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Smad信号通路在骨形成蛋白9促进牙囊干细胞成骨向分化中的研究
任格, 聂利, 杨霞, 黄丽娜, 王明, 邱叶, 李洁仪, 李丛华     
401147 重庆,重庆医科大学附属口腔医院,口腔疾病与生物医学重庆市重点实验室,重庆市高校市级口腔生物医学工程重点实验室
[摘要] 目的 探索骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)在诱导大鼠牙囊干细胞(rat dental follicle stem cells,rDFCs)成骨向分化过程中的Smad信号通路调控机制。方法 重组腺病毒骨形成蛋白9(recombinant adenoviruses expressing BMP9, Ad-BMP9)转染纯化的第3代rDFCs后,Real- time qPCR、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase,ALP)染色及活性检测观察BMP9调节rDFCs早期及中晚期成骨能力,茜素红S染色检测钙盐沉积,Western blot检测Smad1/5/8磷酸化水平。结果 BMP9促进rDFCs成骨因子表达:成骨转录因子Runx2、成骨细胞特异性转录因子Osterix、ALP及骨桥蛋白(osteopontin,OPN)在BMP9刺激组较空白组均明显升高(P<0.05),钙盐沉积及钙结节形成也明显多于空白组,且BMP9促进了Smad1/5/8蛋白磷酸化水平升高。结论 BMP9通过激活Smad信号通路,提高Smad1/5/8蛋白磷酸化水平从而促进早中晚期成骨因子及碱性磷酸酶表达,促进了rDFCs成骨向分化。
[关键词] 牙囊干细胞     骨形成蛋白9     成骨分化     Smad信号通路    
Smad signaling pathway regulates bone morphogenetic protein 9-induced osteogenic differentiation of rat dental follicle stem cells in vitro
REN Ge , NIE Li , YANG Xia , HUANG Lina , WANG Ming , QIU Ye , LI Jieyi , LI Conghua     
Chongqing Key Laboratory of Oral Disease and Biomedical Sciences, Chongqing Municipal Key Laboratory of Oral Biomedical Engineering of Higher Education, Stomatological Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 401147, China
Supported by the Key Project of Chongqing Municipal Health and Family Planning Commission (2012-1-056), the Natural Science and Technology Foundation of Chongqing (CSTC 2016jcyjA0415) and the General Project of Chongqing Municipal Health and Family Planning Commission (2016MSXM049)
Corresponding author: LI Conghua, E-mail:liconghua1@163.com
[Abstract] Objective To investigate the role of Smad signaling pathway in the regulatory mechanism of bone morphogenetic protein 9 (BMP9)-induced osteogenic differentiation of rat dental follicle stem cells (rDFCs). Methods The third passage of purified rDFCs were transfected with the recombinant adenoviruses expressing BMP9 (Ad-BMP9), and the early and late osteogenesis of rDFCs was detected using real-time qPCR, alkaline phosphatase (ALP) staining, ALP activity assay and Alizarin red S staining. The phosphorylation of Smad1/5/8 in the transfected cells was determined using Western blotting. Results Compared with the control cells, Ad-BMP9-transfected rDFCs showed significantly enhanced expression of the osteogenic factors including Runx2, Osterix, ALP and osteopontin(OPN) (P < 0.05) with also increased calcium deposition and formation of calcium nodules in the early, intermediate and late stages of osteogenesis. Adenovirus-mediated BMP9 gene transduction significantly increased the phosphorylation levels of Smad1/5/8 proteins in rDFCs. Conclusion BMP9 can promote the osteogenic differentiation of rDFCs by activating Smad signaling pathway and increasing the phosphorylation level of Smad1/5/8 proteins to enhance the expression of ALP and osteogenic factors in the early, intermediate and late stages of differentiation.
[Key words] rat dental follicle stem cells     bone morphogenetic protein 9     osteogenesis     Smad signaling pathway    

