急性心肌梗死(acute myocardial infarction，AMI)后90 min以内，经皮冠状动脉介入治疗(percutaneous coronary intervention，PCI)可以让90%闭塞的冠状动脉再开放，显著降低患者病死率[1-2]。然而，其中很大一部分患者由于存在微循环功能障碍，首次PCI后仍表现为心肌血流灌注不足，最终可能导致更大面积的心肌梗死、不良的左心室重构或死亡[2-4]。因此，阻止微循环功能障碍，促进微血管血流恢复，变得尤为重要。促进缺血诱导的、以新生血管出芽、迁移、单核细胞并入为主要特征的血管新生能增加心肌微血管密度，有效恢复微循环血流，改善这部分患者的临床预后[1-2]。
微小RNA(microRNA，miRNA)是一种长度为20~ 25个核苷酸、高度保守的内源性小分子非编码RNA，通过靶向结合特定mRNA 3′端非编码区(3′UTR)，从而抑制蛋白翻译或者促进mRNA降解[5-6]。作为一种新型的调控分子，miRNA广泛参与了细胞增殖、分化等许多病理生理过程，其中包括对内皮功能的调节，如miR-92a、miR-204[5-6]。miR-145是动脉血管中表达含量最高的miRNA，其在血管平滑肌细胞中高表达，在内皮细胞中的表达量为血管平滑肌细胞的10%，血管损伤或者发生动脉粥样硬化、动脉瘤均会导致其表达下降[7-9]。近年研究亦发现，miR-145是内皮细胞和血管平滑肌细胞间串扰的重要信号分子之一，具有促进平滑肌细胞分化、抑制其增殖和抗动脉粥样硬化等作用[10-12]。本研究在构建miR-145过表达和干扰重组腺病毒基础上，再分别体外转染人脐静脉内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells，HUVECs)，观察对细胞增殖和血管形成能力的影响，以期为心肌微循环功能障碍的AMI患者的治疗提供理论依据。
1 材料与方法 1.1 材料 1.1.1 质粒、细菌及细胞pHBAd-EF1-MCS-GFP质粒、pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP质粒、pHBAd- BHG骨架质粒购自Hanbio公司；感受态大肠杆菌菌株DH5α购自Invitrogen公司；HEK293细胞和HUVECs均由重庆医科大学超声医学工程重点实验室保存。
1.1.2 主要实验试剂TRIzol试剂、Lipofectamine 3000转染试剂购自Invitrogen公司；限制性内切酶BamHⅠ、EcoRⅠ、T4连接酶、DNA ladder购自Fermentas公司；质粒DNA抽提试剂盒购自康为世纪公司；凝胶回收试剂盒购自Axygen公司；胎牛血清、胰酶、DMEM高糖培养基购自Gibco公司；反转录和实时荧光定量PCR试剂盒购自Promega公司；MTT细胞增殖及细胞毒性检测试剂盒购自博士德生物公司；BD Matrigel基质胶购自Corning公司；环磷腺苷反应元件结合蛋白(cAMP response element-binding protein, CREB)、血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor，VEGF)、增殖细胞核抗原(proliferating cell nuclear antigen，PCNA)、GAPDH一抗购自Proteintech公司；羊抗兔二抗购自中杉金桥公司；psiCHECK-2载体质粒购自Promega公司。
1.1.3 主要仪器超净工作台购自上海博迅医疗生物仪器股份有限公司；离心机购自上海医用分析仪厂；BS60型恒温水浴箱购自Nikon公司；细胞培养箱购自Thermo Scientific公司；PCR仪购自Bio-Rad公司；倒置光学显微镜CKX-41型购自Olympus公司；低温冰箱MDF-382E购自日本三洋公司；全自动酶标仪购自Gene公司。
1.2 实验方法 1.2.1 miR-145过表达和干扰重组质粒的构建根据NCBI miR-145前体序列(GenBank编号MI0000169)和反向互补序列(3′-AGGGATTCCTGGGAAAACTGGAC-5′)分别设计miR-145过表达和干扰PCR引物，并由上海桑尼生物公司合成。过表达序列上游：5′-ATAGAATTCATCACTGGCCAGAGTCCCCGT-3′，下游：5′-ATAGGATCCTCAGAGTGGAGGGGAGCCGTC-TCA-3′。干扰序列上游：5′-AATTAGGGATTCCTGGGAAAACTGGACTTTTTTG-3′，下游：5′-GATCCAAA-AAAGTCCAGTTTTCCCAGGAATCCCT-3′。过表达和干扰目的片段分别来自于PCR扩增产物、3′和5′的单链退火获得，PCR程序：95 ℃ 5 min；94 ℃ 20 s，55 ℃ 20 s，72 ℃ 20 s，扩增27个循环；72 ℃终末延伸10 min。退火程序：95 ℃ 10 min，75 ℃ 10 min，55 ℃ 10 min，35 ℃ 10 min，15 ℃ 10 min。利用EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切体系分别将miR-145过表达和干扰序列插入pHBAd-EF1-MCS-GFP和pHBAd-U6-Scramble-CMV-GFP载体EF1和U6启动子之后，构建miR-145过表达和干扰重组质粒。再将重组质粒转入大肠杆菌DH5α感受态细胞，37 ℃培养过夜，挑取阳性克隆菌进行基因测序鉴定。
