2. 400016 重庆，重庆医科大学基础医学院：生物信息学教研室;
3. 400016 重庆，重庆医科大学基础医学院：实验教学中心
2. Department of Bioinformatics, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China;
3. Experimental Teaching Center, College of Basic Medical Sciences, Chongqing Medical University, Chongqing, 400016, China
糖尿病肾病(diabetic nephropathy，DN)是糖尿病严重的并发症之一，约占糖尿病发病人数的1/3，给人类健康带来极大的威胁[1]。研究表明，高糖、高脂、高血压、血流动力学、氧化应激、炎症等多方面复杂的致病因素导致糖尿病患者肾脏细胞外基质累积、肾小球肥大、肾小球基底增厚和肾小球硬化，并参与DN的发生、发展，但其确切机制尚不清楚[2-3]。近年来学者们提出的“微炎症”学说认为DN是一种低度炎症和自然免疫性疾病[4]，其具体机制值得进一步研究。长链非编码RNA(long non-coding RNA, lncRNA)是一类长度大于200 nt的非编码RNA，参与复杂而精确基因调控网络，与多种疾病的炎症发生相关。本课题组前期实验发现，lncRNA Gm4419在高糖培养的小鼠肾小球系膜细胞(mesangial cells, MCs)中异常高表达，且对MCs的增殖及纤维化具有明显的促进作用[5]，提示其在DN MCs病理生理过程中发挥作用，但其在MCs炎症过程中的作用有待进一步研究。
为探索Gm4419在DN炎症发生过程中的作用及机制，本研究应用Gm4419小干扰RNA(siRNA)及构建的Gm4419过表达质粒转染于高、低糖培养的MCs中，观察炎症相关因子单核细胞趋化蛋白-1(monocyte chemotactic protein 1，MCP-1)及肿瘤坏死因子-α (tumor necrosis factor α，TNF-α)的表达情况，采用生物信息技术分析Gm4419与核转录因子-kappa B (nuclear factor-kappa B，NF-κB)亚基p50及p65的关系，检测过表达或沉默Gm4419后对p50及p65表达及入核活化的影响，探索Gm4419对DN炎症的影响及机制，旨在为疾病的发生机制阐明提供新的思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料与试剂肾小球MCs SV40-MES13细胞株(中国科学院细胞库)；高、低糖DMEM液体培养基(美国HyClone公司)；LipofectamineTM2000、pcDNA3.1(+)表达载体、无血清培养基Opti-MEM®、TRIzol、PCR引物(美国Invitrogen公司)；Gm4419 siRNA、siRNA NC、澳洲特级胎牛血清(上海生工生物工程股份有限公司)；SYBR® Premix Ex TaqTM Ⅱ(大连宝生物工程有限公司)；Western blot及IP细胞裂解液、BCA蛋白定量试剂盒、兔抗鼠组蛋白H3、DAPI(上海碧云天生物技术有限公司)；PVDF膜、ECL化学发光检测试剂盒(美国Millipore公司)；辣根酶标记山羊抗兔IgG(北京中杉金桥生物技术有限公司)；兔抗鼠p65、兔抗鼠p50、兔抗鼠MCP-1(美国Abcam公司)；PARISTM试剂盒(美国Life Technologies公司)；SN50(NF-κB p50特异性抑制剂，瑞士Enzo公司)。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养和转染小鼠肾小球MCs培养于DMEM培养基中，内含10%灭活胎牛血清，置于37 ℃、5%CO2浓度的培养箱中培养，待细胞融合度达到80%时，0.25%胰蛋白酶消化细胞，800 r/min离心5 min，收集细胞进行传代或冻存。将细胞分别以含5.5 mmol/L+19.5 mmol/L甘露醇的DMEM培养基模拟正常生理状态(低糖组，即L-MC组)；以25 mmol/L葡萄糖的DMEM培养基模拟糖尿病高糖状态(高糖组，即H-MC组)。