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慢传输性便秘患者结肠黏膜DNA甲基转移酶表达显著增高
肖磊, 田跃, 柯志刚, 张勇, 童卫东     
400042 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第三附属医院野战外科研究所普通外科
[摘要] 目的 研究DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase, Dnmt)在慢传输性便秘(slow transit constipation, STC)结肠黏膜中的表达。方法 收集2015年9月至2017年6月我科收治的8例STC患者乙状结肠标本,采用免疫组织化学染色、Western blot检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白在结肠黏膜的表达情况,real-time qRT-PCR检测结肠黏膜Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量。对照组标本采用直肠癌患者术中切除的远离癌灶的近端乙状结肠。结果 免疫组织化学染色结果显示:对照组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b IOD值分别为(705±362)、(538±206)、(359±238),STC组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b IOD值分别为(4 077±1 219)、(4 214±1 858)、(3 026±1 619),两组比较差异有统计学意义(P < 0.05);Western blot检测结果显示:对照组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白相对表达量分别为(0.663± 0.349)、(0.250±0.159)、(0.330±0.195),STC组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白相对表达量分别为(1.475±0.372)、(1.035±0.362)、(0.977±0.258),两组比较差异有统计学意义(P < 0.05);Real-time qRT-PCR结果显示:对照组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量分别为(0.285±0.121)、(0.069± 0.021)、(0.512±0.112),STC组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量分别为(0.563±0.172)、(0.340±0.083)、(0.964±0.219),两组比较差异有统计学意义(P < 0.05)。结论 STC患者结肠黏膜Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b表达显著增高,可能是STC发病的重要环节。
[关键词] 慢传输性便秘     结肠黏膜     DNA甲基转移酶    
Expression of DNA methyltransferase is significantly increased in the colonic mucosa of patients with slow transit constipation
XIAO Lei , TIAN Yue , KE Zhigang , ZHANG Yong , TONG Weidong     
Department of General Surgery, Center of Constipation Diagnosis and Treatment, Institute of Surgery Research, Third Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400042, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (81270461, 81570483, 81770541)
Corresponding author: TONG Weidong, E-mail:vdtong@163.com
[Abstract] Objective To investigate the expression of DNA methyltransferase (Dnmt) in the colonic mucosa of patients with slow transit constipation (STC). Methods Surgical specimens of the sigmoid colon were collected from 8 patients with STC and 8 patients with rectal cancer admitted in our hospital between September, 2015 and June, 2017. Only the adjacent colon tissues (at least 10 cm from the tumor margin) from the rectal cancer patients were used to serve as the control. The expressions of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b proteins in the colonic mucosa were detected using immunochemistry and Western blotting, and their mRNA expressions were quantified with real-time qRT-PCR. Results The results of immunochemical staining showed that the integral optical densities (IOD) of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b expressions in the control group were 705±362, 538±206, and 359±238, respectively, significantly lower than those in STC group (4 077±1 219, 4 214±1 858, and 3 026±1 619, respectively; P < 0.05). Western blotting also showed significantly lower relative expressions of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b proteins in the control group than in STC group (0.663±0.349, 0.250±0.159, and 0.330±0.195 vs 1.475±0.372, 1.035±0.362, and 0.977±0.258, respectively; P < 0.05). Real-time qRT-PCR yielded consistent results of the relative expressions of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b mRNAs in the control and STC groups (0.285±0.121, 0.069±0.021, and 0.512±0.112 vs 0.563±0.172, 0.340±0.083, and 0.964±0.219, respectively; P < 0.05). Conclusion High expressions of Dnmt1, Dnmt3a and Dnmt3b in the colonic mucosa may be an important factor in the pathogenesis of STC.
[Key words] slow transit constipation     colonic mucosa     DNA methyltransferase    