1.2.2 miR-145过表达和干扰重组腺病毒质粒的包装与扩增病毒包装前24 h，将HEK293细胞用DMEM高糖培养基添加10%FBS接种于直径60 mm的培养皿，待细胞生长密度达70%~80%时进行转染。取300 μL Opti-MEM稀释2 μg重组腺病毒质粒或4 μg骨架质粒并混匀。另取15 μL的Lipofectamine 3000，用300 μL的Opti-MEM培养液进行稀释。将两者混合，室温放置20 min加入细胞，37 ℃，5% CO2培养箱中培养。每天观察细胞出毒迹象，约48 h后细胞大部分病变并从底部脱落进行收毒。液氮和37 ℃水浴反复冻融3次，2 500×g离心5 min，收集上清液即为miR-145第1代毒种。按相同步骤扩增第2代毒种。收获病变细胞混悬液后，1 000×g离心5 min，弃上清，加入6 mL ST buffer(培养液+10%血清+2.5%甘油)，涡旋振荡后反复冻融3次，2 500×g离心5 min，取上清作为第3代病毒，即高滴度病毒。
1.2.3 腺病毒滴度的检测和最佳感染复数(multiplicity of infection，MOI)值测定腺病毒滴度检测参照半数组织培养感染量(50% tissue culture infectious dose，TCID50)法[13]。
滴度(titer, T)计算公式：T＝101+d(s-0.5)，其中d=lg(稀释度)，s=阳性比率之和(从第1个10倍稀释度算起)。两次重复实验得到的滴度值应相差≤100.7。
测定最佳MOI值时，将生长状态良好的HEK293细胞接种于24孔板(40 000个/孔)，待生长融合率约90%时，分别按MOI 0、20、40、60、80、100添加腺病毒至各组，转染4 h后更换新鲜培养液，继续培养24 h后，荧光显微镜下拍照，观察腺病毒表达效率，同时观察细胞聚集和贴壁程度，以判断最佳MOI值。
1.2.4 qRT-PCR检测miR-145的表达情况将重组腺病毒和空载体病毒(adenovirus vector，Ad-vector)感染HUVECs，48 h后提取细胞总RNA，茎环法反转录成cDNA，qRT-PCR检测miR-145的表达情况。qRT-PCR反应条件：94 ℃ 20 s；55 ℃ 20 s；72 ℃ 90 s，重复37个循环。
1.2.5 MTT实验采用MTT实验检测miR-145过表达和干扰重组腺病毒感染后HUVECs的增殖情况。将处于对数生长期的HUVECs接种于96孔板(5 000个/孔)，24 h后加入10 μL重组腺病毒/每孔，并设置空白细胞组和转染空载体组，每组5个复孔，分别在24、48、72 h和96 h加入10 μL MTT溶液，孵育4 h，每孔加入100 μL Formanzan溶解液，孵育4 h，在酶联免疫检测仪570 nm测定光密度值[D(570)]。
1.2.6 小管形成实验HUVECs转染各重组腺病毒步骤同前。48 h后常规胰酶消化、计数，按每孔2×104个细胞接种至预先铺好Matrigel基质胶的96孔板。6~8 h后显微镜下随机取5个视野拍照，再运用Image-Pro Plus软件计算小管总长度。
1.2.7 Western blotHUVECs分别感染miR-145过表达和干扰重组腺病毒，96 h后弃掉培养液，用冰预冷的PBS洗2遍，按每个T25培养瓶细胞加入100 μL裂解缓冲液(50 mmol/L hepes、500 mmol/L NaCl、10 g/L NP40、1 mg/L抑蛋白酶肽aprotinin及100 mg/L PMSF)，冰浴5 min、震荡5 min，重复3个循环，刮取细胞，12 000×g离心15 min。收集上清，经BCA蛋白定量后，按4 :1体积比加入5×SDS上样缓冲液，98 ℃煮5 min。样品以10%SDS-PAGE电泳，100 V恒压2 h；常规转膜，5%脱脂奶粉封闭；兔多克隆PCNA、CREB、VEGF(5%脱脂奶粉1 :1 000稀释)抗体4 ℃孵育过夜，TBST洗脱10 min×3遍；鼠二抗(TBST 1 :5 000稀释)室温孵育1 h，TBST洗脱5 min×3遍；ECL化学发光检测。
