人参是五加科物人参Panax ginseng C.A, Mey.的干燥根，是我国传统珍贵的中药材，具有对多种疾病防治效果和对人体滋补强壮作用，其主要有效成分为人参皂苷和人参多糖[1]。人参皂苷Rg3是从中药人参中提取的单一成分[2]，是一种四环三萜皂苷，为原人参二醇型皂苷，是人参中的微量皂苷，分子式为C42H72O13，相对分子质量为784[3]。人参皂苷Rg3在抗肿瘤方面有明显的药理作用，它具有最佳的细胞凋亡效应，能选择性地抑制肿瘤细胞转移，提高机体免疫功能，临床批准于癌症治疗[4-5]。
人参皂苷Rg3作为一种抗肿瘤药物进入体内，经过吸收分布代谢排泄等一系列过程，因此人参皂苷Rg3的药代动力学研究必不可少[6]。人参皂苷Rg3在大鼠[3, 7-9]、狗[10]、人体[11-12]内的药代动力学研究已有报道，但在文献[3, 7-9]报道中人参皂苷Rg3在大鼠体内的药动学参数存在较大差异。因此本研究以大鼠作为实验动物，研究口服灌胃后的人参皂苷Rg3在大鼠体内的药代动力学过程，为新药开发和吸收机制进一步研究提供参考。人参皂苷Rg3的血药浓度测定主要采用液相色谱-蒸发光散射检测法、液相色谱-紫外检测法(LC-UV)和液相色谱-串联质谱法(LC-MS/MS)。由于大鼠眼眶取血采血体积小且人参皂苷Rg3在大鼠体内的血药浓度很低，而文献[7-9, 11]报道的方法存在灵敏度不高、预处理方法成本高、取样量大等问题，不能满足本实验的需求。本实验在文献[7-14]的基础上建立了快速、灵敏、经济、取样量少的液相色谱-质谱联用法，并将该法用于人参皂苷Rg3在大鼠体内药代动力学研究。
1 材料与方法 1.1 仪器SHIMADZU SIL-30AC高效液相色谱仪，AB Sciex QTRAP 5500质谱仪；冷冻离心机(美国Thermo公司)；超纯水器(Milli-Q plus，USA，Millipore公司)；KQ-400KDE型高功率数控超声波清洗器(昆山市超声仪器有限公司)；BT-Ⅱ水浴式氮吹仪(北京踏锦科技有限公司)；GENIUS 3型漩涡混匀器(德国IKA)；BP211D型赛多利斯电子天平(德国赛多利斯公司)；数据采集和处理系统：Analyst1.6.2。
1.2 药品与试剂人参皂苷Rg3对照品：CFS201601，含量98%，Chem Faces公司；三七皂苷R1对照品：Must-12020215，含量98%，Chengdu Must Bio-Technology Co.；甲醇、乙腈、乙酸乙酯(色谱纯)美国迪马公司；乙酸铵(色谱纯)，FLUKA公司；水为超纯水。
1.3 实验动物6~8周SD大鼠，6只，体质量210~230 g，雄性，由陆军军医大学实验动物中心提供，许可证号SCXK(渝)-2017-0002。
1.4 方法 1.4.1 实验方案将健康雄性SD大鼠6只，实验前禁食12 h，次日空腹灌胃20 mg/kg人参皂苷Rg3。给药后于0.25、0.5、1、1.5、2、3、4、6、8、10、12 h从大鼠眼眶静脉取血0.3 mL置于肝素抗凝管中，3 000 r/min离心5 min，取上清液于-70 ℃冰箱保存待测。HPLC-MS/MS法测定大鼠血浆中人参皂苷Rg3浓度，采用DAS 3.3.1软件对血药浓度数据进行分析，非房室模型方法计算药代动力学统计矩参数。
1.4.2 色谱条件色谱柱：Inertsil ODS-3(2.1 mm× 50 mm，5 μm)，Dikma公司生产；柱温：35 ℃；流动相：乙腈﹕10 mmol/L乙酸铵水溶液(含0.1%甲酸)= 90 :10；流速：0.4 mL/min；进样量：5 μL。
1.4.3 质谱条件ESI离子源：离子源电压：-4 500 V，离子源温度：450.0 ℃；检测方式：多反应监测(MRM), 负离子模式；定量分析监测离子对：人参皂苷Rg3：783.3→161.0，去簇电压(DP)：-5.5 V，碰撞能(CE)：-43.4 V；三七皂苷R1：931.3→637.3(图 1)；去簇电压(DP)：-195.0 V；碰撞能(CE)：-48.0 V。
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| 图 1 人参皂苷Rg3(A)和三七皂苷R1(B)质谱分析 |
1.4.4 溶液的配制
精密称取人参皂苷Rg3对照品适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为1.0 mg/mL的储备液，用甲醇稀释成浓度为0.2、0.4、0.8、2、4、8、20、40 μg/mL人参皂苷Rg3系列标准液；精密称取三七皂苷R1对照品适量，置于10 mL容量瓶中，用甲醇溶解并稀释至刻度，获得浓度为1.0 mg/mL的储备液，用甲醇稀释成浓度为5 μg/mL三七皂苷R1内标溶液；4 ℃冰箱保存备用。
