2. 350000 福州,福建医科大学附属第一医院:胃肠外科
2. Department of Gastrointestinal Surgery, First Affiliated Hospital of Fujian Medical University, Fuzhou, Fujian Province, 350005, China
结肠癌是一种常见的消化道恶性肿瘤,在全球范围内发病率仅次于乳腺癌及肺癌。即使随着结肠癌诊断技术(CT、肠镜等)不断发展,患者术后5年生存率仍较差。癌细胞的侵袭转移是结肠癌患者预后较差的重要原因[1-2]。结肠癌的发病机制尚未明确,专家学者一致认为结肠癌的发生发展是一个多因素、多步骤的复杂过程,癌基因的激活及抑癌基因的失活在结肠癌的发生发展过程中发挥着重要作用[3]。microRNA(miRNA)是一类广泛存在于真核生物中的非编码小RNA分子,能够与靶基因的3′非翻译区特异性结合,负性调控靶基因转录或者降解靶基因mRNA,进而调控下游基因转录,参与细胞增殖、凋亡、迁移、侵袭等过程[4]。目前研究发现miRNA位于染色体脆性区域,能够作为“促癌miRNA”或“抑癌mRNA”参与包括结肠癌在内的多种肿瘤的发生发展过程[5-7]。miR-455-3p作为染色体脆性位点9q32区唯一一个miRNA,在胰腺癌、乳腺癌、宫颈癌、口腔鳞状细胞癌等肿瘤组织中异常表达[8-11]。同时本课题组先前研究证实过表达miR-455-3p能显著抑制结肠癌HCT116细胞增殖,并诱导细胞凋亡[12],但miR-455-3p过表达对结肠癌HCT116细胞的迁移、侵袭是否有影响及相关机制尚未见报道,因此本研究将对此展开探讨。
1 材料和方法 1.1 细胞株和主要试剂仪器HCT116结肠癌细胞购于中国科学院上海细胞库。兔抗人MMP2、MMP9、PI3K、AKT、p-AKT及GAPDH单克隆抗体均购于美国Cell Signal Technology公司;BCA蛋白测定试剂盒购于南京凯基生物技术有限公司;Trizol总RNA提取试剂盒,LipofectamineTM3000脂质体,反转录试剂盒(第一链cDNA合成试剂盒)均购于大连宝生生物技术有限公司;miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC均购于上海吉马生物技术有限公司;DYCZ-40D型转印电泳仪,DYCZ-425D型双垂直电泳仪均购于北京六一仪器厂;168-1000XC型酶标仪购于美国BD公司;GelDoc 2000型凝胶成像系统购于美国伯乐公司;IX51倒置显微镜购于日本OLIMPUS公司。
1.2 细胞转染当HCT116细胞密度达到50%时候,利用LipofectamineTM3000脂质体将miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转染到HCT116细胞中,6 h后细胞换液并继续培养48 h,采用Real-time PCR法检测细胞中miR-455-3p的表达。
1.3 Real-time PCR法检测细胞中miR-455-3p表达根据Trizol试剂盒说明书提取总RNA,当检测出的RNA纯度良好时候,根据逆转录试剂盒将RNA逆转录成cDNA,基于SYBR Green Ⅰ荧光分析的Real time RT-PCR分析,预变性95 ℃,15 min;变性95 ℃,20 s;退火60 ℃,34 s;40个循环。用2-△△CT法分析miR-455-3p的表达量,其中△△CT=(miR-455-3p mimics组目的基因CT值-miR-455-3p mimics组内参基因CT值)-(miR-455-3p NC组目的基因CT值-miR-455-3p NC组内参基因CT值)。
1.4 MTT法检测细胞活力将5×103个HCT116细胞接种到96孔板,培养24 h,按“1.3”进行转染48 h后,加入MTT试剂孵育4 h,后舍去上清液,加入二甲基亚砜,微量振荡器震荡使结晶物溶解,利用酶标仪检测D(570)值,所测OD值即细胞活力。
1.5 划痕实验检测细胞迁移能力将8×103个HCT116细胞接种到6孔板,培养24 h后,于6孔板底部用marker笔划线,再用200 μL枪头对6孔板内的细胞进行划痕,接着用PBS洗去脱落下来的细胞,按“1.3”进行转染48 h后,于倒置显微镜下进行拍照并每孔选取4个视野进行划痕距离的记录。
1.6 Transwell法检测细胞侵袭能力实验前将Matrigel胶均匀的平铺于Transwell小室微膜上,备用。将8×103个HCT116细胞接种到6孔板培养24 h后,按“1.3”进行转染48 h后,消化细胞并制成单悬液,接种到Transwell上室,而下室仅加入DMEM培养基,48 h后,将Transwell小室取出来,用多聚甲醛固定细胞,结晶紫染色,于倒置显微镜下观察,对5个视野中的细胞数目进行计数,并取平均值,即为细胞的侵袭数目。
1.7 Western blot检测细胞中蛋白表达收集细胞并裂解,离心收获上清液获得总蛋白,BCA试剂盒测定蛋白浓度,蛋白煮沸变性,制作浓缩胶及分离胶,上样,进行十二烷基苯磺酸钠凝胶电泳,PVDF膜湿法转膜。2%的BSA室温下孵育1 h,一抗溶液(兔抗人MMP2、MMP9、PI3K、AKT、p-AKT及GAPDH单克隆抗体,稀释度为1 :100) 4 ℃过夜孵育,第2天在室温条件下,于二抗溶液孵育1~2 h,在凝胶成像系统中曝光。最后用“Quantity one”软件进行统计分析
1.8 统计学分析采用SPSS 17.0软件对数据进行统计分析,用x±s表示,采用t检验分析两组之间数据差异性,P<0.05说明组间差异具有显著性。
