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Foxg1抑制肝癌细胞血管形成及其机制
章凡1, 张献全1, 钱程2     
1. 400010 重庆,重庆医科大学附属第二医院肿瘤科;
2. 400038 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院生物治疗中心
[摘要] 目的 通过干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1,探讨Foxg1对人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)血管生成能力的影响及其机制。方法 实验分为Hep3B干扰组、Hep3B对照组、Huh7过表达组和Huh7对照组,提取各组细胞条件培养基(conditional medium,CM);通过Transwell实验、管腔形成实验观察各组CM对HUVEC的迁移及管腔形成的影响;采用实时荧光定量PCR(RT-PCR)及Western blot检测血管内皮生长因子A(vascular endothelial growth factor A,VEGFA)在各组肝癌细胞中的mRNA及蛋白水平,酶联免疫吸附实验(ELISA)检测各组CM内VEGFA浓度;采用Western blot检测4组肝癌细胞AKT1、p-AKT1的蛋白水平。结果 Hep3B干扰组较Hep3B对照组CM的作用下,HUVEC细胞的迁移数显著增多(P<0.01),Huh7过表达组较Huh7对照组CM的作用下,HUVEC细胞迁移数显著减少(P<0.01);Hep3B干扰组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数多于Hep3B对照组CM(P<0.01),而Huh7过表达组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数少于Huh7对照组CM(P<0.01);Hep3B干扰组较Hep3B对照组VEGFA水平上调,Huh7过表达组较Huh7对照组VEGFA水平下调;Hep3B干扰组CM较Hep3B对照组CM的VEGFA水平上调,Huh7过表达组CM较Huh7对照组CM的VEGFA水平下调(P<0.01);Hep3B干扰组较Hep3B对照组AKT1磷酸化水平升高,Huh7过表达组较Huh7对照组AKT1磷酸化水平降低。结论 Foxg1抑制肝癌血管生成的过程可能是通过抑制PI3K/Akt通路的激活下调VEGFA的表达来实现的。
[关键词] 叉头基因Foxg1     血管生成     肝细胞癌     人脐静脉血管内皮细胞     血管内皮生长因子A     蛋白激酶B    
Foxg1 inhibits angiogenesis in hepatocellular carcinoma in vitro
ZHANG Fan1 , ZHANG Xianquan1 , QIAN Cheng2     
1. Department of Oncology, the Second Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400010;
2. Biotherapy Center, First Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400038, China
Supported by the Key Program of National Natural Science Foundation of China (81330048)
Corresponding author: ZHANG Xianquan, E-mail: xqzhng@hotmali.com
QIAN Cheng, E-mail: cqian3184@163.com
[Abstract] Objective To investigate the effect of forkhead box G1 (Foxg1) on the angiogenesis of human umbilical vein endothelial cells(HUVECs)by interfering and overexpressing Foxg1 in hepatoma cells, and explore its underlying mechanisms. Methods The hepatocellular carcinoma cell lines Hep3B and Huh7 were used in this experiment, and after corresponding transfection, the cells were divided into 4 groups, that is, Hep3B shFoxg1 group (Foxg1 silence), Hep3B control group, Huh7 expFog1 group (Foxg1 overexpression) and Huh7 control group. After the HUVECs were treated with the conditioned mediums (CM) from the above 4 groups of cells, transwell assay and tube formation assay were used to observe the effect of CM on migration and tube formation of HUVECs. The mRNA and protein levels of vascular endothelial growth factor A (VEGFA) in each group were measured by real-time fluorescence quantitative PCR (RT-PCR) and Western blotting. The concentration of VEGFA in the CM was detected by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA). Finally, Western blotting was used to detect the protein levels of AKT1 and p-AKT1 in the 4 groups of cells. Results The number of cell migration was significantly larger in the HUVECs exposure to CM from the Hep3B shFoxg1 group than that from Hep3B control group (P<0.01), while the number was smaller in the HUVECs treated with Huh7 expFoxg1 group CM than with Huh7 control group CM(P<0.01). The CM from the Hep3B shFoxg1 group promoted tube formation in HUVECs when compared with the CM from the Hep3B control group (P<0.01), and the CM of the Huh7 expFoxg1 group induced less formation than the CM from the Huh7 control group(P<0.01). RT-PCR and Western blotting showed that the VEGFA level was higher in the Hep3B shFoxg1 group than the Hep3B control group (P<0.01), and that in the Huh7 expFoxg1 group was down-regulated than the Huh7 control group (P<0.01).Western blot analysis showed that the Hep3B shFoxg1 group had enhanced phosphorylation of AKT1 than the Hep3B control group, while the level was opposite in the Huh7 expFoxg1 group than the Huh7 control group. Conclusion Foxg1 inhibits the angiogenesis of hepatocellular carcinoma, which may be through suppressing the PI3K/AKT pathway and down-regulating the expression of VEGFA.
[Key words] forkhead box G1     angiogenesis     hepatocellular carcinoma     human umbilical vein endothelial cells     vascular endothelial growth factor A     protein kinase B    

