原发性肝癌是一种高度恶性肿瘤[1]。长期慢性的乙型肝炎病毒感染是导致肝癌的主要危险因素，且长期慢性的乙型肝炎病毒感染同样可导致患者免疫功能的改变[2]。近年来，随着对原发性肝癌发病机制的深入研究，发现免疫学因素在肝癌的发生、发展中发挥重要的作用，自然杀伤细胞、树突状细胞、骨髓抑制细胞、调节性T细胞等多种细胞相互作用形成肝脏肿瘤特异的免疫微环境，这个微环境减弱机体固有的免疫杀伤能力，帮助肿瘤细胞逃逸免疫系统监视，导致了疾病的发生、发展。研究表明HBV相关性肝癌的发生、发展可能与免疫微环境的改变有关[3]。最近有研究表明调节性B细胞通过分泌抑制性因子IL-10，在自身免疫性疾病和炎症性疾病中发挥保护作用，但这种负调节作用在肿瘤性疾病中反而可能会促进疾病的进展[4]。而调节性B细胞在HBV相关性肝癌中的作用目前还尚不清楚。本研究通过检测HBV相关性肝癌患者中CD19+CD24+CD38+调节性B细胞(Bregs细胞)和IL-10的表达，探讨其在肝癌疾病发展中的临床意义。
1 材料与方法 1.1 研究对象收集2016年1月至2017年6月陆军军医大学大坪医院野战外科研究所肝胆科、肿瘤科和消化科收治的93例HBV相关性肝癌患者及47例HBV相关性肝硬化患者的外周血，HBsAg阳性。所有肝癌患者经病理学证实为肝细胞性肝癌，其中74例有肝硬化基础，19例无明显证据表明有肝硬化基础，并排除其他肝炎病毒感染及合并酒精性肝炎、自身免疫性肝病，同时患者在入组前未经任何抗肿瘤相关性治疗。同时入组的57例健康对照人员均来自大坪医院体检中心，年龄、性别与HBV相关性肝硬化组、HBV相关性肝癌组相匹配。93例HBV相关性肝癌患者根据2011年美国肝病研究会推荐的巴塞罗那分期标准(BCLC分期)分为0、A、B、C、D期。收集本院手术切除HBV相关性肝癌标本20例, 每例标本同时收集癌组织、癌旁组织、远癌组织3个部位。
1.2 仪器和试剂NAVIOS流式细胞仪(Beckman Coulter公司，美国)，CFX96 Real-time System(Bio-Rad公司，美国)，IMMULITE1000化学发光分析仪(Siemens公司，德国)，DXI800化学发光免疫分析仪(Beckman Coulter公司，美国)，I2000全自动化学发光免疫分析仪(Abbott公司，美国)，Ficoll淋巴细胞分离液(GE公司，美国)，甲胎蛋白(alpha fetoprotein，AFP)化学发光试剂盒(Beckman Coulter公司，美国)，HBsAg化学发光试剂盒(Abbott公司，美国)，HBV DNA荧光定量试剂盒(湖南圣湘生物科技有限公司，中国)，IL-10化学发光试剂盒(Siemens公司，德国)，CD45-PC7、CD19-ECD、CD24-PE和CD38-FITC，同型对照IgG1，溶血素Optilyse C均购自美国Beckman Coulter公司。
1.3 检测方法 1.3.1 样本采集及处理分别采集各研究对象清晨空腹不抗凝血3~4 mL，分离血清，-80 ℃保存，同时采集EDTA-K2抗凝全血1.5~2 mL；收集HBV相关性肝癌患者组织标本，每例标本同时收集癌组织、癌旁组织(距离肿瘤2 cm组织)、远癌组织(距离肿瘤5 cm以上)。
1.3.2 外周血和组织中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞检测取CD45-PC7/CD19-ECD/CD24-PE/CD38-FITC抗体各10 μL加入流式专用试管底部，以IgG1-ECD/IgG1-PE/IgG1-FITC各10 μL作为同型对照管。每管加入EDTA-K2抗凝全血100 μL，漩涡混匀后，室温避光反应15 min，加入溶血素Optilyse C，室温避光10 min，360×g离心5 min，弃上清液，加入500 μL PBS，混匀后流式细胞仪检测，以CD45和SS两个参数设门，识别淋巴细胞，进一步再以CD19+CD24+CD38+抗体识别调节性B细胞。
