慢传输性便秘(slow transit constipation, STC)发病机制不清。患者临床上突出表现为无便意,提示肠感觉功能障碍可能是发病的一个重要原因。研究表明:瞬时受体电位通道A1(transient receptor potential channel, subfamily A, member1, TRPA1)在肠黏膜感觉信号传入中具有重要作用[1-4]。本课题组前期研究发现,STC患者结肠黏膜层TRPA1表达显著降低,但具体机制不清[5]。有研究报道TRPA1基因启动子区存在甲基化位点,基因甲基化可影响TRPA1的表达以及肠道痛觉敏感性[6],而DNA甲基转移酶(DNA methyltransferase,Dnmt)是催化DNA甲基化过程的关键酶[7]。其中,Dnmt1参与DNA甲基化状态的维持,Dnmt3a、Dnmt3b参与DNA的从头甲基化过程。迄今,国内外关于Dnmt在STC发病中的研究尚未见报道。本研究分析STC患者结肠黏膜Dnmt1, Dnmt3a和Dnmt3b的表达,以期为深入探讨STC的发病机制提供理论基础。
1 资料与方法 1.1 标本来源STC组和对照组标本来源于2015年9月至2017年6月我科收治、行肠道切除手术的患者。STC患者8例,其中男性2例,女性6例;年龄25~63(46±13)岁;病程4~18(10±5)年。取手术切除的乙状结肠组织。参照文献[8-9],对照组标本8例来自直肠癌患者,其中男性3例,女性5例,年龄为56~75(65±9)岁。取远离病变(至少10 cm)的近端乙状结肠组织。研究通过医院伦理委员会审批(2015年)。患者及家属签署知情同意书。
1.2 纳入标准和排除标准纳入标准:(1)STC组纳入标准,根据中国医师协会肛肠分会制定的便秘外科诊治指南(2017)[10]和功能性胃肠病(functional gastrointestinal disorder, FGID)罗马Ⅳ标准,诊断为STC的患者。(2)对照组纳入标准,不伴有FGID疾病史的直肠癌患者。排除标准:①STC组排除标准,符合上述STC诊断标准,但考虑为结肠器质性病变而非功能性病变的患者。②对照组排除标准,手术切除肠道的范围不包含乙状结肠的直肠癌患者。
1.3 主要试剂和仪器Anti-Dnmt1 antibody(ab13537)、Anti-Dnmt3a antibody(ab2850)、Anti-dnmt3b antibody(ab13604,英国Abcam公司),RNA逆转录试剂盒、SYBR GREEN DYE(TOYOBO,日本),real-time qRT-PCR引物由生工生物工程(上海)股份有限公司合成,Western blot成像系统购自Tanon公司,免疫组化成像系统购自OLYMPUS公司,real-time qRT-PCR使用BIO-RAD CFX96反应体系进行。
1.4 免疫组织化学染色检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b表达术中取结肠标本用福尔马林液浸泡72 h。常规石蜡包埋,厚度5 μm切片。切片按照如下顺序处理:二甲苯浸泡10 min×2次,无水乙醇浸泡6 min,95%乙醇浸泡3 min,80%乙醇浸泡3 min,自来水冲洗3 min,96 ℃枸橼酸钠溶液抗原修复15 min,自然冷却至室温,自来水冲洗3 min,3%双氧水浸泡15 min,自来水冲洗3 min,血清封闭15 min,滴加一抗(抗体同前),4 ℃放置约20 h,室温放置10 min;自来水冲洗3 min,滴加二抗,37 ℃放置30 min,自来水冲洗3min,滴加显色液,反向梯度酒精脱水,二甲苯透明,中性树脂封片。选取10×物镜,每张切片随机拍摄5个视野,计数取平均值。利用图像分析软件Image Pro Plus 6.0对结肠黏膜Dnmt1, Dnmt3a和Dnmt3b阳性表达情况进行半定量分析。使用Image Pro Plus 6.0对图像进行分析,测量累积光密度值(integral optical density, IOD),对IOD值进行分析。