1.2.8 生物信息学预测采用生物信息学软件miRanda、miRwalk和TargetScan 7.0预测miR-145靶基因及与CREB 3′UTR的结合位点。
1.2.9 双荧光素酶鉴定实验将目的基因CREB 3′UTR野生型(WT)和突变型(Mut)序列片段分别克隆进入psiCHECK-2质粒。96孔板接种HEK293细胞，待细胞生长融合度至70%~90%时，将目的质粒、突变型质粒分别与miR-145、Scrambled RNA混匀，按每孔0.15 μL加入Lipofectamine 3000转染试剂。转染48 h后按照Promega Dual-Luciferase system操作说明书，化学发光仪560 nm和465 nm波长分别检测4组萤火虫荧光素酶和海肾荧光素酶活性。
1.3 统计学处理应用SPSS 21.0和GraphPad Prism 5.0软件进行统计学分析和统计图制作，数据以x±s表示，多组均数间的比较采用单因素方差分析，组内数据比较采用t检验。
2 结果 2.1 miR-145过表达和干扰腺病毒载体的构建miR-145过表达和干扰质粒双酶切产物经1%琼脂糖凝胶电泳，在630 bp处见有一亮带(图 1A)，即为miR-145过表达目的片段；酶切后的miR-145过表达和干扰质粒均位于约7 000 bp处(图 1B)。
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| A：miR-145过表达目的序列PCR扩增产物M：标准；1：过表达目的序列；B：载体经EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切1：过表达质粒；2：干扰质粒；M：标准 图 1 目的序列扩增和载体酶切后的电泳结果 |
2.2 miR-145过表达和干扰病毒载体的测序鉴定
用T4连接酶分别将miR-145过表达和干扰目的片段与EcoRⅠ、BamHⅠ双酶切后的过表达和干扰质粒连接在一起，经大肠杆菌DH5α感受态细胞转化、筛选后进行基因测序。结果显示，miR-145过表达序列(图 2A)和干扰序列(图 2B)均与目标序列一致，说明质粒构建成功。
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| A：miR-145过表达质粒；B：miR-145干扰质粒 图 2 载体构建的基因测序结果 |
2.3 腺病毒包装、扩增及滴度测定
miR-145过表达和干扰质粒分别与骨架质粒pHBAd-BHG共转染HEK293细胞24 h后，发现有细胞出毒现象，即细胞变大、变圆，呈葡萄状样改变，同时有明显噬斑出现。72 h后荧光显微镜下观察到荧光阳性细胞约75%，结果证实miR-145重组腺病毒成功转染和包装。经3轮扩增，7 d后收集到高滴度腺病毒浓缩悬液。按照TCID50法进行病毒滴度测定，miR-145过表达和干扰重组腺病毒滴度分别为1.26×1010、1.58×1010 PFU/mL。
2.4 腺病毒最佳MOI值miR-145过表达腺病毒分别按0、20、40、60、80、100 MOI值感染HEK293细胞48 h，可以观察到绿色荧光蛋白表达随MOI值增大，呈逐渐上升趋势。当MOI值介于60~80之间时，绿色荧光表达较强，且细胞均贴壁生长，状态良好，无细胞聚集和分离现象(图 3)，此为病毒感染的最佳MOI值。按同样的方法测定miR-145干扰腺病毒的最佳MOI值亦介于60~80之间。
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| A~F：分别为MOI值0、20、40、60、80、100 图 3 miR-145过表达腺病毒按不同MOI值感染HEK293细胞48 h GFP表达情况(荧光显微镜×100) |
2.5 实时荧光定量PCR检测miR-145表达情况
重组腺病毒按最佳MOI值感染HUVECs 48 h后，采用qRT-PCR检测miR-145表达情况。感染miR-145过表达腺病毒的HUVECs中，miR-145表达量较对照组明显升高(P＜0.01)，同时干扰miR-145表达能够显著降低HUVECs miR-145表达量(P＜0.05)。
2.6 MTT实验利用MTT试剂盒检测细胞增殖，结果显示：与感染空载体组比较，miR-145过表达显著抑制了HUVECs的增殖，而miR-145干扰则促进HUVECs的增殖(P＜0.05，P＜0.01，图 4)。
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| a：P＜0.05，b: P＜0.01，与感染空载体组比较 图 4 miR-145过表达及干扰腺病毒对HUVECs增殖的影响(n=5，x±s) |
2.7 小管形成实验