1.3.3 HBV血清标志物HBsAg、HBV DNA及血清IL-10检测化学发光法检测HBV血清标志物HBsAg，荧光定量PCR检测HBV DNA病毒载量，化学发光法检测血清IL-10、AFP, 所有检测按照试剂盒说明书操作。
1.3.4 组织中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞检测将获得的癌组织、癌旁组织和远癌组织剪碎，碾磨200目滤网过滤，PBS稀释成细胞悬液，轻轻加于Ficoll淋巴细胞分离液上层，注意动作轻柔，保持清楚的界面，细胞悬液与Ficoll淋巴细胞分离液体积比为2 :1, 400×g水平离心30 min，离心后吸取中间白膜层为单个核细胞，加入5倍体积PBS，300×g离心5 min，洗涤细胞，PBS重悬，流式细胞仪检测方法同外周血。
1.4 统计学方法采用SPSS 13.0统计软件进行统计学分析。患者年龄为计量资料且呈正态分布，以x±s表示，各组间的比较采用单因素方差分析。患者的Bregs细胞比例、血清IL-10水平、HBV DNA、AFP为计量资料且呈非正态分布，以M(P25~P75)表示，采用非参数检验，两组间显著性差异分析采用Mann-Whiteny非参数U检验，多组间显著性差异分析采用Kruskal-Wallis非参数检验，相关性用Spearman相关分析。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 各组基本临床资料HBV相关性肝癌组93例，其中男性86例，女性7例，年龄(51.96±11.58)岁，HBV DNA高于检测下限68例，低于检测下限25例；HBV相关性肝硬化组47例，其中男性39例，女性8例，年龄(50.89±10.17)岁，HBV DNA高于检测下限30例，低于检测下限17例；健康对照组57例，其中男性47例，女性10例，年龄(52.68±9.44)岁。各组间性别、年龄、HBV DNA差异均无统计学意义(P>0.05)。93例HBV相关性肝癌根据巴塞罗那分期标准(BCLC)分为0期4例，A期28例，B期41例，C期19例，D期1例，因0期和D期例数较少，将0期与A期合并为早期，C期和D期合并为晚期，即早期(0+A期)32例，中期(B期)41例，晚期(C+D期)20例。
2.2 各组外周血调节性B细胞分布频率和血清IL-10表达水平HBV相关性肝癌组外周血CD19+CD24+CD38+Bregs细胞占CD45+淋巴细胞的比例[2.43(1.62~ 4.14)%]显著高于HBV相关性肝硬化组[1.65(0.89~ 3.41)%，P < 0.05]和健康对照组[1.44(0.79~2.35)%，P < 0.01], HBV相关性肝硬化组和健康对照组之间差异没有统计学意义(P>0.05)；HBV相关性肝癌组血清IL-10水平[2.60(1.82~3.76)pg/mL]和HBV相关性肝硬化组[2.87(1.83~6.05)pg/mL]显著高于健康对照组[1.19(1.0~1.48)pg/mL, P < 0.01，图 1]。
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| A、D：HBV相关肝癌组；B、E：HBV相关肝硬化组；C、F：健康对照组；A~C：外周血中CD19+CD38+细胞在CD45+细胞中的表达频率；D~F：外周血中CD24+细胞在CD19+CD38+细胞中的表达频率 图 1 各组CD19+CD24+CD38+Bregs细胞分布频率 |
2.3 HBV相关性肝癌组不同分期患者外周血调节性B细胞分布频率和血清IL-10表达水平
HBV相关性肝癌晚期患者(C+D期)外周血CD19+CD24+CD38+Bregs细胞占CD45+淋巴细胞的比例[3.74(2.81~6.78)%]显著高于中期[B期，2.29(1.80~3.71)%，P < 0.05]和早期[0+A期，1.83(0.93~3.25)%，P < 0.01]；晚期血清IL-10水平[3.52(2.44~10.72)pg/mL]较中期升高[2.62(1.86~ 3.67)pg/mL, P>0.05]，且显著高于早期[2.26(1.53~3.16)pg/mL，P < 0.01]。