1.5 Western blot检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b蛋白表达术中所取结肠组织分离出黏膜层,保存于液氮中。实验时称取100 mg,加液氮研磨至粉末状,加入含有蛋白酶抑制剂的RIPA裂解液(1 :10)1 mL,4 ℃裂解2 h,每10分钟震荡摇匀1次。裂解完成后,4 ℃、12 000 r/min离心15 min,取上清液。使用BCA法测定蛋白浓度。取蛋白溶液0.5 μL,加ddH2O 9.5 μL,BCA试剂盒A液98μL,B液2 μL,混匀,37 ℃放置30 min。使用分光光度计测定蛋白浓度。下层8%分离胶配制方法(以配制5 mL为例):H2O 2.3 mL,ACR 1.3 mL,1.5 mol/L Tris 1.3 mL,10%SDS 0.05 mL,10%过硫酸铵(AP)0.05 mL,TEMED 0.003 mL。上层5%浓缩胶配制方法(以配制2 mL为例):H2O 1.4 mL,ACR 0.33 mL,1.0 mol/L Tris 0.25 mL,10%SDS 0.02 mL,10%过硫酸铵(AP)0.02 mL,TEMED 0.002 mL。上样:按80 μg蛋白量计算各标本取样体积,加ddH2O配至10 μL,再加入5×loading buffer 2.5 μL配制成12.5 μL样本反应体系。将样本置于沸水中3 min。随后将样品加入凝胶槽中。电泳:恒压80V至Marker条带分离,而后转120 V至条带跑至凝胶底部。凝胶电泳分离后,转移至PVDF膜上,恒压13V湿转850 min。孵抗体:PVDF膜置于1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次;含5%脱脂奶粉的TBST摇床封闭2 h;1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次;含5%脱脂奶粉的TBST稀释一抗摇床2 h(Dnmt1 1 :500,Dnmt3a 1 :500,Dnmt3b 1 :500,β-actin 1 :1 000);1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次;二抗室温摇床2 h;1×TBST中摇床清洗3次,10 min/次。滴加适量显影液,显影系统获取图像。使用Image Pro Plus 6.0对条带进行灰度值分析,蛋白表达量为目的条带灰度值与β-actin条带灰度值的比值。
1.6 实时定量逆转录PCR(real-time qRT-PCR)检测Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b mRNA相对表达量RNA提取:术中所取结肠组织分离出黏膜层,保存于液氮中。实验时称取100 mg,加液氮研磨至粉末状。加入1mL TRNzol,充分混匀,4 ℃放置24 h。加入200 μL三氯甲烷,混匀,4 ℃、12 000 r/min离心10 min。另取干净的1.5 mL离心管,加入500 μL异丙醇,吸取离心所得上清液500 μL加入,混匀。4 ℃、12 000 r/min离心10 min。弃上清,底部白色沉淀即为RNA。无水乙醇与DEPC水配制成75%乙醇溶液,冲洗RNA沉淀。4℃、12 000 r/min离心5 min。弃上清,视RNA量加入DEPC水,摇匀。测定RNA浓度。
RNA逆转录为cDNA,逆转录反应体系:5×RT buffer 4 μL,dNTP mixture(10mmol/L)2 μL,oligodT(20)(10 pmol/μL)1 μL,RT Ace(100 U/μL)0.5 μL,RNA酶抑制剂(40 U/μL)0.5 μL,RNA样本2 μg,DEPC水配至20 μL。逆转录反应条件:42 ℃ 10 min→30 ℃ 20 min→99 ℃ 5 min→4 ℃ 5 min。
Quantitative PCR反应,反应体系:cDNA(稀释4倍)2 μL,正向、反向引物(10 mmol/L)各0.3 μL(引物序列见表 1),SYBR GREEN DYE 10 μL,水7.4 μL,共20 μL。反应条件:96 ℃ 6 min①→96 ℃ 30 s②→57 ℃ 30 s③→72 ℃ 30 s④→72 ℃ 10 min⑤→4 ℃保存⑥,其中②至④步进行35次循环。
引物名称 | 引物序列 | 产物大小 |
β-actin | 正向引物:5′-ACCCCGTGCTGCTGACCGAG-3′ 反向引物:5′-TCCCGGCCAGCCAGGTCCA-3′ |