取对数生长期的MCs，以每孔5.5× 105个细胞接种于6孔板，每组设3个平行孔，按脂质体Lipofectamine 2000转染试剂操作手册进行转染，将Gm4419 siRNA及其对照组分别转染到高糖培养的MCs(即H-MC siGm4419组、H-MC siNC组)，将pcDNA-3.1(+)-Gm4419及空质粒分别转染到低糖培养的MCs中[即L-MC Gm4419(+)组、L-MC pcDNA-3.1组]，转染后4~6 h更换新鲜培养基，24~48 h后收获细胞，RT-qPCR检测转染效率或进行后续实验。
1.2.2 RT-qPCR检测Gm4419、MCP-1、TNF-α、p50和p65 mRNA表达水平按TRIzol试剂说明书步骤提取MCs总RNA。按PARISTM试剂盒说明书提取细胞核及细胞质RNA。用酶标仪检测RNA的浓度和纯度。RNA反转录反应体系按反转录试剂盒说明书进行，经37 ℃ 15 min，85 ℃ 5 s，反转录合成cDNA。利用Primer Premier 5.0软件设计小鼠Gm4419、MCP-1、TNF-α、p50和p65引物, 进一步使用在线软件BLAST分析引物特异性，并由美国Invitrogen公司合成。Gm4419(885 bp)上游引物：5′-GGAACCAAGCAGACCGAAGAC-3′，下游引物：5′-CCCCAACCCACAGGAACATAA-3′；MCP-1(117 bp)上游引物: 5′-GACCCGTAAATCTGAAGCTAATGC-3′，下游引物: 5′-AATTAAGGCATCACAGTCCGAGTC-3′；TNF-α(109 bp)上游引物: 5′-CCCTCCTGGCCAACGGCATG-3′，下游引物: 5′-TCGGGGCAGCCTTGTCCCTT-3′；p65(123 bp)上游引物: 5′-GACCTGGAGCAAGCCATTAG-3′，下游引物: 5′-CACTGTCACCTGGAAGCAGA-3′；p50(103 bp)上游引物：5′-CAGGTCCACTGTCTGCCTCT-3′，下游引物: 5′-GGAAGGATGTCTCCACACCA-3′；β-actin(154 bp)上游引物: 5′-GGCTGTATTCCCCTCCATCG-3′，下游引物: 5′-CCAGTTGGTAACAATGCCATGT-3′。
以反转录产物cDNA为模板对上述基因的编码区扩增，反应体系为：10 μL SYBR Premix Ex Taq，0.5 μL PCR上游引物，0.5 μL PCR下游引物，2 μL cDNA，7 μL灭菌蒸馏水。将混合均匀的反应液于CFX96TM Real-time PCR仪完成反应，每个检测指标设3个平行复孔。反应条件为95 ℃预变性30 s；95 ℃变性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸30 s，进行40个循环；最后以β-actin为内参利用公式2-△△Ct计算获得最终结果。
1.2.3 Western blot检测p50和p65表达情况收集转染48 h后的MCs，离心沉淀后按100:1的比例加入RIPA裂解液和PMSF冰上裂解30 min，期间每间隔5 min漩涡振荡15 s，15 000 r/min离心30 min，收集上清液。BCA法测定蛋白质浓度。按1:5的比例混合SDS-PAGE蛋白上样缓冲液和上清液，100 ℃，10 min蛋白变性。SDS-PAGE后，转膜，分别加入兔抗鼠p50抗体(1:500稀释)、兔抗鼠p65抗体(1:500稀释)、兔抗鼠MCP-1抗体(1:500稀释)、兔抗鼠组蛋白抗体(1:500稀释)和兔抗鼠GAPDH抗体(1:1 000稀释)，4 ℃过夜，TBST洗PVDF膜3次后，加入辣根酶标记山羊抗兔lgG(1:8 000稀释)，室温摇床孵育2 h，ECL显色，以GAPDH、组蛋白H3作为内参。CM-2000B型生物医学成像系统(北航)进行灰度分析。