肝细胞癌(hepatocellular carcinoma,HCC)是一种高度血管性肿瘤,而血管生成在肝细胞癌的进展中起着重要的作用。血管生成是一个受多种生长因子调控的过程,包括血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板衍生生长因子(platelet derived growth factor,PDGF)和成纤维细胞生长因子(basic fibroblast growth factor,FGF)[1]。肝细胞癌的增殖及肿瘤浸润都需要新生血管的维持[2],发掘肝细胞癌血管生成的靶点及机制至关重要。Foxg1基因原名脑因子1基因,位于第14号染色体q12区域,全长3 206 bp,含1个外显子,无内含子[3],属于叉头框(forkhead box,FOX)转录因子基因家族成员。该基因有一个高度保守的螺旋翅膀状DNA结合域,可以通过结合特定的DNA序列而作为转录抑制因子[4]。近年研究发现:Foxg1对多种肿瘤的生长具有影响,如卵巢癌[5]、宫颈癌[6]、肝母细胞瘤[7]、人恶性神经胶质瘤[8]等。目前,Foxg1对肝癌血管增生有何影响尚不清楚。因此,本研究以人肝癌细胞株Hep3B、Huh7为研究对象,观察Foxg1对人肝癌细胞血管形成方面的影响,并探讨其可能的机制,为Foxg1的进一步研究和临床应用提供实验数据。

1 材料与方法 1.1 主要材料

人肝癌细胞株(Hep3B、Huh7、SMMC-7721、T1115、T1224、HepG2、MHCC-97H)及人脐静脉血管内皮细胞(human umbilical vein endothelial cells,HUVEC)由陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院生物治疗中心冻存,0.8 μm Transwell侵袭小室(美国BD公司),6孔、24孔细胞培养板(美国Corning公司)。主要试剂:DMEM培养基(日本TaKaRa公司),胎牛血清(fetal bovine serum,FBS,日本TaKaRa公司),0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司),DMSO(美国BIOSHARP公司),Foxg1抗体、VEGFA抗体、GAPDH抗体、AKT1抗体、p-AKT1(Ser473)抗体和山羊抗兔二抗均购自Merk Millipore公司,慢病毒shFoxg1及质粒expFoxg1由陆军军医大学(第三军医大学)第一附属医院生物治疗中心提供,转染试剂盒(Promega公司),组织/细胞总RNA提取试剂盒和RT-PCR试剂盒(TaKaRa公司),VEGF ELISA试剂盒(MERK公司),Matrigel基质胶(美国BD公司),RIPA蛋白提取试剂盒、BCA蛋白浓度测定试剂盒等Western相关试剂(上海碧云天生物工程公司)。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

将上述细胞株分别复苏于10 cm细胞培养皿中,用预先配好的完全培养基[DMEM+10%FBS+1%双抗(青、链霉素均为100 μg/mL)]于37 ℃、5%CO2的细胞培养箱中培养。转染慢病毒shFoxg1及质粒expFoxg1的步骤按照转染试剂盒说明书进行,再用嘌呤霉素(4~6 μg/mL)筛选稳定细胞株。

1.2.2 条件培养基(conditional medium,CM)的提取

将筛选后的各组细胞种植在6孔板中,待细胞长满80%视野时,每孔内加入3 mL 0.5%DMEM(含0.5%FBS)培养,48 h后经0.22 μm滤纸过滤收集CM,-20℃保存。

