膀胱癌是泌尿系统最常见的恶性肿瘤，全球每年约有33万的新发患者，发病率及死亡率均位于恶性肿瘤的前十位，在我国泌尿系肿瘤中发病率及死亡率均为第一位，具有高复发率、高死亡率的特点。近年来，随着诊疗技术的不断进步，膀胱癌患者的总体预后较过去有很大改善，但是，复发和转移仍然是影响膀胱癌患者预后的重要因素。原发肿瘤细胞进入外周血形成循环肿瘤细胞(circulating tumor cells，CTCs)。研究表明，CTCs数量的改变明显早于影像学检查的改变^[1]，这对肿瘤早期的微转移有重要提示意义。也有研究证实前列腺来源的CTCs注入小鼠体内可以形成肿瘤组织，提示CTCs具有一定的成瘤潜能^[2]，但其具体机制不明。目前，CTCs在膀胱癌复发及转移中的作用尚缺乏较全面的研究。此外，多能干细胞转录因子Nanog能够通过调控肿瘤细胞增殖、参与上皮-间质转化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)等多种机制参与肿瘤生长、转移和耐药，在肿瘤干细胞的干性维持、肿瘤的自我更新方面起着至关重要的作用^{[3-4, 6]}，但Nanog是否在膀胱癌CTCs中表达并发挥相似的作用尚不明确。本研究通过观察Nanog在外周血CTCs中的表达情况，探讨Nanog的表达与膀胱癌患者临床指标的相关性，旨在发现CTCs及其中的Nanog基因在膀胱癌复发转移中的作用，以期为膀胱癌的诊治提供新的策略和依据。

1 材料与方法 1.1 患者来源及入组标准

选取2015年12月至2016年8月陆军军医大学第一附属医院全军泌尿外科研究所收治的膀胱尿路上皮癌患者59例，术前膀胱占位活检病理结果明确为膀胱尿路上皮癌。排除标准：①入院前接受过新辅助化疗；②入院前3个月内接受过膀胱灌注化疗；③合并其他原发肿瘤。本研究已通过第三军医大学伦理委员会审查[2014年科研第(3)号]。研究对象均签署知情同意书。

1.2 实验方法及分组

1.2.1 分离和鉴定CTCs

采用广州益善生物技术股份有限公司开发的Canpatrol^TM技术分离和鉴定CTCs^[5]。检测流程包括分离和分型鉴定两个部分。CTC分离采用阴性筛选的方法，裂解外周血中的红细胞后进行过滤分离，过滤后的细胞即为外周血中的CTCs。分型鉴定采用多重mRNA原位分析(multiple mRNA in situ analysis，MRIA)方法，对分离的CTCs进行核酸定位并分型。

1.2.2 患者分组

将患者按照年龄、性别、肿瘤分级、侵袭程度、淋巴结活检以及转移情况进行分组。其中，侵袭程度分为肌层浸润性膀胱癌组(muscle invasive bladder cancer, MIBC)和非肌层浸润性膀胱癌组(non-muscle invasive bladder cancer, NMIBC)。分级分为低度恶性倾向乳头状尿路上皮瘤组(papillary urothelial neoplasms of low malignant potential, PUNLMP)、低级别乳头状尿路上皮癌组(Low-grade papillary carcinomas, LG)、高级别乳头状尿路上皮癌组(High-grade papillary carcinomas, HG)以及无法分级组。

1.3 实验步骤

1.3.1 外周血采集

使用8号采血针和EDTA抗凝采血管采集5 mL外周血，上下颠倒混匀10次。

1.3.2 CTCs富集

将标本转移至样本保存管内，上下颠倒混匀10次。红细胞裂解液裂解样本中的红细胞，离心去除上清后用4%的甲醛固定剩余细胞悬液并转至过滤管，泵阀压力≥0.08 MPa，开始过滤。

1.3.3 多重RNA原位分析检测

蛋白酶处理细胞后用上皮标记探针、间质标记探针进行杂交，依次加入预扩增液、预扩增探针进行孵育。加入红色荧光染料Alexa Fluor 594(上皮标记探针EpCAM、CK8/18/19)，绿色荧光染料Alexa Fluor 488(间质型标记探针vimentin和twist)进行孵育，荧光显微镜进行观察。