1.2.4 免疫荧光法检测MCP-1、TNF-α蛋白表达水平细胞爬片转染48 h后收集细胞，甲醛固定30 min，山羊血清封闭1 h, 一抗MCP-1(1:50稀释)、TNF-α抗体(1:50稀释)4 ℃过夜，二抗孵育1 h后进行DAPI染色，封片后于激光共聚焦显微镜下进行荧光检测，LAS AF Lite软件分析摄取图片。
1.2.5 生物信息学技术预测NF-κB亚基p50、p65与Gm4419启动子的结合情况应用Ensembl (http://asia.ensembl.org/index.html)数据库查找Gm4419启动子区域序列；对JASPAR (http://jaspar.genereg.net/)、TRAP (http://trap.molgen.mpg.de/cgi-bin/trap_two_seq_form.cgi)、rVista (http://www.rcista.dcode.org)和TFSEARCH (http://www.cbrc.jp/research/db/TFSEARCH.html)进行NF-κB亚基p65和p50与Gm4419启动子序列的结合位点预测。
1.3 统计学分析采用SPSS 20.0统计软件，数据以x±s表示，多组比较采用单因素方差分析，两组比较采用t检验。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 Gm4419在高糖培养的MCs中的表达及分布采用RT-qPCR检测高、低糖培养细胞Gm4419的表达水平。结果显示，H-MC组Gm4419的表达水平显著高于L-MC组(P < 0.05，图 1)。同时，Gm4419在MCs的亚细胞分布呈现核、质中均有分布，但主要位于细胞质(P < 0.05，图 1)。
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| a: P < 0.05，与同组细胞核比较；b:P < 0.05，与L-MC组比较 图 1 高、低糖肾小球MCs中Gm4419亚细胞分布 |
2.2 高糖条件下Gm4419促进MCs炎症因子的表达
RT-qPCR检测上、下调Gm4419后对炎症相关因子MCP-1和TNF-α表达的影响。结果显示，MCs中过表达Gm4419后MCP-1和TNF-1表达水平显著升高(P < 0.01)；而沉默Gm4419后MCP-1和TNF-α表达水平均显著降低(P < 0.01，图 2)，提示Gm4419可影响MCs炎症因子表达水平。同时，采用免疫荧光法检测上、下调Gm4419后MCP-1、TNF-α表达情况，结果与RT-qPCR检测结果相一致(图 3)。以上结果均提示Gm4419对MCs炎症因子表达具有调控作用，参与DN炎症。
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1：L-MC组；2：L-MC pcDNA-3.1组；3：L-MC Gm4419(+)组；4：H-MC组；5：H-MC siNC组；6：H-MC siGm4419组 a：P < 0.01，与L-MC组比较；b：P < 0.01，与L-MC pcDNA-3.1组比较；c：P < 0.01，与H-MC组比较；d：P < 0.01，与H-MC siNC组比较 图 2 RT-qPCR检测高、低糖肾小球系膜中Gm4419对MCP-1(A)、TNF-α(B)mRNA表达的影响 |
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| 图 3 高、低糖肾小球MCs中Gm4419对MCP-1、TNF-α蛋白表达的影响(荧光显微镜×400) |
2.3 Gm4419在高糖条件下调控MCsNF-κB信号通路的活化
采用生物信息学方法寻找与Gm4419相关的转录因子，结果显示Gm4419与NF-κB 2个亚单位p50和p65均存在预测结合位点(p50：-488~-478 bp；p65：-487~-478 bp)。这提示Gm4419与NF-κB可能存在着某种联系，NF-κB通路可能是Gm4419参与DN炎症的重要途径。