牙周病是人类两大主要口腔疾病之一[1],是成年人牙齿松动缺失的主要原因所在。对于牙周炎的治疗,牙槽骨缺损修复一直是牙周病治疗的热点和难点,而近年来牙周组织工程技术为牙周组织再生提供了新思路,也是研究牙周骨缺损修复的有效突破口。种子细胞是组织工程中最重要的部分,目前牙周组织工程种子细胞的选择还处于实验探索阶段。牙囊干细胞(rat dental follicle stem cells,rDFCs)为牙周膜细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞的前体细胞,能够分化形成牙周膜、牙骨质及牙槽骨, 作为牙周组织工程种子细胞具有研究价值和临床应用前景[2-3]。生长因子在种子细胞生长过程中起着促进和调控分化的作用,骨形成蛋白BMPs家族成员骨形成蛋白9(bone morphogenetic protein 9,BMP9)作为一种生长和调控因子,是目前证实的BMPs家族成员中具有最强促成骨作用的蛋白。BMPs蛋白通过激活复杂的信号通路促进成骨作用,包括Smad通路和非Smad通路(包括Notch、P38、MAPK、Wnt通路等)[4-5]。然而BMP9促进rDFCs成骨细胞向分化的过程是否是通过激活Smad1/5/8途径未知,本实验探究BMP9是否通过激活Smad1/5/8途径促进rDFCs的成骨分化,并对Smad通路进行调控,为牙周组织工程的进一步研究提供实验依据。

1 材料与方法 1.1 主要设备和试剂

倒置相差显微镜(Nikon,日本)、细胞培养箱(Thermo, 美国)、多功能电泳仪(Nikon,日本)、PCR仪(Bio-Rad,德国)、细胞培养瓶/培养皿(Corning,美国)、手术器械包。

DMEM/F12(HyClone公司)、胎牛血清(FBS,Gibco公司)、0.25%胰酶(碧云天公司)、地塞米松、抗坏血酸、β-磷酸甘油(Sigma公司)、茜素红染液(索莱宝公司)、ALP染色及活性检测试剂盒(碧云天公司)、RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司)、蛋白抽提试剂盒、RIPA细胞裂解液、蛋白浓度测定试剂盒、Smad1/5/8蛋白磷酸化抑制剂Compound C(MCE, 美国)。

普通培养基(DMEM/F12、1%双抗、10%FBS)、成骨诱导培养基(DMEM/F12、1%双抗、10% FBS、10 mmol/L地塞米松、50 mg/L抗坏血酸,100 nmol/L β-磷酸甘油)。

携带BMP9基因的腺病毒载体(Ad-BMP9)由美国芝加哥大学医学中心何通川教授团队构建[6]并惠赠,本研究室保存。

1.2 方法

1.2.1 牙囊干细胞的原代培养及BMP9转染

体式显微镜下取6日龄SD乳鼠下颌第一、二磨牙牙囊组织,采用组织块法和酶消化法,体外培养大鼠牙囊干细胞,差速传代法纯化牙囊干细胞。细胞每3天换液,细胞融合达80%时按1 :2传代,显微镜下观察细胞形态并拍照记录,传至第3代时用于后续实验研究。

选取第3代牙囊干细胞于T-25培养瓶内重悬,细胞6 h贴壁后,实验组加BMP9病毒液,对照组加GFP,空白对照组加等量PBS。并加入polybrene(浓度为8 mg/L),37 ℃, 5% CO2孵箱中培养8 h后更换新鲜培养基,分别于24、48 h镜下观察荧光表达情况。

1.2.2 Western blot检测

重悬rDFCs,按5×104/mL细胞密度加入10 cm培养皿,细胞贴壁后按如下分组加入病毒液及更换培养基。分组如下:空白组、GFP组、BMP9组、BMP9+500 nmol/L Compound C组(在结果图注中以CC表示)。24 h后去掉培养基,PBS清洗2遍,加入细胞裂解液(RIPA+PMSF+磷酸化酶抑制剂+蛋白酶抑制剂)150 μL/孔,冰上裂解30 min, 收集裂解液,12 000 r/min, 离心5 min.收集上清液。测蛋白浓度,加上样缓冲液,沸水浴5 min, 聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE), 转膜, 封闭,一抗孵育过夜、二抗孵育1 h,ECL显影成像。

1.2.3 ALP活性检测不同浓度Compound C对BMP9转染后rDFCs表达ALP活性的影响

取生长状态良好第3代牙囊干细胞,重悬后按2×104/mL细胞密度加入24孔板内,4 h后按下列Compound C浓度和分组更换培养液:0 nmol/L、GFP+0 nmol/L组、BMP9+0 nmol/L组、BMP9+50 nmol/L组、BMP9+100 nmol/L组、BMP9+500 nmol/L组。8 h后再更换相应Compound C浓度的成骨培养基。每组5个复孔,分别于第3、5、7、9天做如下处理:PBS清洗2遍,加入0.2% Triton X-100,200 μL/孔,裂解细胞30 min, 收集裂解液体,12 000 r/min离心5 min, 取上清样品,用ALP活性检测试剂盒进行ALP活性检测。