1.4.5 样品处理取待测血浆0.05 mL，加入10 μL三七皂苷R1内标甲醇溶液(5 μg/mL)，混匀30 s；加入1 mL乙酸乙酯，混匀提取5 min，离心5 min(13 000 r/min)，取上清液900 μL，40 ℃氮气吹干，0.1 mL乙腈复溶，5 μL进样测定。
1.4.6 专属性分别取6只大鼠空白血浆、空白血浆加人参皂苷Rg3 40 ng/mL和三七皂苷R1 500 ng/mL以及大鼠灌胃给药后1.5 h的血浆样品，按“2.5”项下操作考察人参皂苷Rg3和三七皂苷R1的专属性。
1.4.7 标准曲线和定量下限从浓度分别为0.2、0.4、0.8、2、4、8、20、40 μg/mL人参皂苷Rg3系列标准液中各取10 μL分别加入990 μL空白血浆中，得浓度分别为2、4、8、20、40、80、200、400 ng/mL的人参皂苷Rg3血样。按样品处理方法处理后进样分析，以待测物浓度X为横坐标，待测物与内标的峰面积比值Y为纵坐标，进行回归运算求得人参皂苷Rg3的标准曲线。配制成相当于人参皂苷Rg3血浆浓度为2 ng/mL的样品，对该浓度样品进行5样本分析，并根据当日标准曲线计算每一样本测得浓度即为定量下限。
1.4.8 基质效应分别取6只大鼠100 μL空白血浆按“1.4.5项”下处理血样，取乙腈复溶液作为溶剂，配制与质控样品浓度一致的低、高浓度质控样品进样后所得峰面积为AMatrix；另用乙腈作溶剂配制与其相同浓度的低、高浓度对照品进样后所得峰面积为AStandard，按公式AMatrix·AStandard-1×100%计算所得基质效应因子MF(matrix factor，MF)，同法处理内标得到内标的MF，人参皂苷Rg3与内标的比值为内标归一化基质效应因子(IS-normalized MF)。
1.4.9 精密度与准确度按“1.4.7”项下的方法配制最低定量限、低、中、高4个浓度的质控样品，每一浓度进行5样本分析，在同一批内计算本法的批内精密度；连续测定3批，计算本法的批间精密度；同法配制最低定量限、低、中、高4个浓度的质控样品，每一浓度进行5样本分析，根据标准曲线计算所得浓度与理论浓度的比值即为相对回收率。
1.4.10 提取回收率按“1.4.7”项下的方法配制低、中、高3个浓度的质控样品，每一浓度进行5样本分析；另用乙腈作溶剂配制与血浆处理后乙腈复溶后进样浓度相同的低、中、高浓度的对照品溶液，每一浓度进行5样本分析，每一浓度两种处理方式的峰面积比值计算提取回收率。
1.4.11 稳定性配制低、中、高3个浓度的血浆样品，每一种浓度水平进行3样本分析，分别考察人参皂苷Rg3血浆样品经处理后室温放置5 h的稳定性，血浆样品室温放置2 h的稳定性，血浆样品经历3次冷冻-解冻循环的稳定性，血浆样品-70 ℃冷冻保存16 d的稳定性。
2 结果 2.1 专属性本实验条件下，人参皂苷Rg3和三七皂苷R1的保留时间分别为0.64、0.34 min，空白血浆中的内源性物质不干扰人参皂苷Rg3和三七皂苷R1的测定(图 2)。
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| A：空白血浆；B：空白血浆+人参皂苷Rg3(40 ng/mL)+三七皂苷R1(500 ng/mL)；C：大鼠灌胃给药人参皂苷Rg3 20 mg/kg后1.5 h血浆样品分析 图 2 大鼠血浆中人参皂苷Rg3和三七皂苷R1典型色谱分析 |
2.2 标准曲线和定量下限
以人参皂苷Rg3浓度X为横坐标，人参皂苷Rg3与三七皂苷R1的峰面积比值Y为纵坐标，进行回归运算得标准曲线方程为Y=0.004 51X+0.000 172(权重系数1/X2)，R=0.998 9。人参皂苷Rg3的线性范围为2~400 ng/mL。人参皂苷Rg3的定量下限为2 ng/mL，该浓度下人参皂苷Rg3的RSD为7.65%。
2.3 基质效应人参皂苷Rg3低浓度相对基质效应分别为(98.78±4.18)%，高浓度相对基质效应为(100.31±2.19)%，RSD分别为4.24%，2.19%(表 1)。
| 理论浓度 /ng·mL-1 |
批内精密度(n=5) | 批间精密度(n=15) | 相对回收率 | 提取回收率 (%) |
基质效应 (%) |
|||||
| 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | |||||
| 2 | 2.06±0.08 | 3.92 | 1.98±0.17 | 8.56 | 2.11±0.07 | 3.40 | - | - | ||
| 4 | 4.53±0.32 | 6.96 | 4.21±0.38 | 8.96 | 4.24±0.27 | 6.36 | 76.89±2.91 | 98.78±4.18 | ||