2.4 HBV相关性肝癌患者外周血CD19+CD24+CD38+Bregs细胞和血清IL-10与临床各参数的关系HBV相关性肝癌患者外周血CD19+CD24+CD38+Bregs细胞频率和血清IL-10与肿瘤是否多发和是否有血管侵犯有密切关系(P < 0.05)，而目前无证据表明与HBV DNA是否阳性、AFP是否升高、肿瘤体积和病理类型有关(P>0.05，表 1)。
| 临床参数 | CD19+CD24+CD38+Bregs | IL-10 |
| HBV DNA | ||
| < 100 U/mL(n=25) | 2.48(1.14~3.94) | 2.83(1.93~3.76) |
| ≥100 U/mL(n=68) | 2.37(1.74~4.24) | 2.51(1.70~3.77) |
| AFP | ||
| < 15 ng/mL(n=32) | 2.46(1.61~3.56) | 2.49(1.53~3.24) |
| ≥15 ng/mL(n=61) | 2.32(1.62~4.34) | 2.61(1.94~4.00) |
| 肿瘤体积 | ||
| < 5 cm(n=48) | 2.29(1.07~4.06) | 2.51(1.70~3.28) |
| ≥5 cm(n=45) | 2.56(1.86~4.33) | 2.62(1.94~4.42) |
| 肿瘤个数 | ||
| 单发(n=63) | 2.10(1.03~2.88)b | 2.41(1.00~3.29)a |
| 多发(n=30) | 4.15(2.57~5.12) | 2.94(2.29~5.05) |
| 血管侵犯 | ||
| 未侵犯(n=75) | 2.21(1.25~3.48)d | 2.56(1.68~3.47)c |
| 侵犯(n=18) | 4.15(2.86~7.20) | 3.52(2.35~6.22) |
| 病理类型 | ||
| 低分化(n=14) | 3.19(1.79~4.48) | 2.47(1.57~3.87) |
| 中分化(n=63) | 2.31(1.64~4.15) | 2.61(1.89~4.64) |
| 高分化(n=16) | 2.29(1.25~3.57) | 2.52(1.40~3.00) |
| 有无肝硬化基础 | ||
| 无肝硬化(n=19) | 1.89(0.96~4.43) | 2.12(1.39~3.27) |
| 有肝硬化(n=74) | 2.43(1.72~4.14) | 2.61(1.87~3.83) |
| a：P < 0.05, b:P < 0.01, 与多发肿瘤比较；c：P < 0.05, d:P < 0.01, 与血管侵犯比较 | ||
2.5 外周血CD19+CD24+CD38+Bregs细胞与血清IL-10相关性分析
直线相关性分析结果显示，HBV相关性肝癌患者外周血CD19+CD24+CD38+Bregs细胞频率与血清IL-10呈正相关(r=0.46, P < 0.01)。
2.6 HBV相关性肝癌组织中调节性B细胞分布频率HBV相关性肝癌组织中，癌组织和癌旁组织CD19+CD24+CD38+Bregs细胞占CD45+淋巴细胞的比例分别为1.34 (0.52~2.55)%、1.36(1.01~3.08)%，显著高于远癌组织[0.57(0.33~1.01)%，P < 0.01，图 2]。
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| A、D：癌组织；B、E：癌旁组织；C、F：远癌组织；A~C：CD19+CD38+细胞在CD45+细胞中的表达频率；D~F：CD24+在CD19+CD38+细胞中的表达频率 图 2 HBV相关性肝癌组织中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞分布频率 |
3 讨论