1.3.4 Nanog表达检测

用紫色荧光染料Alexa Fluor 647检测Nanog基因的表达。根据荧光信号点计数分为无表达(0)、低表达(1~2)、中表达(3~9)、高表达(≥10)。

1.3.5 结果分析

上皮型CTCs显示为红色荧光信号点，间质型显示为绿色荧光信号点，同时显示红色及绿色信号点为混合型，紫色信号点为Nanog基因(图 1)。

1.4 统计学方法

采用SPSS 24.0统计软件，计数资料比较采用χ²检验。连续数据比较使用非参数检验(Mann-Whitney U检验两组，Kruskal-Wallis检验三组或更多组)。P < 0.05被认为具有统计学意义。

2 结果 2.1 分析CTCs与临床特征的相关性

共纳入59例膀胱尿路上皮癌患者，其中47例患者检出CTCs，阳性率79.7%。共计检出CTCs 302个，CTCs计数范围为0~20/5 mL，中位数为4个。其中，MIBC 36例，NMIBC 23例，MIBC患者CTCs阳性率高于NMIBC患者(91.7% vs 60.9%，P=0.007)；淋巴结活检阳性20例，阴性39例，淋巴结活检阳性膀胱癌患者的CTCs阳性率高于淋巴结活检阴性患者(95.0% vs 71.8%，P=0.044)。表明CTCs阳性率与膀胱肿瘤的恶性程度正相关。CTCs检测阳性率在不同性别、年龄、分级的分组中未见明显差异。膀胱癌远处转移患者只有1例，后续分析暂排除此项。见表 1。

2.2 分析CTCs中Nanog的表达与临床特征的相关性

59例患者中有47例CTCs阳性，共检出上皮型CTCs 56个、混合型CTCs 176个、间质型CTCs 70个。针对CTCs阳性的47例患者进行Nanog基因的检测，Nanog阳性患者共有39例，阳性率为83.0%(39/47)，这与Nanog基因在肿瘤细胞中异常激活的研究结果^[3]一致，进一步提示膀胱癌原发肿瘤细胞成为CTCs后仍然具有Nanog的较高表达，Nanog可能对CTCs的存活及干性潜能起到支持作用。分析Nanog在不同类型CTCs中的情况，上皮型CTCs中阳性率为39.3%，混合型CTCs中为54.5%，间质型CTCs中为41.4%，混合型CTCs中Nanog的阳性率高于上皮型(P=0.047)，而混合型CTCs是同时具有上皮和间质特征的细胞，是EMT过程的中间状态细胞。提示Nanog可能参与了混合型CTCs的形成及其中的EMT过程。具有间质化特征(间质型和混合型)的CTCs数量占CTCs总数的81.5%[(176+70)/302]，表明EMT在CTCs的形成和进展过程中扮演重要角色，可能是促成CTCs侵袭转移潜能的重要因素。对不同年龄、性别、分级、浸润程度的膀胱癌患者外周血CTCs中进行Nanog阳性率比较，结果差异均无统计学意义(P>0.05，表 2)。

2.3 分析Nanog阳性的CTCs与临床特征的相关性

39例患者CTCs中的Nanog表达阳性，Nanog阳性的CTCs总数147个(间质型29个，上皮型22个，混合型96个)。对不同年龄、性别、分级、浸润程度的膀胱癌患者进行Nanog阳性的三类CTCs计数比较，差异均无统计学意义(P>0.05，表 3)。因为间质型CTCs具有更强的侵袭潜能和耐药能力，为了探究Nanog的不同表达水平对间质型CTCs的影响，对不同Nanog表达水平的间质型CTCs进行分析，结果暂未发现有临床意义的指标(表 4)，可能与本次研究样本量偏小有一定关系。