根据Image-Pro Plus计算统计结果，与感染空载体组比较，过表达miR-145显著抑制了HUVECs在Matrigel基质胶表面的小管生成能力(P＜0.01)，干扰miR-145表达则明显促进了HUVECs的小管生成(P＜0.05，图 5)。
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| A：miR-145过表达组；B：miR-145干扰组；C：感染空载体组；D：空白细胞组 图 5 miR-145过表达及干扰腺病毒对HUVECs小管形成的影响(LM ×100) |
2.8 生物信息学预测和双荧光素酶鉴定实验
生物信息学预测结果显示，miR-145能与人类基因CREB 3′UTR结合的位点有2个，1个位于第1 186~ 1 191个核苷酸(图 6A)，另一个位于第4 378~4 384个核苷酸(图 6B)。双荧光素酶实验结果亦显示，与对照组相比，miR-145能使CREB(WT)的表达下调41.6%(P＜0.01)，而CREB(Mut)的表达不受miR-145的影响，即miR-145可直接与CREB 3′UTR结合。
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| A：位于3′UTR第1 186~1 191个核苷酸；B：位于3′UTR第4 378~4 384个核苷酸 图 6 生物信息学预测miR-145与人类基因CREB的结合位点 |
2.9 Western blot结果
分别提取感染miR-145过表达和干扰重组腺病毒72 h的HUVECs与正常HUVECs的总蛋白进行Western blot检测，结果显示，与感染空载体组比较，miR-145过表达组CREB和VEGF蛋白受到明显抑制(P＜0.05)，而miR-145干扰组两者表达量显著增加(P＜0.05)；同时，miR-145过表达组PCNA表达量下降明显(P＜0.01)，细胞增殖受到明显抑制，miR-145干扰组PCNA表达量显著增加(P＜0.05，图 7)。
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| 1：miR-145过表达组；2：miR-145干扰组；3：感染空载体组；4：空白细胞组 图 7 Western blot检测HUVECs感染各组腺病毒后CREB、VEGF和PCNA蛋白表达 |
3 讨论
成熟的miRNA可整合到RNA诱导的沉默复合体(RNA-induced silencing complex，RISC)中，将其导向靶mRNA，从而产生翻译的抑制作用[14]。目前已超过1 000种人类miRNA被确定，并调控着人类50%的蛋白质编码基因[15-16]。据估计，人类基因组中1%~4%的基因是miRNA，单个miRNA可以调节多达200个mRNA[15]。其中miR-145已经被证实是血管中最丰富的miRNA[16]。既往研究表明miR-145能显著抑制膀胱癌、卵巢癌和肺癌等肿瘤血管新生[4-7]。但近年来，不少报道还发现miR-145在心血管系统疾病中发挥着重要作用，比如平滑肌细胞中的miR-145在动脉粥样硬化症发生时表达下调，并通过增加炎症细胞因子IL-6、IL-8和MCP-1等来促进动脉粥样斑块形成[17-18]；研究者还证实，miR-145靶向cTnI和CK-MB，直接参与调节心肌梗死面积的大小[19]。
CREB作为一个早在1987年就被发现的转录因子，广泛参与调节细胞生长和分化。既往研究证实，CREB的激活能显著刺激VEGF的表达[20-22]。此外，CREB/VEGF信号通路与大脑发育、前列腺癌的转移等亦关系密切[20-23]。很多miRNA也能直接靶向调节CREB，比如miR-9、miR-23a、miR-200b等[24-26]。因此，CREB/VEGF信号通路是否参与了miR-145在急性心梗后血管新生中的调节作用值得进一步探讨。
本研究利用载体pHBAd-EF1-MCS-GFP和pHBAd- U6-Scramble-CMV-GFP成功完成miR-145过表达及干扰重组腺病毒的包装与扩增，收获高滴度重组腺病毒。一方面，我们利用构建的miR-145过表达及干扰重组腺病毒，证实了miR-145能够显著影响血管内皮细胞的增殖和血管新生能力；另一方面，双荧光素酶实验和Western blot分别在基因和蛋白的分子水平直接和间接证实了miR-145可以靶向抑制CREB/VEGF信号通路。因此，虽然miR-145的作用靶点较多，但通过本研究可以得出结论：miR-145调节血管新生，至少部分是通过靶向抑制CREB/VEGF信号通路实现的。这也为miR-145用于改善急性心肌梗塞症状及预后的临床研究提供了理论依据。
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