免疫系统和癌症之间的关系，在过去的几十年里一直被人们所关注，免疫系统在抑制肿瘤方面中发挥着重要作用，它可以通过肿瘤细胞所表达的肿瘤相关抗原和分子，特异性地识别和清除肿瘤细胞[5]。肿瘤的发生与免疫逃逸密切相关，而免疫效应细胞在肿瘤免疫逃逸中发挥着重要的作用。调节性B细胞是近年来发现的一类新的免疫细胞亚群，目前的研究表明，其主要通过分泌IL-10等抑制性因子[6]，调控调节性T细胞(Tregs细胞)、效应性T细胞等免疫细胞，维护机体的免疫平衡，在炎症性疾病和自身免疫性疾病中发挥保护性负向调控作用，但这种负向调控作用在肿瘤中反而可能促进肿瘤的发展。DILILLO等[7]的研究表明慢性淋巴细胞白血病中调节性B细胞可促进肿瘤的侵袭转移。陈葆国等[8]的研究表明CD19+CD5+CD1d+Bregs细胞在肺癌患者外周血中较健康对照显著升高，且与肺癌临床分期密切相关。石家振等[9]也在食管癌中发现了同样的现象。原发性肝癌患者外周血CD38+IgD-B细胞明显升高[10]，而CD27+IgM+B细胞明显降低[11]。调节性B细胞根据表面标记的不同分为多种亚型，其在肝癌中的作用并没有明确阐明。有研究表明，CD19+CD24+CD38+Bregs细胞大量分泌IL-10[12]。
据此，本研究检测了HBV相关性肝癌、HBV相关性肝硬化和健康对照组中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞和血清IL-10的表达，结果发现在HBV相关性肝癌患者的外周血中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞显著高于肝硬化组和健康对照组，且晚期肝癌较早中期肝癌显著升高。同时，本研究结果也显示HBV相关性肝癌患者血清IL-10水平显著高于健康对照组，且晚期肝癌也较早期肝癌显著升高，而HBV相关性肝硬化组显著高于HBV相关性肝癌组和健康对照组，与李建高等[13]的研究结果一致，分析可能是在HBV相关性肝硬化组中病毒刺激机体的自我保护机制，增强IL-10的分泌，抑制肝损伤与肝纤维化的进展，但在是否有肝硬化基础的HBV相关性肝癌的分组比较中，IL-10的表达水平是没有差异的，说明在肿瘤特殊的微环境中，可能存在复杂的免疫调控网络，影响细胞因子的表达。本研究也发现CD19+CD24+CD38+Bregs细胞和血清IL-10与肿瘤是否多发、有无血管侵犯等有密切关系，说明CD19+CD24+CD38+Bregs细胞和血清IL-10可能在肿瘤的发生、发展中扮演着重要的角色。相关性分析表明CD19+CD24+CD38+Bregs频率与血清IL-10呈正相关，提示CD19+CD24+CD38+Bregs细胞可能通过分泌IL-10在HBV相关性肝癌免疫微环境中发挥调节作用，参与肿瘤的发生、发展。本研究也对HBV相关性肝癌的癌组织、癌旁组织和远癌组织中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞的表达进行了检测分析，发现癌组织和癌旁组织显著高于远癌组织，且CD19+CD24+CD38+Bregs细胞在癌旁组织较癌组织中表达频率更高。我们推测正是调节性B细胞在肝组织内这种特殊的分布方式，有利于肿瘤细胞不断地向外扩展，提示CD19+CD24+CD38+Bregs细胞可能在肿瘤发展、转移中扮演着重要的角色。这种分布特征和PENG等[14]报道的Tregs在肝癌内主要位于癌巢周围组织并浸润生长的分布特征基本相同。Tregs作为一种重要的免疫抑制细胞，能够抑制T细胞的功能从而引起肿瘤的扩散、生长[15]，研究者们推测Bregs和Tregs有相同的功能，即在肝癌微环境中发挥免疫抑制功能，促进肿瘤的扩散、发展。
综上所述，本研究表明，HBV相关性肝癌患者中CD19+CD24+CD38+Bregs细胞和血清IL-10表达显著升高，可能会抑制患者体内抗肿瘤免疫细胞的功能，帮助肿瘤细胞免疫逃逸，促进疾病进展。临床上检测调节性B细胞可能有助于对肿瘤诊断和预后的判断。此外，若能够将调节性B细胞特异性地去除，或许能够有效增强机体的抗肿瘤免疫反应，为肿瘤治疗提供一种新的免疫治疗方法。
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