2 结果 2.1 miR-455-3p mimics转染效果的检测miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转染HCT116细胞48 h后,与miR-455-3p NC组(0.34±0.03)比较,miR-455-3p mimics组中miR-455-3p表达量(1.25±0.12)显著上调(P<0.01)。
2.2 miR-455-3p mimics对HCT116细胞活力的影响miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转染HCT116细胞48 h后,与miR-455-3p NC组(0.68±0.09)比较,miR-455-3p mimics组细胞活力(0.38±0.03)显著降低(P<0.01)。
2.3 miR-455-3p mimics对HCT116细胞迁移及侵袭的影响如图 1、2所示,miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转染HCT116细胞48 h后,与miR-455-3p NC组比较,miR-455-3p mimics组细胞迁移能力及侵袭数目均显著降低(P<0.01)。
2.4 miR-455-3p mimics对HCT116细胞中MMP2及MMP9表达量的影响
如图 3所示,miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转染HCT116细胞48 h后,与miR-455-3p NC组比较,miR-455-3p mimics组MMP2及MMP9表达量显著下调(P<0.01)。
2.5 miR-455-3p mimics对HCT116细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达的影响
如图 4所示,miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC转染HCT116细胞48 h后,与miR-455-3p NC组比较,miR-455-3p mimics组PI3K及p-AKT表达量显著下调(P<0.01)。
3 讨论
众多学者采用miRNA基因表达序列分析、Real-time PCR分析发现了结肠癌组织中有近百种的miRNA异常表达,并能够作为结肠癌早期诊断的有效指标[4-7]。miR-455-3p是位于染色体脆性区域9q32位点上唯一的一个miRNA,具有组织特异性,如miR-455-3p在乳腺癌、宫颈癌、胰腺癌中低表达,在口腔鳞状细胞癌高表达[8-11]。本课题组前期研究发现过表达miR-455-3p能显著上调p27、KIP1、cleaved-Caspase 3表达,下调Bcl-2表达,进而抑制HCT116结肠癌细胞增殖,并诱导细胞凋亡[12]。本研究进一步探讨miR-455-3p对HCT116细胞迁移、侵袭的影响及相关机制。
本研究首先利用脂质体转染miR-455-3p mimics和miR-455-3p NC,Real-time PCR法显示miR-455-3p mimics组中miR-455-3p表达量显著上调,说明转染成功。接着MTT法检测miR-455-3p mimics对HCT116细胞活力的影响,结果与先前研究一致[12],miR-455-3p mimics能显著的降低HCT116细胞活力。细胞划痕实验及Transwell侵袭实验结果表明miR-455-3p mimics能显著降低HCT116细胞迁移及侵袭能力,此结果与miR-455-3p mimics在三阴性乳腺癌细胞MDA-MB-231及MDA-MB-468中的作用一致[9],说明过表达miR-455-3p能显著抑制HCT116细胞迁移及侵袭。MMPs能够通过降解细胞外基质成分,参与伤口愈合、妊娠、癌细胞的侵袭转移等过程。其中明胶酶MMP2不仅能够降解胶原及弹力蛋白,促进癌细胞扩散,还能够诱导血管新生促进癌细胞浸润[13]。另外一种分子量最大的明胶酶MMP9能够降解Ⅳ型和Ⅴ型胶原和弹力蛋白,为癌细胞的扩散转移提供足够的空间[14]。研究显示结肠癌组织中MMP2及MMP9高表达,因此抑制MMP2及MMP9的表达,能一定程度上的抑制结肠癌细胞的侵袭转移[15]。本研究结果表明miR-455-3p mimics能显著的下调MMP2及MMP9表达,进而抑制HCT116细胞的迁移与侵袭。
PI3K/AKT信号通路在肿瘤细胞的增殖、凋亡、迁移、侵袭及血管生成等过程发挥着重要作用。PI3K主要由两个亚基(p110和p85)组成,在癌细胞受到生长因子等刺激后,受体酪氨酸激酶被活化后与p85亚基结合,进而改变PI3K构象并激活p110亚基,活化后的p110能够磷酸化下游底物二磷酸磷脂酰肌醇(PIP2)的3’羟基,使PIP2转化为PIP3,进而使AKT结构发生变化并磷酸化,最后转入细胞核,诱导靶基因(Bcl-2、MMP2、CyclinD1等)转录[16-17]。PI3K/AKT信号通路在众多肿瘤组织中高度激活,并成为某些抗癌药物的作用靶点[16, 18-19]。同时有研究通过targetscan、microcosm等生物信息学软件发现PI3KR1可能是miR-455-3p的作用靶基因之一[11]。本研究进一步采用Western blot检测miR-455-3p mimics对HCT116细胞中PI3K/AKT信号通路相关蛋白表达量的影响,结果表明miR-455-3p mimics能显著下调PI3K及p-AKT表达。
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