慢传输性便秘(slow transit constipation, STC)发病机制不清。患者临床上突出表现为无便意,提示肠感觉功能障碍可能是发病的一个重要原因。研究表明:瞬时受体电位通道A1(transient receptor potential channel, subfamily A, member1, TRPA1)在肠黏膜感觉信号传入中具有重要作用[1-4]。本课题组前期研究发现,STC患者结肠黏膜层TRPA1表达显著降低,但具体机制不清[5]。有研究报道TRPA1基因启动子区存在甲基化位点,基因甲基化可影响TRPA1的表达以及肠道痛觉敏感性[6],而DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)是催化DNA甲基化过程的关键酶[7]。其中,Dnmt1参与DNA甲基化状态的维持,Dnmt3a、Dnmt3b参与DNA的从头甲基化过程。迄今,国内外关于Dnmt在STC发病中的研究尚未见报道。本研究分析STC患者结肠黏膜Dnmt1, Dnmt3a和Dnmt3b的表达,以期为深入探讨STC的发病机制提供理论基础。

1 资料与方法 1.1 标本来源

STC组和对照组标本来源于2015年9月至2017年6月我科收治、行肠道切除手术的患者。STC患者8例,其中男性2例,女性6例;年龄25~63(46±13)岁;病程4~18(10±5)年。取手术切除的乙状结肠组织。参照文献[8-9],对照组标本8例来自直肠癌患者,其中男性3例,女性5例,年龄为56~75(65±9)岁。取远离病变(至少10 cm)的近端乙状结肠组织。研究通过医院伦理委员会审批(2015年)。患者及家属签署知情同意书。

1.2 纳入标准和排除标准

纳入标准:(1)STC组纳入标准,根据中国医师协会肛肠分会制定的便秘外科诊治指南(2017)[10]和功能性胃肠病(functional gastrointestinal disorder, FGID)罗马Ⅳ标准,诊断为STC的患者。(2)对照组纳入标准,不伴有FGID疾病史的直肠癌患者。排除标准:①STC组排除标准,符合上述STC诊断标准,但考虑为结肠器质性病变而非功能性病变的患者。②对照组排除标准,手术切除肠道的范围不包含乙状结肠的直肠癌患者。

1.3 主要试剂和仪器

Anti-Dnmt1 antibody(ab13537)、Anti-Dnmt3a antibody(ab2850)、Anti-dnmt3b antibody(ab13604,英国Abcam公司),RNA逆转录试剂盒、SYBR GREEN DYE(TOYOBO,日本),real-time qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,Western blot成像系统购自Tanon公司,免疫组化成像系统购自OLYMPUS公司,real-time qRT-PCR使用BIO-RAD CFX96反应体系进行。

1.4 免疫组织化学染色检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b表达

术中取结肠标本用福尔马林液浸泡72 h。常规石蜡包埋,厚度5 μm切片。切片按照如下顺序处理:二甲苯浸泡10 min×2次,无水乙醇浸泡6 min,95%乙醇浸泡3 min,80%乙醇浸泡3 min,自来水冲洗3 min,96 ℃枸橼酸钠溶液抗原修复15 min,自然冷却至室温,自来水冲洗3 min,3%双氧水浸泡15 min,自来水冲洗3 min,血清封闭15 min,滴加一抗(抗体同前),4 ℃放置约20 h,室温放置10 min;自来水冲洗3 min,滴加二抗,37 ℃放置30 min,自来水冲洗3min,滴加显色液,反向梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。选取10×物镜,每张切片随机拍摄5个视野,计数取平均值。利用图像分析软件Image Pro Plus 6.0对结肠黏膜Dnmt1, Dnmt3a和Dnmt3b阳性表达情况进行半定量分析。使用Image Pro Plus 6.0对图像进行分析,测量累积光密度值(integral optical density, IOD),对IOD值进行分析。