1.2.3 Western blot检测

采用总蛋白抽提试剂盒提取细胞蛋白,采用BCA试剂盒测定蛋白含量。并以5 μg的上样量进行凝胶电泳后转印至NC膜上,5%的脱脂牛奶封闭90 min,一抗孵育4 ℃过夜。Foxg1、VEGFA、AKT1、p-AKT1、GAPDH的抗体稀释浓度分别为1 :750、1 :1 000、1 :1 500、1 :1 500、1 :1 000。PBST清洗一抗后孵育二抗2 h,抗兔二抗稀释浓度为1 :4 000,暗室显影拍照。实验重复3次。

1.2.4 Transwell实验

在24孔板中加入各组CM 750 μL,每孔放入0.8 μm Transwell侵袭小室,在小室内加入500 μL无血清DMEM,每组设置3个复孔。消化离心HUVEC细胞后,用无血清DMEM稀释成5×104/100 μL,混悬后按100 μL/孔加入到Transwell侵袭小室,37 ℃、5%CO2培养,24 h后经甲醛固定结晶紫染色,电镜观察,于×40视野下选取典型区域,×200视野下拍照并计数。实验重复3次。

1.2.5 HUVEC管腔形成实验

提前1 d将-20 ℃保存的Matrigel基质胶放于-4 ℃解冻,用无血清DMEM稀释(稀释比例1 :1),在24孔板中加入300 μL稀释好的Matrigel基质胶,放入37 ℃、5%CO2培养箱中凝固待用。消化离心预先用各组CM培养12 h的HUVEC,然后用各自CM重悬至1.2×105/mL,按1 mL/孔加入到铺有Matrigel基质胶的24孔板中,每组3孔,于37 ℃、5%CO2培养箱中培养,隔2 h观察1次,当管腔形成时立即于电镜下拍照(一般为6~8 h,≥3个细胞/分支)。实验重复3次。

1.2.6 实时荧光定量PCR

采用组织/细胞总RNA提取试剂盒提取各组细胞的总RNA,按两步法RT-PCR试剂盒说明书进行RT-PCR实验操作。引物设计及合成由金斯瑞生物科技公司完成。VEGFA引物序列如下:VEGFA上游5′-GCTGTCTTGGGTGCATT GG-3′,下游5′-GCAGCCTGGGACCACTTG-3′,片段大小69 bp。

1.2.7 酶联免疫吸附实验

采用VEGF ELISA试剂盒检测各组CM中的VEGFA浓度,操作按照ELISA试剂盒说明书进行。实验重复3次。

1.3 统计学分析

采用SPSS 21.0统计软件,实验数据以x±s表示,各组间比较采用单因素方差分析,检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 Foxg1在人肝癌细胞株中的表达及其CM对HUVEC迁移能力的影响

Western blot检测Foxg1在7种肝癌细胞株中的表达(图 1),结果显示:Foxg1在Hep3B中的表达最高(0.504±0.064),在Huh7中的表达最低(0.291±0.084)。Transwell实验观察各细胞株CM对HUVEC迁移能力的影响(图 2),结果显示:HUVEC在Huh7(Foxg1低表达) CM的作用下,细胞迁移数(217.333± 15.631)显著多于其他组,而Hep3B (Foxg1高表达)CM的作用下,HUVEC细胞的迁移数目(64.667±7.024)最少。表明HUVEC的迁移能力与Foxg1的蛋白水平成反比。

1~7:分别为肝癌细胞株HepG2、T1224、Huh7、T1115、Hep3B、SMMC-7721、MHCC-97H 图 1 Western blot检测人肝癌细胞株中Foxg1的蛋白表达

A~G:分别为肝癌细胞株HepG2、T1224、Huh7、T1115、Hep3B、SMMC-7721、MHCC-97H 图 2 Transwell实验观察各细胞株CM对HUVEC迁移能力的影响