1.2.4 ALP染色检测不同浓度Compound C对BMP9转染后rDFCs表达ALP的影响

取生长状态良好第3代牙囊干细胞,重悬后按2×104/mL细胞密度加入24孔板内,4 h后按下列Compound C浓度和分组更换培养液,0 nmol/L、GFP+0 nmol/L组、BMP9+0 nmol/L组、BMP9+50 nmol/L组、BMP9+100 nmol/L组、BMP9+500 nmol/L组。8 h后更换相应Compound C浓度的成骨培养基。每2天换液1次。第7天时,弃培养基,PBS洗2次,4%多聚甲醛固定30 min, PBS清洗3次,5 min/次,加入ALP染色工作液,37 ℃孵育20 min, PBS清洗2次,5 min/次,镜下观察染色情况并采集图像。

1.2.5 茜素红染色

取生长状态良好第3代牙囊干细胞,重悬后按每孔2×104/mL细胞密度加入24孔板内,4h后按下列分组更换培养液,分组如下:空白组、GFP组、BMP9组、BMP9+500 nmol/L组。8 h后分别更换含或不含500 nmol/L Compound C的成骨诱导培养基。每组5个复孔,每2天换液。第14、21天时,弃培养基,PBS清洗2次,4%多聚甲醛固定30 min,PBS清洗3次,5 min/次,每孔加入茜素红染液200 μL,37 ℃孵育20 min,PBS清洗2次,5 min/次,显微镜下观察染色情况并记录。

1.2.6 Real-time qPCR检测

取生长状态良好第3代牙囊干细胞,弃培养液,PBS清洗2遍,1 mL 0.25%胰酶37 ℃下消化约1 min,3 mL培养液终止消化,吹打细胞,1 000 r/min,离心3 min,重悬后按5×104/mL细胞密度加入6 cm培养皿中,4 h后按下列分组更换培养液:空白组、GFP组、BMP9组、BMP9+500 nmol/L组。8 h后更换相应含或不含500 nmol/L Compound C的成骨培养基。每2天换液1次。分别于第3、5、7、9天时提取RNA,进行Real-time qPCR。

1.3 统计学分析

所有数据采用SPSS 20.0统计软件分析, 采用单因素方差分析和配对t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 rDFC原代培养、细胞形态观察及BMP9转染结果

组织块法和酶消化法消化大鼠牙囊组织,细胞在组织块贴壁后爬出,4~5 d细胞单层铺于瓶底约80%,呈现多形性形态,主要以多角形、长梭形两种形态存在(图 1A)。原代细胞中间掺杂上皮细胞,经梯度消化法传至第3代时,细胞得到纯化(图 1B)。本课题组前期实验已对rDFCs进行了细胞培养及鉴定[3, 7],免疫组化rDFCs波形蛋白表达呈阳性,角蛋白表达呈阴性,流式细胞术中CD31、CD146、Stro-1阳性,证实rDFCs来源于间充质干细胞,具有干细胞特性。BMP9和GFP感染牙囊干细胞24 h后,感染率约50%,48 h后约90%(图 1C~F),说明BMP9成功感染牙囊干细胞。

A:原代rDFCs(×40);B:第3代rDFCs(×100);C~F:BMP9和GFP感染rDFCs 48 h荧光表达(×100) 图 1 倒置荧光显微镜观察rDFCs形态及荧光表达

2.2 Western blot检测结果

Western blot检测结果显示:各组中,蛋白总量无明显改变。Smad1/5/8蛋白均被检测到,并且也未见明显区别。P-Smad1/5/8蛋白在Blank组和GFP组中未能检测到,而在BMP9转染组中,P-Smad1/5/8蛋白被检测到,条带颜色最深。BMP9+500 nmol/L Compound C组中,P-Smad1/5/8蛋白相对BMP9组明显减少,如图 2。这说明BMP9促进rDFCs成骨分化过程中,通过促进Smad1/5/8磷酸化来促进成骨。