1.5 Western blot检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表达

术中所取结肠组织分离出黏膜层,保存于液氮中。实验时称取100 mg,加液氮研磨至粉末状,加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(1 :10)1 mL,4 ℃裂解2 h,每10分钟震荡摇匀1次。裂解完成后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,取上清液。使用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白溶液0.5 μL,加ddH2O 9.5 μL,BCA试剂盒A液98μL,B液2 μL,混匀,37 ℃放置30 min。使用分光光度计测定蛋白浓度。下层8%分离胶配制方法(以配制5 mL为例):H2O 2.3 mL,ACR 1.3 mL,1.5 mol/L Tris 1.3 mL,10%SDS 0.05 mL,10%过硫酸铵(AP)0.05 mL,TEMED 0.003 mL。上层5%浓缩胶配制方法(以配制2 mL为例):H2O 1.4 mL,ACR 0.33 mL,1.0 mol/L Tris 0.25 mL,10%SDS 0.02 mL,10%过硫酸铵(AP)0.02 mL,TEMED 0.002 mL。上样:按80 μg蛋白量计算各标本取样体积,加ddH2O配至10 μL,再加入5×loading buffer 2.5 μL配制成12.5 μL样本反应体系。将样本置于沸水中3 min。随后将样品加入凝胶槽中。电泳:恒压80V至Marker条带分离,而后转120 V至条带跑至凝胶底部。凝胶电泳分离后,转移至PVDF膜上,恒压13V湿转850 min。孵抗体:PVDF膜置于1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次;含5%脱脂奶粉的TBST摇床封闭2 h;1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次;含5%脱脂奶粉的TBST稀释一抗摇床2 h(Dnmt1 1 :500,Dnmt3a 1 :500,Dnmt3b 1 :500,β-actin 1 :1 000);1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次;二抗室温摇床2 h;1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次。滴加适量显影液,显影系统获取图像。使用Image Pro Plus 6.0对条带进行灰度值分析,蛋白表达量为目的条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值。

1.6 实时定量逆转录PCR(real-time qRT-PCR)检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量

RNA提取:术中所取结肠组织分离出黏膜层,保存于液氮中。实验时称取100 mg,加液氮研磨至粉末状。加入1mL TRNzol,充分混匀,4 ℃放置24 h。加入200 μL三氯甲烷,混匀,4 ℃、12 000 r/min离心10 min。另取干净的1.5 mL离心管,加入500 μL异丙醇,吸取离心所得上清液500 μL加入,混匀。4 ℃、12 000 r/min离心10 min。弃上清,底部白色沉淀即为RNA。无水乙醇与DEPC水配制成75%乙醇溶液,冲洗RNA沉淀。4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清,视RNA量加入DEPC水,摇匀。测定RNA浓度。

RNA逆转录为cDNA,逆转录反应体系:5×RT buffer 4 μL,dNTP mixture(10mmol/L)2 μL,oligodT(20)(10 pmol/μL)1 μL,RT Ace(100 U/μL)0.5 μL,RNA酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL,RNA样本2 μg,DEPC水配至20 μL。逆转录反应条件:42 ℃ 10 min→30 ℃ 20 min→99 ℃ 5 min→4 ℃ 5 min。

Quantitative PCR反应,反应体系:cDNA(稀释4倍)2 μL,正向、反向引物(10 mmol/L)各0.3 μL(引物序列见表 1),SYBR GREEN DYE 10 μL,水7.4 μL,共20 μL。反应条件:96 ℃ 6 min①→96 ℃ 30 s②→57 ℃ 30 s③→72 ℃ 30 s④→72 ℃ 10 min⑤→4 ℃保存⑥,其中②至④步进行35次循环。

表 1 real-time qRT-PCR引物序列
引物名称 引物序列 产物大小
β-actin 正向引物:5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′
反向引物:5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′
249 bp
Dnmt1 正向引物:5′-CCCGAGTGCGTCCAGGTGTAC-3′
反向引物:5′-AGGGCTACGGGCATGGTTG-3′
114 bp
Dnmt3a 正向引物:5′-GGCACTCAAGGGCAGCAGATAC-3′
反向引物:5′-CTCTCCCCACGCCACTGTCAC-3′
114 bp
Dnmt3b 正向引物:5′-CCCAAGCTGTACCCTGCCATTC-3′
反向引物:5′-AACAGCAATGGACTCCTCACACAC-3′
159 bp

结果分析:使用Bio-Rad CFX Manager3.1进行结果分析,得到各个样本及其相对应的内参的Ct值,用样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct。用本次实验中待研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct,并同时对所有结果取相反数,得到的结果就是-△△Ct。对-△△Ct进行2的幂运算,得出各样本目的基因mRNA的相对表达倍数。