| 40 | 45.28±2.69 | 5.95 | 41.69±4.75 | 11.38 | 43.98±2.15 | 4.88 | 73.17±3.97 | － | ||
| 320 | 331.20±12.36 | 3.73 | 323.47±26.31 | 8.13 | 347.60±12.46 | 3.59 | 72.24±0.96 | 100.32±2.13 | ||
2.4 精密度与准确度
人参皂苷Rg3每一浓度水平样品的批内精密度RSD在3.73%~6.96%之间；批间精密度RSD在8.13%~11.38%之间；相对回收率RSD在3.40%~6.36%之间(表 1)。
2.5 提取回收率低、中、高3个浓度的质控样品提取回收率，结果见表 1。
2.6 稳定性考察了人参皂苷Rg3血样经处理后室温放置5 h，血样室温放置2 h，血样经历3次冷冻-解冻循环，血样-70 ℃冷冻保存16 d的稳定性。各样品浓度的RSD＜±15%，结果见表 2。
| 理论浓度/ng·mL-1 | 室温放置 | 处理后稳定性 | 反复冻融3次 | 冷冻稳定性 | |||||||
| 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | 测得浓度 /ng·mL-1 |
RSD(%) | ||||
| 4 | 4.25±0.20 | 4.72 | 4.03±0.34 | 8.42 | 4.11±0.39 | 9.41 | 3.96±0.46 | 11.51 | |||
| 40 | 42.18±3.34 | 7.91 | 40.22±4.98 | 12.38 | 39.76±3.31 | 8.32 | 39.87±4.32 | 10.83 | |||
| 320 | 326.33±17.27 | 5.29 | 311.67±32.10 | 10.30 | 302.89±17.40 | 5.74 | 300.13±30.37 | 10.15 | |||
2.7 药代动力学试验结果 2.7.1 药-时曲线
采用本试验建立的方法对6只大鼠口服灌胃20 mg/kg人参皂苷Rg3后血浆浓度进行测定，平均血药浓度-时间曲线见图 3。
|
| 图 3 平均血药浓度-时间曲线 |
2.7.2 药代动力学参数
采用DAS 3.3.1软件非房室模型方法对其药动学参数进行统计，其主要药动学参数t1/2、Tmax、Cmax、AUC0~t、AUC0~∞、CLZ结果见表 3。
| 药代动力学参数 | Rg3 |
| AUC0-t | 821.659±170.125 ng·h/mL |
| AUC0-∞ | 912.468±190.653 ng·h/mL |
| Cmax | 138.803±28.997 ng/mL |
| t1/2 | 2.803±0.263 h |
| Tmax | 3.667±0.516 h |
| CLZ | 22.794±5.134 L/(h·kg) |
3 讨论
本实验建立了测定大鼠血浆中人参皂苷Rg3的HPLC-MS/MS分析方法，并运用本实验建立的方法测定了6只大鼠口服灌胃人参皂苷Rg3后大鼠血浆中人参皂苷Rg3的浓度。测得的大鼠血浆中人参皂苷Rg3血药浓度个体间差异较大，所得的药动学参数与文献[8-9]报道一致。
分析测试过程中采用负离子模式进行检测，人参皂苷Rg3在正、负离子模式下虽均有响应，但正离子模式分析时在标准曲线浓度范围内不成线性关系。提示正离子模式下[M+Na]+离子化效率不稳定，仅可用于定性分析。据文献[9, 11]报道采用固相萃取方法对样品进行预处理，该方法操作较为复杂且SPE柱成本较高。样品预处理我们采用了甲醇、乙腈沉淀蛋白、液-液萃取的方法对血浆样品进行预处理。但甲醇、乙腈沉淀蛋白方法灵敏度低且基质效应明显，影响仪器的稳定性和灵敏度。采用液-液萃取方法进行预处理时，比较了乙酸乙酯、乙醚、正己烷等提取试剂的效率，结果是乙酸乙酯提取的回收率一致且较高，能满足生物样本检测要求，且血浆取样量少。
文献[3]报道采用HPLC-UV方法测定人参皂苷Rg3的血药浓度，但该方法检测灵敏度低，定量下限仅为545 ng/mL。文献[11]报道采用HPLC-UV方法测定人参皂苷20(R)-Rg3的血药浓度，该方法检测灵敏度较高为2.5 ng/mL，但取样量大，而大鼠取血体积小，不能满足本试验的要求。另据文献[9]报道HPLC-MS/MS方法测定大鼠血浆中的人参皂苷Rg3浓度，最低检测限仅为10 ng/mL。本实验建立的测定大鼠血浆中人参皂苷Rg3的HPLC-MS/MS分析方法，定量下限可达2 ng/mL。经方法学验证，人参皂苷Rg3在一定浓度范围内线性关系良好，专属性、基质效应、精密度与准确度、稳定性等均符合生物样品分析的要求[15], 适用于大鼠体内人参皂苷Rg3的药代动力学研究。
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