1:Blank组;2:GFP组;3:BMP 9组;4:BMP9+CC组 图 2 Western blot检测Smad1/5/8磷酸化水平

2.3 ALP活性检测结果

ALP活性检测中,BMP9转染后的第3天,与空白组和GFP组相比,ALP表达已经明显增高,在加入Compound C阻断剂组中,ALP表达相对于BMP9组有所减少,并且随着Compound C浓度升高,ALP逐渐减少,在500 nmol/L Compound C组中,ALP活性最低。在5、7、9 d的检测结果中与第3天的结果一致,如图 3

a: P < 0.01, 与Blank组比较;b: P < 0.05, c: P < 0.01, 与BMP9组比较 图 3 不同浓度Compound C对rDFCs表达ALP活性的影响

2.4 ALP染色结果

细胞培养第7 d时进行ALP染色,ALP能被试剂盒染色蓝紫色,ALP表达越强,颜色越深。在Blank组和GFP组中,ALP染色浅。经过BMP9刺激后的rDFCs在第7天时,ALP染色颜色最深,所染上的蓝紫色面积最多,表明rDFCs成骨活性最强。在含Compound C组中,ALP染色深浅与Compound C浓度呈负相关,即Compound C的浓度越高,染色越浅。本实验中,浓度最高的500 nmol/L Compound C组中,ALP染色最浅,细胞成骨活性最低(图 4)。

图 4 不同浓度Compound C对rDFCs表达ALP的影响(×40)

2.5 茜素红染色结果

分别于细胞生长到第14、21天时,进行茜素红染色,沉积的矿物盐和形成的钙结节能被茜素红染成橘红色。Blank组和GFP组中,可偶见染成橘红色的钙结节。经过BMP9刺激后的rDFCs,在第14天时,可见到大量沉积的钙盐和形成的钙化结节被染成橘红色,大小不一,而通过Compound C抑制后,与BMP9组相比,染成橘红色的钙盐和钙结节相对明显减少。在第21天时染色结果与14 d时结果一致,如图 5。这说明BMP9促进牙囊干细胞成骨分化,促进了钙盐的沉积和钙结节的形成,而抑制了Smad1/5/8信号通路后,钙盐沉积和钙结节形成也减少,说明细胞的成骨能力减弱。

图 5 茜素红染色检测BMP9对rDFCs成骨作用及Compound C的抑制作用(×100)

2.6 Real-time qPCR检测结果

在第3、5、7、9天,Real-time qPCR检测4个组相关成骨因子表达情况。对Runx2、Osteriox、ALP、及OPN基因表达进行分析。Runx2及Osterix是成骨分化转录因子,ALP和OPN分别为早中期和晚期成骨标志物。通过软件分析,与Blank组和GFP组相比,BMP9转染rDFCs后相关成骨因子表达明显增高(P < 0.01),而在Compound C组中,相关成骨因子表达减少(P < 0.05,图 6)。

A: ALP;B: Osterix;C: OPN;D: Runx2 (3 d) a: P < 0.01, b: P < 0.05, 与Blank组比较;c: P < 0.01, d: P < 0.05, 与BMP9组比较 图 6 Real-time qPCR检测各组相关成骨因子表达情况

3 讨论

牙囊干细胞是牙周膜细胞、成牙骨质细胞和成骨细胞的前体细胞,能够在一定条件下诱导分化成牙周组织。在牙齿发育后期,最外层牙囊干细胞分化为成骨细胞形成固有牙槽骨,而中间层分化为牙周膜细胞形成牙周膜组织,最内层分化为成牙骨质细胞形成牙骨质[8]。本课题组前期实验[3]及本实验主要研究牙囊干细胞成骨分化的能力及BMP9对牙囊干细胞的强成骨诱导作用,深入机制研究并调控Smad信号通路,为临床应用组织工程技术以牙囊干细胞作为种子细胞、BMP9作为生长因子、结合载体材料进行体外构建具有骨引导性和骨诱导性的三维组织工程化模型来更理想地修复牙周炎导致的牙槽骨缺损奠定基础,为干细胞移植更安全有效地应用于临床提供了理论依据。在一定条件下,牙囊干细胞也可能促进牙周软组织再生。

