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下调Notch3表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响
彭动斌, 唐雪峰, 高自然, 吕杨帆, 郭乔楠     
400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院病理科
[摘要] 目的 观察Notch3在骨肉瘤细胞中的表达及下调Notch3表达后对骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭迁移的影响,探讨Notch3在骨肉瘤细胞生物学功能中的作用。方法 体外培养人骨肉瘤细胞MG63、Saos2、U2OS,采用Real-time PCR和Western blot检测3种骨肉瘤细胞系中Notch3的mRNA和蛋白表达水平;利用siRNA敲低Notch3在骨肉瘤U2OS细胞中的表达,并将细胞分为siNotch3组和阴性对照组,检测下调Notch3的表达后骨肉瘤细胞增殖、凋亡及侵袭、迁移等生物学特性的变化。结果 Notch3在骨肉瘤细胞MG63、Saos2、U2OS中均呈阳性表达,并且在低级别骨肉瘤细胞系MG63中的表达明显低于高级别细胞系Saos2和U2OS(P < 0.05),下调Notch3的U2OS细胞(siNotch3组)增殖、侵袭、迁移能力较阴性对照组减弱,凋亡率增加,差异均有统计学意义(P < 0.05)。结论 在骨肉瘤细胞U2OS中下调Notch3的表达可明显抑制细胞的增殖、侵袭、迁移能力,促进凋亡。Notch3可能是Notch通路在骨肉瘤中的关键受体之一,并参与了骨肉瘤的发生、发展。
[关键词] Notch3     骨肉瘤     增殖     凋亡     侵袭     迁移    
Effect of down-regulating Notch3 expression on biological characteristics of osteosarcoma cells
PENG Dongbin , TANG Xuefeng , GAO Ziran , LYU Yangfan , GUO Qiaonan     
Department of Pathology, Seconcd Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China(81672653)and the Key Project of Basic Science and Frontier Technology Research of Chongqing (CSTC2015jcyjBX0067)
Corresponding author: GUO Qiaonan, E-mail:qiaonan85@263.net
[Abstract] Objective To explore the expression of Notch3 in human of osteosarcoma cells and determine the effect of its down-regulation on the proliferation, apoptosis, invasion and migration, and to investigate its role in the biological function of the cells. Methods Real-time PCR and Western blotting were used to examine the expression of Notch3 at mRNA and protein levels in osteosarcoma cell lines. siRNA was used to knockdown the expression of Notch3 in U2OS cells. Then the proliferation, apoptosis and metastasis of the cells after transfection were detected for the effects of Notch3 down-regulation. Results Notch3 was highly expressed in human osteosarcoma cell lines MG63, Saos2 and U2OS, but its level was significantly lower in MG63 cells derived from low-grade osteosarcoma than those in Saos2 and U2OS cells derived from high-grade osteosarcoma (P < 0.05). When compared with untreated cells (Control), down-regulation of Notch3 in U2OS cells markedly repressed cell proliferation, decreased invasion and migration (P < 0.05). but enhanced apoptosis (P < 0.05). Conclusion Down-regulation of Notch3 reduces the proliferation, invasion, migration, but increases the apoptosis in osteosarcoma cells. Notch3 may be a key receptor of Notch pathway involving in the occurrence and development of osteosarcoma.
[Key words] Notch3     osteosarcoma     proliferation     apoptosis     invasion     migration    

骨肉瘤是常见的骨原发恶性肿瘤,在儿童和青少年癌症相关死因中位居第二[1-2]。大部分骨肉瘤发生于长骨,如股骨远端和胫骨近端,具有高度的侵袭性,转移率大约20%,最常见的转移部位是肺[3]。目前,对骨肉瘤的治疗主要是外科手术联合化疗,但由于化疗抵抗和早期转移导致患者预后一直较差。为了改善患者的预后,迫切需要深入了解骨肉瘤的病理和发生、发展机制。Notch通路是一个进化上高度保守的信号通路,研究表明Notch通路在肿瘤细胞增殖、分化、凋亡调控中发挥重要作用[4]。但国内外较少研究Notch通路主要受体之一的Notch3与骨肉瘤的关系。我们在前期研究中发现Notch3在骨肉瘤组织标本中存在高表达,但其作用机制尚不清楚。本研究拟通过观察Notch3在骨肉瘤细胞的表达情况和下调Notch3表达对骨肉瘤细胞U2OS增殖、凋亡及侵袭、迁移等的影响,探讨Notch3在骨肉瘤细胞生物学功能中发挥的作用。

1 材料与方法 1.1 细胞及主要试剂

人骨肉瘤细胞株MG63、Saos2、U2OS来自美国菌种保藏中心(ATCC),由本实验室传代保种。DMEM/H培养基、胰酶购自美国HyClone公司,10%胎牛血清购自以色列BI公司,RNAi plus、PrimeScript RT reagent Kit、SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ购自日本TaKaRa公司,PVDF膜、蛋白酶抑制剂购自美国Roche公司,SDS-PAGE凝胶配制试剂盒、蛋白marker、BCA蛋白浓度测定试剂盒、ECL Plus显色液、CCK-8试剂购自上海碧云天公司。引物由上海Invitrogen公司设计合成。Notch3兔抗人多克隆抗体购自英国Abcam公司,GAPDH兔抗人单克隆抗体、HRP标记羊抗兔二抗购自北京博奥龙公司。

1.2 细胞培养

人骨肉瘤细胞系MG63、Saos2、U2OS采用含10%胎牛血清的DMEM/H培养基,置于37 ℃、5%CO2、95%湿度的恒温培养箱中培养,隔日换液,3~5 d传代。

