉上钝性分离,沿肌纤维方向做一长、深均为0.5 cm的肌袋(勿穿破肌肉),植入冻干样品,缝合肌袋及皮肤,标记。左侧大腿为阴性对照组,植入含有相同体积PBS的明胶海绵。术后青霉素20万U腹腔内注射,连续3 d。0、2、4周时X线检查,观察成骨量。

1.12 统计学分析

定量实验独立重复3次,数据符合正态分布,计量资料数据以x±s表示,行单侧Student’s t检验,检验标准α=0.01。

2 结果 2.1 重组质粒pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2成功构建

重组质粒pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2的相对分子质量约为350 bp(图 1),与理论重组BMP-2基因大小一致。DNA测序结果显示,重组质粒pColdⅡ-bFGF完全符合bFGF理论DNA序列,重组质粒pET30a (+) -BMP-2完全符合BMP-2理论DNA序列。因此,重组质粒pColdⅡ-bFGF、pET30a(+)-BMP-2成功构建。

M:核酸分子量标志;1:pColdⅡ-bFGF质粒;2:pET30a(+)-BMP-2质粒 图 1 重组质粒凝胶电泳图

2.2 重组蛋白bFGF及BMP-2成功表达

纯化bFGF和BMP-2的SDS-PAGE电泳和考马斯亮蓝染色显示蛋白质条带均位于约17×103,与bFGF、BMP-2蛋白质大小一致。蛋白质谱测序结果显示随机中断bFGF及BMP-2肽完全符合bFGF及BMP-2理论蛋白质序列(图 2)。说明表达的蛋白为bFGF和BMP-2。

M:蛋白质标记;1:从上层清液中提取的目标蛋白;2:纯化的目标蛋白
A:bFGF蛋白;B:BMP-2蛋白
图 2 重组蛋白的凝胶电泳

2.3 Western blot鉴定bFGF、BMP-2蛋白表达

Western blot检测bFGF与BMP-2单克隆抗体特异性显色,17×103处有明显条带(图 3),说明表达的蛋白为bFGF和BMP-2。

M:核酸分子量标志;1:bFGF蛋白;2:BMP-2蛋白 图 3 Western blot检测bFGF与BMP-2蛋白表达

2.4 BCA法检测重组蛋白bFGF与BMP-2的表达产量

BCA法检测可溶表达bFGF与BMP-2蛋白产量, 分析每摇菌1 L Origami2大肠杆菌的总蛋白和纯化后得到的bFGF与BMP-2目的蛋白量以及二者的比例,发现Origami2体系中的表达目的纯度高,生产效率较高(表 1)。

表 1 bFGF与BMP-2蛋白表达产量分析
蛋白 纯化后
(x±s,mg)
总蛋白
(x±s,mg)
比例
(%)
bFGF 5.74±0.16 21.91±0.58 26.20
BMP-2 4.12±0.14 14.50±0.37 28.41

2.5 细胞计数法检测联合应用bFGF与BMP-2后BMSCs细胞生长曲线

将BMSCs在接种后第1~5天进行计数,各组细胞计数均有不同程度的提高,且随着bFGF与BMP-2蛋白总量比例越接近,细胞数目越大。表明相比单独应用,联合应用bFGF和BMP-2促BMSCs增殖的效果更为显著,其中,组6(40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2)的增殖效果最明显(图 4)。

图 4 MTT法检测联合应用bFGF与BMP-2后BMSCs细胞生长曲线

2.6 MTT法检测联合应用bFGF与BMP-2后BMSCs增殖情况

MTT检测结果显示:组3、4、5的增殖效果均显著高于组1(P < 0.05);组1与组2差异无统计学意义(P>0.05),表明联合应用bFGF和BMP-2促BMSCs增殖的效果较二者单独应用显著,bFGF与BMP-2蛋白比例越接近,增殖效果越明显。其中,组6(40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2)的增殖效果最明显(图 5)。

a: P < 0.05,与空白对照组比较;b:P < 0.05,与组3~5比较 图 5 MTT检测联合应用bFGF与BMP-2后BMSCs增殖情况

2.7 ALP染色观察联合应用bFGF与BMP-2后C2C12细胞的成骨分化效果

不同浓度的bFGF和BMP-2分别作用于C2C12细胞4 d后,ALP染色显示,单独bFGF无促进成骨活性,联合应用bFGF和BMP-2促BMSCs成骨分化的效果较二者单独应用显著,bFGF与BMP-2蛋白比例越接近,ALP活性越高(图 6)。其中,组6(40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2)成骨分化效果最明显,与细胞增殖实验结果一致。