进一步采用RT-qPCR检测p50和p65在高、低糖培养的MCs中的表达情况，结果显示H-MC组中p50和p65表达水平明显高于L-MC组(P < 0.01，图 4)，说明NF-κB信号通路在DN中扮演重要角色。同时，由于NF-κB通路的激活过程伴随着p50和p65的入核现象，采用Western blot检测在高、低糖MCs中上、下调Gm4419后细胞核p50和p65蛋白表达水平。结果显示H-MC siGm4419组中p50和p65核蛋白表达水平较H-MC组及H-MC siNC组显著增加(P < 0.01)。同时，L-MC Gm4419(+)组p50和p65核蛋白表达水平较L-MC组和L-MC pcDNA3.1组显著降低(P < 0.01，图 5)，表明Gm4419可增加NF-κB p50和p65核内表达。以上结果提示Gm4419可促进MCs p50和p65入核，从而活化NF-κB通路。
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| a: P < 0.01，与L-MC组比较 图 4 RT-qPCR检测高、低糖肾小球MCs中NF-κB亚基p50和p65的表达水平 |
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1：L-MC组；2：L-MC pcDNA-3.1组；3：L-MC Gm4419(+)组；4：H-MC组；5：H-MC siNC组；6：H-MC siGm4419组 A：Western blot检测结果；B、C：分别为p50、p65蛋白半定量分析结果a：P < 0.01，与L-MC组比较；b：P < 0.01，与L-MC pcDNA-3.1组比较；c：P < 0.01，与H-MC组比较；d：P < 0.01，与H-MC siNC组比较 图 5 肾小球MCs中上、下调Gm4419对p50和p65细胞核内表达的影响 |
2.4 抑制p50活性可阻断Gm4419促进MCs炎症因子的表达
为探索NF-κB与Gm4419对DN炎症相关因子表达的影响，我们采用NF-κB p50特异性抑制剂SN50，通过Western blot检测MCs中抑制p50前后过表达Gm4419对炎症相关因子MCP-1表达水平的影响。结果显示，过表达Gm4419促进MCs MCP-1的表达，但特异性抑制p50后过表达Gm4419则不能影响MCP-1的表达(图 6)。
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1：L-MC组；2：L-MC Gm4419(+)组；3：L-MC Gm4419(+)+SN50组 A：Western blot检测结果；B：半定量分析结果a：P < 0.01，与L-MC组比较；b：P < 0.01，与L-MC Gm4419(+)组比较 图 6 特异性抑制p50对MCs Gm4419促进炎症相关因子表达的影响 |
3 讨论
近年来，炎症在DN的发病机制中越来越得到学者的关注。DN患者存在炎细胞浸润和多种炎症介质表达水平增高，此慢性炎症状态在糖尿病早期肾病发展中发挥重要作用，且DN的进展与长期的微炎症状态和免疫系统的活化亦密切相关[6]。在DN肾脏固有细胞的炎细胞浸润中巨噬细胞、中性粒细胞、肥大细胞等均参与其中。近年越来越多的证据还表明炎症相关因子在DN中具有重要的作用，包括白介素类(interleukin, IL)、黏附因子、趋化因子、TNF-α等[7]。研究发现，MCP-1作为经典的趋化因子之一，通过募集众多炎性细胞至肾脏局部，加剧肾脏的炎性反应损伤过程[8]；TNF-α诱导细胞凋亡，同时通过细胞毒作用对肾脏产生直接损伤作用，它们是导致DN炎症的重要指标[9]。同时本课题组前期研究也发现在高糖培养的MCs以及糖尿病肾病模型小鼠db/db肾脏组织中炎症相关因子TNF-α、IL-18、细胞间黏附分子-1(intercellular cell adhesion molecule-1，ICAM-1)以及髓样分化因子88(myeloid differentiation factor 88，MYD88)呈异常增高，其机制涉及微小RNA调控的NF-κB信号通路[10]。因此，炎症因子的异常表达在DN的发生、发展中扮演了重要角色。然而，在DN中炎症涉及机制十分复杂，其具体机制有待进一步研究。