249 bp |
Dnmt1 | 正向引物:5′-CCCGAGTGCGTCCAGGTGTAC-3′ 反向引物:5′-AGGGCTACGGGCATGGTTG-3′ |
114 bp |
Dnmt3a | 正向引物:5′-GGCACTCAAGGGCAGCAGATAC-3′ 反向引物:5′-CTCTCCCCACGCCACTGTCAC-3′ |
114 bp |
Dnmt3b | 正向引物:5′-CCCAAGCTGTACCCTGCCATTC-3′ 反向引物:5′-AACAGCAATGGACTCCTCACACAC-3′ |
159 bp |
结果分析:使用Bio-Rad CFX Manager3.1进行结果分析,得到各个样本及其相对应的内参的Ct值,用样本自身的目的基因Ct值减去自身内参基因Ct值,得到的数就是△Ct。用本次实验中待研究样本的△Ct减去对照组样本的△Ct,并同时对所有结果取相反数,得到的结果就是-△△Ct。对-△△Ct进行2的幂运算,得出各样本目的基因mRNA的相对表达倍数。
1.7 统计学分析使用SPSS19.0统计软件进行分析,计量资料数据以x±s表示,数据经正态性检验和方差齐性检验,免疫组织化学染色数据、Western blot数据、real-time qRT-PCR数据均服从正态分布、方差齐性,组间比较采用t检验,P < 0.05为差异有统计学意义。
2 结果 2.1 免疫组织化学染色检测对照组Dnmt1 IOD值为705±362,STC组Dnmt1 IOD值为4077±1219。两组比较,差异有统计学意义(t=7.496,P < 0.01);对照组Dnmt3a IOD值为538±206,STC组Dnmt3a IOD值为4214±1858。两组比较,差异有统计学意义(t=5.559,P < 0.01);对照组Dnmt3b IOD值为359±238,STC组Dnmt3b IOD值为3 026±1 619。两组比较,差异有统计学意义(t=4.608,P < 0.01)。见图 1。
2.2 Western blot检测
对照组Dnmt1蛋白相对表达量为0.663±0.349,STC组Dnmt1蛋白相对表达量为1.475±0.372。两组比较,差异有统计学意义(t=4.503,P < 0.01);对照组Dnmt3a蛋白相对表达量为0.250±0.159,STC组Dnmt3a蛋白相对表达量为1.035±0.362。两组比较,差异有统计学意义(t=5.607,P < 0.01);对照组Dnmt3b蛋白相对表达量为0.330±0.195,STC组Dnmt3b蛋白相对表达量为0.977±0.258。两组比较,差异有统计学意义(t=5.657,P < 0.01)。见图 2。
2.3 real-time qRT-PCR检测
对照组Dnmt1 mRNA相对表达量为0.285±0.121,STC组Dnmt1 mRNA相对表达量为0.563±0.172。两组比较,差异有统计学意义(t=3.564,P=0.003);对照组Dnmt3a mRNA相对表达量为0.069±0.021,STC组Dnmt3a mRNA相对表达量为0.340±0.083。两组比较,差异有统计学意义(t=7.064,P=0.000);对照组Dnmt3b mRNA相对表达量为0.512±0.112,STC组Dnmt3b mRNA相对表达量为0.964±0.219。两组比较,差异有统计学意义(t=2.399,P=0.044)。见图 3。
3 讨论
慢性便秘发病率一般认为在15%左右,老年人高达30%[11-12]。STC是慢性便秘常见的一种类型,症状顽固,保守治疗通常效果不佳,且许多病例存在滥用泻剂导致症状逐步加重的情况。最终不得不进行手术治疗,进行部分结肠切除甚至全结肠切除[13-16]。STC严重影响患者身心健康和生活质量,给患者及其家属造成多方面的巨大压力,且发病机制不清。因此,探究其发病机制意义重大。