A:空白对照组;B:80 ng/mL bFGF组;C:80 ng/mL BMP-2组;D:20 ng/mL bFGF+60 ng/mL BMP-2组;E:60 ng/mL bFGF+20 ng/mL BMP-2组;F:40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2组 图 6 ALP染色观察各组处理4 d后C2C12细胞的成骨分化效果(×40)

2.8 bFGF和BMP-2协同促进异位骨形成和成骨分化

4周X线检测显示单独bFGF无促进成骨活性,联合应用bFGF和BMP-2促成骨效果较单独应用BMP-2显著提高,bFGF与BMP-2蛋白比例越接近,成骨效果越明显。其中,组6(40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2)成骨效果最明显(图 7),与细胞实验结果一致。

→:成骨区域    A:空白对照组;B:80 ng/mL bFGF组;C:80 ng/mL BMP-2组;D:20 ng/mL bFGF+60 ng/mL BMP-2组;E:60 ng/mL bFGF+20 ng/mL BMP-2组;F:40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2组 图 7 大鼠肌袋异位成骨X线检测

3 讨论

本研究构建了可溶表达bFGF和BMP-2的Origami2体系,经镍柱亲和层析纯化,得到纯度约95%的目的蛋白,Western blot分析发现bFGF和BMP-2与单克隆抗体特异性结合、显色,说明表达的目的蛋白具有高纯度、高特异性的特点。通过细胞增殖实验、ALP染色和体内成骨等检测方法,探索bFGF、BMP-2在促成骨中的协同效应,得出bFGF与BMP-2的联合促进成骨的最佳比例,为下一步研究bFGF与BMP-2促成骨机制,研发骨活性修复材料奠定基础[9]

BMSCs因取材、分离方便,易于长期培养和传代,且无明显的自体移植免疫排斥反应,被认为是骨组织工程较为理想的种子细胞[10]。但骨髓中BMSCs数量有限,在体外传代培养后细胞增殖能力和分化潜能下降,导致成骨效果不佳。如何利用生长因子促进BMSCs的增殖及成骨分化以达到有效组织工程成骨是目前的研究难点。以往研究表明,包括bFGF、BMP-2、PDGF、TGF等多种生长因子参与调控BMSCs增殖和骨向分化,调节骨和软骨基质的合成与降解[11],其中bFGF、BMP-2促成骨效果最为显著。BMP-2可以显著促进BMSCs的骨向分化[12],bFGF能显著促进BMSCs的增殖[13]。研究这两种生长因子在骨诱导、骨形成中的调节机制,不同质量浓度比例的组合加速骨诱导、骨形成过程,有望为新型活性植骨材料的研制奠定理论基础[14]。本研究观察不同浓度的BMP-2和bFGF体内外成骨协同效应,优化筛选促成骨的最佳浓度组合,发现单独使用bFGF能促BMSCs增殖但无促BMSCs成骨分化活性,单独使用BMP-2能促BMSCs成骨分化但促BMSCs增殖效果欠佳。联合应用bFGF和BMP-2较二者单独应用促BMSCs增殖分化效果显著,并且bFGF与BMP-2蛋白总量比例越接近,增殖效果越明显,40 ng/mL bFGF+40 ng/mL BMP-2增殖效果最明显。两者对BMSCs成骨分化有明显的协同增强效应。总之,BMP-2和b-FGF联合应用促进BMSCs增殖同时也不同程度地促进其成骨分化,两者对BMSCs有明显的协同增强效应,作用效果最佳的组合及更高浓度的作用效果有待进一步研究。

随着骨组织工程和医学研究的进步以及临床应用的加深,对于功能改进的天然蛋白质的需求将更加迫切[15-17]。本研究提供的bFGF、BMP-2蛋白表达体系虽然能得到目的蛋白,但是仅限于实验研究,目前其产量、纯度、活性等还不能满足骨修复临床需求标准,下一步研究需优化此表达体系,进一步提高目的蛋白的产量、纯度、活性等,并完善bFGF、BMP-2蛋白协同促成骨的机制研究。深化研究bFGF、BMP-2蛋白缓释系统[18],并与骨修复材料结合,使此体系在骨组织工程和医学研究领域具有广泛的应用前景[19]

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201712042
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

涂兵, 叶吉星, 甘翼搏, 张立泰, 欧阳斌, 罗向东, 周强.
TU Bing, YE Jixing, GAN Yibo, ZHANG Litai, OUYANG Bin, LUO Xiangdong, ZHOU Qiang.
碱性成纤维细胞生长因子和骨形态发生蛋白在Origami2体系中的可溶表达及二者促成骨的协同效应
Soluble expression of basic fibroblast growth factor and bone morphogenetic protein in Origami2 system and their synergistic effect to promote osteogenesis
第三军医大学学报, 2018, 40(10): 882-888
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(10): 882-888
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201712042

文章历史

收稿: 2017-12-05
修回: 2018-03-09

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