BMPs通过Smad1/5/8信号通路激活促进干细胞成骨分化,2个跨膜蛋白丝氨酸/苏氨酸激酶受体BMPR-Ⅰ和BMPR-Ⅱ结合在一起,促使Smad1/5/8发生磷酸化形成磷酸化的Smad1/5/8(P-Smad1/5/8),然后P-Smad1/5/8在细胞核内与Smad4结合形成一个异质二聚体,从而激活靶基因[5, 9-11]。Dorsomorphin 2HCl即是Compound C,能抑制ACTR-Ⅰ(ALK2)、BMPR-ⅠA(ALK3)和BMPR-ⅠB(ALK6),从而阻断Smad1/5/8的磷酸化,阻断靶基因的表达[12]

本课题组前期预实验结果显示,BMP9促进了P-Smad1/5/8蛋白的表达,在加入Compound C后,P-Smad1/5/8蛋白减少,说明Compound C阻断了Smad1/5/8蛋的磷酸化。前期预实验选取2nmol/L至2μmol/L不同浓度Compound C刺激牙囊干细胞后观察细胞活性,500 nmol/L可作为保证牙囊干细胞状态良好的最大刺激量。本实验Western blot检测结果显示BMP9能促进Smad1/5/8的磷酸化,而Compound C能阻断BMP9诱导rDFCs成骨分化过程中Smad1/5/8磷酸化。ALP活性检测、细胞染色结果显示:Compound C阻断Smad1/5/8磷酸化后,ALP活性降低,ALP表达减少,且与Compound C浓度成负相关,即Compound C浓度越高,ALP活性越低,ALP染色越浅,在Compound C为500 nmol/L组时最低,矿物盐沉积和钙结节形成减少,并且RT-qPCR结果显示早、中、晚期成骨相关基因(Runx2、Osterix、ALP、OPN)的表达也减少。以上研究结果显示BMP9诱导rDFCs成骨分化及表达成骨因子过程中,激活了Smad信号通路,并受Smad1/5/8信号通路调控,Smad1/5/8信号通路被阻断后,BMP9促进rDFCs成骨的作用明显减弱。本课题组以往研究表明,BMP9还可以通过非经典的Smad通路P38和ERK1/2 MAPK刺激rDFCs成骨向分化,过表达成骨相关因子[3]

虽然BMP9-Smad信号通路在成骨分化中的作用已有报道,如陈冰等[13]证明了根尖牙乳头干细胞(stem cell from the apical papilla, SCAP)在BMP9诱导成骨/成牙本质过程中的Smad信号通路的激活及调控。但是针对牙囊干细胞的研究鲜有报道。SCAP来源于根尖区组织,可以从牙胚或年轻恒牙的根尖牙髓与牙乳头之间的干细胞富集区获得,SCAP表达早期间充质表面标志物STRO-1和CD146,也表达一个独特的标志CD24,在DPSCs和BMMSCs都没有检测到。SCAP有成骨、成牙本质等多向分化潜能,是牙根发育时牙根部成牙本质细胞的重要来源,可用于牙髓、牙本质的再生和生物学牙根的再生[14-16]。而本研究的牙囊干细胞来源于牙囊,是一种疏松结缔组织,包绕着牙胚期的成釉器和牙乳头。本课题组前期实验已成功分离及鉴定DFCs:波形蛋白表达阳性,角蛋白表达阴性,说明其来源于外胚间充质;阳性表达CD31、CD146、STRO-1、Vimentin等证明其间充质干细胞特性[17-18]。DFCs有较强的自我更新能力和体内、外多向分化潜能[19]。DFCs是牙周组织前体细胞,可能在分化形成牙周组织方面会表现出更多的优势,为牙周组织工程干细胞的选择、甚至牙齿移植、牙再植及牙再生提供更多可能。

综上所述,本实验结果证明BMP9在促进rDFCs成骨向分化过程中,受到了Smad1/5/8信号通路调控。当Smad1/5/8信号通路被抑制时,BMP9促进rDFCs成骨作用减弱,成骨相关因子的表达减少。这为探索BMP9促进rDFCs成骨的作用机制奠定基础,为rDFCs应用于牙槽骨缺损的再生和愈合提供理论依据。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711134
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任格, 聂利, 杨霞, 黄丽娜, 王明, 邱叶, 李洁仪, 李丛华.
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Smad信号通路在骨形成蛋白9促进牙囊干细胞成骨向分化中的研究
Smad signaling pathway regulates bone morphogenetic protein 9-induced osteogenic differentiation of rat dental follicle stem cells in vitro
第三军医大学学报, 2018, 40(12): 1066-1072
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(12): 1066-1072
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711134

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收稿: 2017-11-16
修回: 2018-01-03

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