1.7 统计学分析

使用SPSS19.0统计软件进行分析,计量资料数据以x±s表示,数据经正态性检验和方差齐性检验,免疫组织化学染色数据、Western blot数据、real-time qRT-PCR数据均服从正态分布、方差齐性,组间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 免疫组织化学染色检测

对照组Dnmt1 IOD值为705±362,STC组Dnmt1 IOD值为4077±1219。两组比较,差异有统计学意义(t=7.496,P < 0.01);对照组Dnmt3a IOD值为538±206,STC组Dnmt3a IOD值为4214±1858。两组比较,差异有统计学意义(t=5.559,P < 0.01);对照组Dnmt3b IOD值为359±238,STC组Dnmt3b IOD值为3 026±1 619。两组比较,差异有统计学意义(t=4.608,P < 0.01)。见图 1

A、C、E分别为对照组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b;B、D、F分别为STC组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b 图 1 免疫组织化学染色检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b在结肠黏膜的表达

2.2 Western blot检测

对照组Dnmt1蛋白相对表达量为0.663±0.349,STC组Dnmt1蛋白相对表达量为1.475±0.372。两组比较,差异有统计学意义(t=4.503,P < 0.01);对照组Dnmt3a蛋白相对表达量为0.250±0.159,STC组Dnmt3a蛋白相对表达量为1.035±0.362。两组比较,差异有统计学意义(t=5.607,P < 0.01);对照组Dnmt3b蛋白相对表达量为0.330±0.195,STC组Dnmt3b蛋白相对表达量为0.977±0.258。两组比较,差异有统计学意义(t=5.657,P < 0.01)。见图 2

图 2 Western blot检测2组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量

2.3 real-time qRT-PCR检测

对照组Dnmt1 mRNA相对表达量为0.285±0.121,STC组Dnmt1 mRNA相对表达量为0.563±0.172。两组比较,差异有统计学意义(t=3.564,P=0.003);对照组Dnmt3a mRNA相对表达量为0.069±0.021,STC组Dnmt3a mRNA相对表达量为0.340±0.083。两组比较,差异有统计学意义(t=7.064,P=0.000);对照组Dnmt3b mRNA相对表达量为0.512±0.112,STC组Dnmt3b mRNA相对表达量为0.964±0.219。两组比较,差异有统计学意义(t=2.399,P=0.044)。见图 3

1: Dnmt1; 2: Dnmt3a; 3: Dnmt3b,a:P < 0.01,b:P < 0.05,与对照组比较 图 3 real-time qRT-PCR检测2组Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量

3 讨论

慢性便秘发病率一般认为在15%左右,老年人高达30%[11-12]。STC是慢性便秘常见的一种类型,症状顽固,保守治疗通常效果不佳,且许多病例存在滥用泻剂导致症状逐步加重的情况。最终不得不进行手术治疗,进行部分结肠切除甚至全结肠切除[13-16]。STC严重影响患者身心健康和生活质量,给患者及其家属造成多方面的巨大压力,且发病机制不清。因此,探究其发病机制意义重大。

已有研究发现STC结肠神经递质[17]、Cajal间质细胞[18]等诸多异常,但仍不能解释其发病机制。近年来,肠黏膜感觉信号传入在肠动力调控中的重要作用引起了关注[19]。STC患者临床上突出表现为无便意、排便频率显著降低甚至不能自主排便,因而也被称为“结肠无力”或“结肠瘫痪症”。STC的这种临床特点提示我们:肠黏膜感觉障碍可能在其发病机制研究中有重要价值。TRPA1在肠黏膜感觉信号传入中扮演重要角色。TRPA1高表达于肠嗜铬细胞(enteroch-romaffincell, EC cell),是EC细胞的感受器分子,可被肠腔内各种物理与化学信号激活,活化后介导EC细胞释放5-HT发挥调控功能[1-3, 20]。多项研究结果提示:TRPA1在肠道动力调控中起关键作用[3-4, 21];本课题组前期的研究发现STC患者结肠黏膜层TRPA1表达显著降低[5]。因此,进一步探讨TRPA1表达降低的机制有重要意义。