已有研究发现STC结肠神经递质[17]、Cajal间质细胞[18]等诸多异常,但仍不能解释其发病机制。近年来,肠黏膜感觉信号传入在肠动力调控中的重要作用引起了关注[19]。STC患者临床上突出表现为无便意、排便频率显著降低甚至不能自主排便,因而也被称为“结肠无力”或“结肠瘫痪症”。STC的这种临床特点提示我们:肠黏膜感觉障碍可能在其发病机制研究中有重要价值。TRPA1在肠黏膜感觉信号传入中扮演重要角色。TRPA1高表达于肠嗜铬细胞(enteroch-romaffincell, EC cell),是EC细胞的感受器分子,可被肠腔内各种物理与化学信号激活,活化后介导EC细胞释放5-HT发挥调控功能[1-3, 20]。多项研究结果提示:TRPA1在肠道动力调控中起关键作用[3-4, 21];本课题组前期的研究发现STC患者结肠黏膜层TRPA1表达显著降低[5]。因此,进一步探讨TRPA1表达降低的机制有重要意义。
新近研究报道TRPA1基因启动子区甲基化状态影响TRPA1的表达以及肠道痛觉敏感性[6]。这提示基因启动子区异常甲基化状态可能是STC结肠黏膜TRPA1表达降低的潜在原因。DNA甲基化是指在DNA胞嘧啶的5位碳原子加上一个甲基基团的过程,是真核生物中常见的一种碱基共价修饰过程。DNA甲基转移酶(Dnmt)是催化DNA甲基化过程的关键酶。Dnmt根据功能和结构的差异可分为Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b、Dnmt3L、Dnmt2。哺乳动物体内,Dnmt1参与DNA甲基化状态的维持,Dnmt3a、Dnmt3b参与DNA的从头甲基化过程。Dnmt3L的作用可能与Dnmt3a、Dnmt3b相同或类似,而Dnmt2可能涉及RNA的甲基化过程[7, 22]。Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b与DNA甲基化过程密切相关,目前针对Dnmt的研究也主要集中于这3个酶,因此本研究选取这3项指标作为研究内容。
有研究提示Dnmt表达与基因甲基化程度存在正相关性[23],而特定DNA片段的甲基化状态与基因的表达调控密切相关[24-25]。本研究发现Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b在STC结肠黏膜的表达均显著增高,这提示DNA高甲基化状态可能与TRPA1表达降低有关,进而与STC的发病有关。DNA甲基化是表观遗传调控的重要机制之一。表观遗传是指在基因的DNA序列不发生改变的情况下,基因的表达水平与功能发生改变,并产生可遗传表型的遗传现象。目前对于STC发病机制的研究并无证据表明STC属于经典遗传性疾病,关于Dnmt、DNA甲基化乃至表观遗传调控在STC发病中的研究迄今未见报道。因此,结合本研究结果和课题组前期研究成果,我们认为:从表观遗传角度进一步探讨STC的发病机制,可以作为今后疾病研究的一个新的方向,具有一定的研究价值。
相较肿瘤性疾病而言,对于Dnmt在非肿瘤性疾病中的研究鲜有报道,其中主要是探讨Dnmt在炎症性肠病(Inflammatory Bowel Disease, IBD)和溃疡性结肠炎(ulcerative colitis,UC)中的作用。STC结肠存在低度慢性炎症,这与IBD结肠的情况相似。多项研究结果均显示:炎症情况下结肠黏膜Dnmt表达水平明显异常,例如:IBD患者结肠黏膜Dnmt水平显著异常[22];UC患者不典型增生细胞的Dnmt1表达显著增高[26];相较结肠无炎症情况存在的人群,UC患者结肠黏膜Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b表达水平均显著升高[23]。本研究结果与上述研究报道一致。值得一提的是,Dnmt3a、Dnmt3b主要存在于胚胎发育的早期阶段,在卵细胞内表达水平较高,在成体组织中表达很低[27]。本研究结果与上述理论相符,各项实验检测结果显示Dnmt3a、Dnmt3b表达水平在STC组与对照组结肠黏膜均较低,相较对照组,STC组Dnmt3a、Dnmt3b表达水平则显著增高。这些结果均提示:炎症可能是导致Dnmt表达异常增高的原因。基于上述,我们推测:STC结肠存在慢性炎症→Dnmt表达增高→TRPA1基因异常甲基化状态→TRPA1表达降低,并且在今后的研究中将沿着这一思路深入探讨STC的发病机制。综上,Dnmt1、Dnmt3a、Dnmt3b在STC结肠黏膜表达异常增高,这可能是STC发病的重要环节之一。本研究为从一个新的角度,即DNA甲基化方向进一步探讨STC的发病机制提供了较好的理论依据。
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