lncRNA作为复杂调控网络的新成员，近年来逐步成为研究热点，在胃癌[11]、肺癌[12]、急性巨核白血病[13]等多种疾病的发生、发展中均扮演着重要的角色。lncRNA的异常表达与DN的发生、发展密切相关，HU等[14]研究发现lncRNA MALAT1可通过与β链蛋白相互作用参与肾足细胞的损伤；LONG等[15]研究发现lncRNA Tug1与DN线粒体的调节过程密切相关；本课题组前期发现高糖环境下lncRNA-Gm4419对MCs的增殖及纤维化具有明显的促进作用[5]。不仅如此，lncRNA还作为重要的炎症调节因子参与急性心肌梗死[16]、多发性硬化症[17]等疾病的发生、发展。由此，lncRNA可能在DN炎症过程中扮演重要角色。
本研究采用RT-qPCR检测高、低糖培养的MCs中Gm4419的表达，结果显示Gm4419在高糖组细胞中显著高于低糖组。进一步采用过表达质粒和siRNA在MCs上、下调Gm4419的表达，探索Gm4419在DN炎症中的作用。结果显示，在高糖组炎症相关因子MCP-1和TNF-α表达水平较低糖组显著增高。有趣的是，在高糖组沉默Gm4419后，其表达水平显著降低；反之，在低糖组中过表达Gm4419后，MCP-1、TNF-α表达水平则显著增高(P < 0.01)。由此提示，Gm4419可能是一个DN炎症过程的重要因子，可调节炎症相关因子的表达水平。
由于lncRNA的亚细胞定位不同，其发挥的作用也不同。分布于胞质的lncRNA主要参与竞争性内源RNA(competing endogenous RNAs, ceRNA)过程以及与蛋白形成复合物参与基因调控等；若位于胞核，则主要参与染色体重塑、转录等过程[18-19]。本研究结果显示，Gm4419在MCs的核质均有表达，但主要分布于细胞质中，提示Gm4419可能主要发挥基因调控作用，为Gm4419的后续研究提供了依据。
为探索Gm4419参与DN炎症发生的具体机制，我们采用生物信息学方法分析Gm4419与已知转录因子的相互关系，其中NF-κB引起我们的关注。结果发现，NF-κB两个亚基p50和p65均与Gm4419有结合关系。同时NF-κB作为DN炎症发生的关键环节[20]，课题组前期已经证明NF-κB参与MCs炎症的发生[10]。由此提示，Gm4419可能通过与NF-κB通路的相互作用参与DN炎症过程。NF-κB作为Rel蛋白家族的转录因子，在哺乳动物中包括p50(NF-κB1)、p65(RelA)、p52(NF-κB2)、RelB及c-Rel 5个亚基，这些亚基均有Rel同源区，能够形成异源或同源二聚体，参与炎症反应、机体免疫、细胞分化等过程，其中p50及p65所构成的二聚体是NF-κB最早被发现且存在最广的结构类型。本研究发现在高糖环境下，肾小球MCs中NF-κB亚基p50、p65显著升高，提示NF-κB与DN相关。研究表明，细胞质中的NF-κB受其抑制蛋白IκB抑制，当IκB被蛋白酶体降解后，活化的NF-κB进入细胞核发挥转录因子的作用，NF-κB入核是其活化的重要标志[21]。本研究Western blot检测结果显示，过表达Gm4419后，p50和p65在细胞核中表达水平显著增高；反之，沉默Gm4419后，p50及p65在细胞核中的表达水平显著下降，提示Gm4419可促进p50和p65的入核，导致NF-κB信号通路的活化。同时，应用NF-κB特异性抑制剂SN50可阻断Gm4419促进炎症相关因子MCP-1表达增加的作用，说明Gm4419通过NF-κB通路影响DN炎症因子表达。
综上所述，高、低糖培养的MCs中Gm4419可调节DN炎症过程，其机制可能是Gm4419促进NF-κB亚基p50和p65入核，活化NF-κB通路，激活炎症相关因子表达。因此，通过针对Gm4419及其靶点药物的研究，可能成为治疗DN的新思路。然而，lncRNA对DN的影响及其机制十分复杂，涉及RNA之间、RNA与蛋白之间众多复杂网络调控等，lnRNA Gm4419与NF-κB通路的具体内在关系如何，孰因孰果，尚需进一步研究。
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