2.2 各组HUVEC细胞迁移能力的变化

Western blot检测结果(图 3)显示:与对照组比较,Hep3B干扰组Foxg1低表达[(0.261±0.021) vs (0.551±0.047),P<0.01],Huh7过表达组Foxg1高表达[(0.836±0.125) vs (0.453±0.094),P<0.05)。Transwell实验观察HUVEC在4组CM作用下的迁移能力(图 4),结果显示:Hep3B干扰组CM的作用下,HUVEC细胞的迁移数显著多于Hep3B对照组CM [(181.667±12.014) vs (72.333±8.021),P<0.01],Huh7过表达组CM的作用下,HUVEC细胞迁移数少于Huh7对照组CM[(91.333±7.024) vs (215.667±13.577),P<0.01],提示Foxg1可能抑制肝癌细胞的迁移。

1:Hep3B对照组;2:Hep3B干扰组;3:Huh7对照组;4:Huh7过表达组 图 3 Western blot检测干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1对HUVEC细胞迁移能力的影响

A:Hep3B对照组;B:Hep3B干扰组;C:Huh7对照组;D:Huh7过表达组 图 4 Transwell实验观察干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1对HUVEC细胞迁移能力的影响

2.3 各组HUVEC细胞管腔形成能力的变化

管腔形成实验观察4组CM对HUVEC细胞管腔形成能力的影响(图 5),结果显示:Hep3B干扰组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数多于Hep3B对照组CM[(26.000±2.646) vs (10.000±2.000),P<0.05),而Huh7过表达组CM的作用下,HUVEC细胞管腔形成数少于Huh7对照组CM[(7.333±1.528) vs (19.333±3.512),P<0.01],提示Foxg1可能抑制肝癌的血管生成。

A:Hep3B对照组;B:Hep3B干扰组;C:Huh7对照组;D:Huh7过表达组 图 5 干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1对HUVEC细胞管腔形成能力的影响

2.4 各组肝癌细胞VEGFA表达及AKT1磷酸化水平

Western blot检测结果(图 6A)显示:Hep3B干扰组较Hep3B对照组VEGFA的蛋白水平显著升高[(1.007±0.041) vs (0.622±0.028),P<0.01],而AKT1的磷酸化水平显著升高[(1.031±0.040) vs (0.322± 0.045),P<0.01];Huh7过表达组较Huh7对照组VEGFA的蛋白水平显著降低[(0.296±0.029) vs (0.667±0.095),P<0.05],而AKT1的磷酸化水平显著降低[(0.291±0.008) vs (0.501±0.053),P<0.05]。ELISA检测4组CM内VEGFA的浓度,结果显示:Hep3B干扰组较Hep3B对照组CM中的VEGFA的蛋白水平显著升高[(96.092±4.911) vs (27.717± 3.193),P<0.01],Huh7过表达组较Huh7对照组CM中的VEGFA的蛋白水平显著降低[(18.889±1.165) vs (61.271±3.114),P<0.01]。RT-PCR检测4组肝癌细胞VEGFA的mRNA水平(图 6B),结果显示:Hep3B干扰组较Hep3B对照组VEGFA的mRNA水平显著升高;Huh7过表达组较Huh7对照组VEGFA的mRNA水平显著降低(P<0.01)。这些结果提示:Foxg1可能通过下调VEGFA抑制PI3K/AKT通路的激活。

1:Hep3B对照组;2:Hep3B干扰组;3:Huh7对照组;4:Huh7过表达组;a:P<0.01, 与Hep3B对照组比较;b:P<0.01, 与Huh7对照组比较
A: Western blot检测结果;B:RT-RCT检测Hep3B细胞的VEGFA mRNA水平;C:RT-PCR检测Huh7细胞中VEGFA mRNA水平
图 6 Foxg1对VEGFA的表达及AKT磷酸化的影响