3 讨论

CTCs是原发肿瘤细胞自发或被动脱落进入外周血中的肿瘤细胞，在大多数实体瘤患者的外周血液中均可检测到，很少来自健康个体^[7]。越来越多的研究表明CTCs对肿瘤的早期诊断及预后评估有重要意义。目前常用的检测方法分为富集筛选法和鉴别分析法两大类。富集筛选法包括梯度离心法和膜滤过法等，但梯度离心法灵敏度及特异性稍低、膜滤过法则不适用于体积较少的肿瘤细胞。鉴别分析法包括流式细胞术、RT-PCR及Cell Search^TM系统，但流式细胞术敏感度稍低、RT-PCR有较高的假阳性率。Cell Search^TM系统是FDA唯一认证的外周血CTCs检测方法，它是基于上皮细胞黏附分子(EpCAM)来富集CTCs的，但无法检测已发生EMT的肿瘤细胞^[8-9]。而CanPatrol^TM CTC技术采用滤膜法截留CTCs，不依赖特异性抗体，可以减少CTCs的丢失，白细胞去除率99.9%，降低了假阳性率，肿瘤细胞的回收率＞80%^[10]，使CTCs形态及分子信息保存完整，本研究中59例膀胱尿路上皮癌的患者外周血的CTCs检出率79.7%(47/59)，晚期膀胱癌中阳性率为91.7%，明显高于早期的60.9%，CanPatrol^TM法相较Cell Search^TM系统具有更高的检出率。CTCs分类中的间质型CTCs对肿瘤细胞是否发生EMT有一定提示意义，这对研究膀胱癌的侵袭转移有重要作用^[11]。CanPatrol^TM CTC技术可以做到对CTCs的分型鉴定，较前述方法有明显优势。因此本研究采用了CanPatrol^TM技术进行CTCs的分离和鉴定。

检测外周血CTCs相对无创，且可重复性强，具有节约时间和成本的优点。研究证实，每7.5毫升外周血中CTCs计数大于5个的乳腺癌患者的中位无进展生存期更短，首次随访的乳腺癌患者CTCs数量是无进展生存期和总生存期最显著的预测因子^[12]，在结直肠癌和前列腺癌的研究中也提示CTCs和临床指标的关联，CTCs的数量可用于预后的评估和疗效的监测^[13-14]。针对血液微转移以及膀胱外转移瘤的患者，CTCs的检测能够直接从循环系统中得到证据，为诊断和治疗提供辅助依据^[15-16]。这些都是CTCs在监测疾病进展和疗效方面的优势。本研究中，MIBC患者的外周血CTCs阳性率高于NMIBC患者，并且局部淋巴结有转移的患者CTCs阳性率高于淋巴结阴性的患者，表明更晚期(T和N分期)的膀胱癌患者血液中的CTCs阳性率更高，这与晚期膀胱癌患者容易复发和转移相关，也提示晚期膀胱癌患者的CTCs可能是其产生侵袭转移的重要原因之一。分析三类CTCs可知间质化(混合型和间质型)CTCs的数量占总数的81.5%，提示EMT在CTCs的形成和进展过程中扮演重要角色，CTCs可能参与侵袭转移的发生。研究证实，CTCs在迁移过程中发生EMT，导致侵袭转移的发生^[17]，RINK等^[18]证实CTCs是膀胱癌复发的强有力的预测因素，能够作为监测患者疗效的生物标志物，这都与本研究结果一致，提示间质化的CTCs具有更强的侵袭能力，在膀胱癌的侵袭转移中发挥重要作用。

此外，干性基因Nanog在前列腺癌、肺癌和膀胱癌中的表达，对肿瘤细胞的干性维持和EMT等起关键作用^[19-21]。本研究中Nanog的阳性率为83.0%，这与Nanog基因在肿瘤细胞中异常激活的研究结果相一致^[3]，进一步提示膀胱癌原发肿瘤细胞成为CTCs后仍然具有Nanog的较高表达，Nanog可能对CTCs的存活及干性潜能起到支持作用。并且，混合型CTCs中的Nanog阳性率高于上皮型CTCs中的Nanog阳性率，提示Nanog可能参与混合型CTCs的形成及其中的EMT过程，这与Nanog导致发生EMT的研究结果相一致，从CTCs的层面，证实Nanog的表达状态可能是潜在的判断膀胱癌预后的新型指标，检测CTCs中Nanog的表达水平有望成为一种具有临床应用价值的新策略。

本研究还存在一定的局限性：一是样本量不够多，二是CTCs的动态变化的结果尚不全面，三是患者的疗效正在随访中。在今后的研究中，增加样本量，完善随访以及对比多次CTCs的变化情况将有助于进一步验证本研究结果。