新近研究报道TRPA1基因启动子区甲基化状态影响TRPA1的表达以及肠道痛觉敏感性[6]。这提示基因启动子区异常甲基化状态可能是STC结肠黏膜TRPA1表达降低的潜在原因。DNA甲基化是指在DNA胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团的过程,是真核生物中常见的一种碱基共价修饰过程。DNA甲基转移酶(Dnmt)是催化DNA甲基化过程的关键酶。Dnmt根据功能和结构的差异可分为Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L、Dnmt2。哺乳动物体内,Dnmt1参与DNA甲基化状态的维持,Dnmt3a、Dnmt3b参与DNA的从头甲基化过程。Dnmt3L的作用可能与Dnmt3a、Dnmt3b相同或类似,而Dnmt2可能涉及RNA的甲基化过程[7, 22]。Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b与DNA甲基化过程密切相关,目前针对Dnmt的研究也主要集中于这3个酶,因此本研究选取这3项指标作为研究内容。

有研究提示Dnmt表达与基因甲基化程度存在正相关性[23],而特定DNA片段的甲基化状态与基因的表达调控密切相关[24-25]。本研究发现Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b在STC结肠黏膜的表达均显著增高,这提示DNA高甲基化状态可能与TRPA1表达降低有关,进而与STC的发病有关。DNA甲基化是表观遗传调控的重要机制之一。表观遗传是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传表型的遗传现象。目前对于STC发病机制的研究并无证据表明STC属于经典遗传性疾病,关于Dnmt、DNA甲基化乃至表观遗传调控在STC发病中的研究迄今未见报道。因此,结合本研究结果和课题组前期研究成果,我们认为:从表观遗传角度进一步探讨STC的发病机制,可以作为今后疾病研究的一个新的方向,具有一定的研究价值。

相较肿瘤性疾病而言,对于Dnmt在非肿瘤性疾病中的研究鲜有报道,其中主要是探讨Dnmt在炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)中的作用。STC结肠存在低度慢性炎症,这与IBD结肠的情况相似。多项研究结果均显示:炎症情况下结肠黏膜Dnmt表达水平明显异常,例如:IBD患者结肠黏膜Dnmt水平显著异常[22];UC患者不典型增生细胞的Dnmt1表达显著增高[26];相较结肠无炎症情况存在的人群,UC患者结肠黏膜Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b表达水平均显著升高[23]。本研究结果与上述研究报道一致。值得一提的是,Dnmt3a、Dnmt3b主要存在于胚胎发育的早期阶段,在卵细胞内表达水平较高,在成体组织中表达很低[27]。本研究结果与上述理论相符,各项实验检测结果显示Dnmt3a、Dnmt3b表达水平在STC组与对照组结肠黏膜均较低,相较对照组,STC组Dnmt3a、Dnmt3b表达水平则显著增高。这些结果均提示:炎症可能是导致Dnmt表达异常增高的原因。基于上述,我们推测:STC结肠存在慢性炎症→Dnmt表达增高→TRPA1基因异常甲基化状态→TRPA1表达降低,并且在今后的研究中将沿着这一思路深入探讨STC的发病机制。综上,Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b在STC结肠黏膜表达异常增高,这可能是STC发病的重要环节之一。本研究为从一个新的角度,即DNA甲基化方向进一步探讨STC的发病机制提供了较好的理论依据。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711221
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

肖磊, 田跃, 柯志刚, 张勇, 童卫东.
XIAO Lei, TIAN Yue, KE Zhigang, ZHANG Yong, TONG Weidong.
慢传输性便秘患者结肠黏膜DNA甲基转移酶表达显著增高
Expression of DNA methyltransferase is significantly increased in the colonic mucosa of patients with slow transit constipation
第三军医大学学报, 2018, 40(8): 705-710
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(8): 705-710
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711221

文章历史

收稿: 2017-11-27
修回: 2017-12-19

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