3 讨论

肿瘤和正常的组织一样都需要营养物和氧气的供给,不同的是在肿瘤进程中,“血管生成开关”几乎总是处于活化开启状态,导致正常稳定的脉管系统不断分支出新的血管以维持不断扩张的肿瘤生长[9]。血管可以为肿瘤提供营养和氧气[10],因而在肿瘤的发生、转移过程中,血管生成至关重要。Foxg1作为叉头框基因FOX家族重要成员之一,在编码转录因子特异性表达于脑组织上,在端脑发育、神经元分化、神经发生及轴突的外生性生长等过程起着重要的调控作用[4]。CHAN等[5]研究报道了过表达Foxg1抑制TGF-β对卵巢癌的抗增殖作用;而ZENG等[6]研究表明:MIR-200b通过抑制Foxg1促进宫颈癌的增殖和转移;另外,有研究发现Foxg1在肝母细胞瘤中过表达[7];更有研究发现高表达的Foxg1可促进神经胶质瘤细胞的增殖和存活[8]。但是,Foxg1对肝癌血管生成的作用尚不明确。本研究从体外实验观察了Foxg1对HUVEC细胞的迁移及管腔形成能力的影响,发现干扰Foxg1后,肝癌细胞CM促进HUVEC迁移能力及管腔形成能力显著增强;而过表达Foxg1后,肝癌细胞CM促进HUVEC迁移能力及管腔形成能力显著减弱。这提示Foxg1可能抑制肝癌血管生成的能力。

肝癌是一种主要由肝动脉供血的多血管恶性肿瘤,在显微镜下,肝癌组织可见很多血管病变、动脉发生及毛细血管化[11]。目前的抗血管生成疗法的主要靶点都在内皮细胞上面,是因为内皮细胞几乎没有多少基因突变。内皮细胞的遗传稳定性使得它们不容易获得耐药性,新的抗血管生成抑制剂正成为新的治疗肿瘤的药物及策略[12]。VEGFA是内皮细胞生长因子中最重要的因子之一[13]。研究表明:VEGFA在人类大多数恶性肿瘤中都高表达,并参与了肿瘤血管生成,进而促进肿瘤的增殖、侵袭、浸润和转移,并且VEGFA在原发性肝癌中高表达,促进肝癌新生血管的形成,进而加速肿瘤的增殖和转移[14]。VEGFA促进肝癌血管生成的主要机制是:VEGFA可以和其特异性受体VEGFR结合,激活下游的多条通路,促进肿瘤血管通透性增加及肿瘤细胞的迁移[15-16]。AKT1是蛋白激酶B(PKB)3种亚型中的一种,是PI3K下游的信号蛋白[17]。PKB由PI3K通过影响蛋白激酶(PDK)和磷酸酶(PTEN)的表达水平进行调节的。PI3K活化后的产物磷酸肌醇二磷酸(PIP2)和三磷酸(PIP3)作为第二信使与细胞内的AKT蛋白N端结合,使AKT从细胞质转移到细胞膜上并发生磷酸化使其活化。活化的AKT直接或间接地结合其底物帕霉素靶体蛋白(mTOR)发生磷酸化,同时PI3K/Akt也能够通过激活激酶p70S6K来调控VEGFA的表达,从而调控肿瘤血管的生成[18]。本研究发现在人肝癌细胞株Hep3B中干扰Foxg1可以上调VEGFA的表达水平,并同时上调AKT1的磷酸化水平;而在人肝癌细胞株Huh7中过表达Foxg1可以下调VEGFA的表达水平,并同时下调AKT1的磷酸化水平。这些现象都说明Foxg1可能具有抑制肝癌血管生成的能力。目前研究表明Foxg1对于不同肿瘤的作用不一致,因此,其是否抑制其他肿瘤血管生成还有待进一步的研究。本研究结果提示:Foxg1抑制肝癌血管生成的过程可能是通过抑制PI3K/Akt通路的激活下调VEGFA的表达来实现的。

综上所述,本研究通过干扰和过表达肝癌细胞中的Foxg1后,发现其对HUVEC细胞血管增生能力的影响,并从调控血管生成因子VEGFA的角度探讨了其可能的分子机制。发现Foxg1抑制肝癌血管生成的过程可能是通过抑制PI3K/Akt通路的激活下调VEGFA的表达来实现的,这可能是肝癌抗血管增生治疗的潜在靶点。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711040
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

章凡, 张献全, 钱程.
ZHANG Fan, ZHANG Xianquan, QIAN Cheng.
Foxg1抑制肝癌细胞血管形成及其机制
Foxg1 inhibits angiogenesis in hepatocellular carcinoma in vitro
第三军医大学学报, 2018, 40(6): 494-499
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(6): 494-499
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711040

文章历史

收稿: 2017-11-07
修回: 2017-12-05

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