1.3 Real-time PCR检测骨肉瘤细胞系Notch3的mRNA含量

按RNAi plus说明书提取骨肉瘤细胞RNA,用核酸蛋白定量仪测定RNA浓度及D(260)/D(280),若比值处于1.8~2.0,表明RNA浓度好,可继续下一步实验。按照Prime Script RT reagent Kit说明书,反转录成cDNA。根据SYBR Premix Ex TaqTM Ⅱ说明书,取5 μL SYBR Premix Ex TaqTMⅡ、0.8 μL cDNA、0.5 μL上游引物、0.5 μL下游引物、3.2 μL dH2O,配制成10 μL Real-time PCR反应体系。GAPDH引物上游:5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′,下游:5′-GTA-GAGGCAGGGATGATGTTCT-3′;Notch3引物上游:5′-CGTGGCTTCTTTCTACTGTGC-3′,下游:5′-CGTTCACCGGATTTGTGTCAC-3′,反应条件为:95 ℃ 30 s,95 ℃ 5 s,60 ℃ 1 min,40个循环,StepOnePlus Real-time PCR System上机检测。

1.4 Western blot检测骨肉瘤细胞Notch3蛋白的表达

收集骨肉瘤细胞,加入适量RIPA裂解液,并按100:1加入蛋白酶抑制剂,枪头吹打5 min,冰上放置裂解30 min,然后4 ℃、14 000 r/min离心10 min,提取总蛋白。根据BCA蛋白浓度测定试剂盒说明测定蛋白浓度。加入适量蛋白上样缓冲液(5×),混匀后金属浴加热至100 ℃,10 min变性。配置凝胶电泳,蛋白上样量为50 μg/孔。恒压电泳80 V、30 min,之后120 V、90 min。PVDF转膜150 mA、90 min。转膜结束后,将膜放入含5%脱脂奶粉的PBST中封闭1 h。剪膜后孵育一抗,GAPDH兔抗人单克隆抗体(1:1 000)、Notch3兔抗人多克隆抗体(1:1 000),4 ℃过夜。PBST洗膜15 min×3次,然后将膜放入1:5 000羊抗兔二抗中,摇床缓慢摇动室温孵育1 h。PBST洗膜15 min×3次,ECL Plus显色,Bio-Rad凝胶成像仪显影。

1.5 siRNA干扰骨肉瘤U2OS细胞Notch3基因的表达

根据广州锐博生物设计合成的siRNA干扰系列:5′-CTGTCTTGCTGCTGGTCAT-3′及产品使用说明书,将U2OS细胞按3×105/孔接种于6孔板中,培养过夜,使转染时的密度为30%~50%。将5 μL siRNA-Notch3(siNotch3)/阴性对照(Control)、5 μL Lipofectamine 2000转染试剂(Invitrogen,上海)、490 μL Opti-MEM混匀,室温孵育10 min。将上述混合液加入0.5 mL无血清无双抗培养基中,替换孔内原有培养基,充分混匀。置于37 ℃、5%CO2、95%湿度培养箱中培养6 h。将孔内培养基换为含10%胎牛血清的培养基,转染48 h后收集细胞用于检测Notch3的mRNA和蛋白表达水平或进行其他实验。

1.6 CCK-8检测细胞增殖

将转染siNotch3和Control的细胞消化,制成单细胞悬液。按2 000个/孔接种4块96孔板,每组设4个复孔,放入培养箱中培养过夜。检测时配制含10%CCK-8试剂的培养基,以换液的形式加入各孔(100 μL/孔),同时设置空白对照。37 ℃、孵育1 h,酶标仪测定450 nm波长处光密度值[D(450)],依次测1、2、3、4 d。

1.7 Transwell侵袭实验

在冰上吸取适量matrigel至EP管,加入2倍体积DMEM培养基,吹打混匀。在8 μm孔径的Transwell小室内各加入20 μL matrigel混合液,37 ℃孵育30 min至凝固。把小室置于24孔板内,将转染48 h后的siNotch3和Control细胞消化离心,用无血清DMEM培养基重悬后按100 μL、5×104个/孔接种于小室内,下室加入600 μL含15%胎牛血清的DMEM培养基,放入培养箱培养24 h,取出小室,PBS洗涤后用4%多聚甲醛固定细胞20 min,再用PBS洗2~3遍,使用结晶紫染液对细胞染色20 min,用棉签轻轻擦拭掉小室上层未发生迁移的细胞,PBS或超纯水洗2~3遍后,适当风干;显微镜下随机选取8个视野观察细胞并采图计数。

1.8 划痕实验

将转染48 h后的siNotch3和Control组细胞培养基弃去,将6孔板倒置,用记号笔在其背后平行画线,用作后续照相采图时的标记;用10 μL移液器枪头画线,线尽量笔直并垂直于之前记号笔所画的线;用PBS冲洗3~4次,洗去漂浮的细胞后加入适量无血清培养基,置于显微镜下采图,放入培养箱培养24 h后观察划痕愈合距离拍照。

1.9 流式细胞术检测凋亡率

收集转染48 h后的siNotch3和Control细胞,PBS重悬并调整细胞数为约1×106个/mL,转移至1.5 mL无菌EP管,4 ℃、1 000 r/min离心5 min,弃上清。用200 μL结合缓冲液重悬细胞,分别加入Annexin V-APC染色液3 μL和PI(eBioscience,上海)3 μL,混匀后避光孵育15 min,上流式细胞仪检测。

1.10 统计学分析

采用SPSS 22.0统计软件,计量资料以x±s表示,进行独立样本t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 骨肉瘤细胞系MG63、Saos2、U2OS中Notch3的mRNA含量和蛋白表达水平

Notch3在MG63、Saos2、U2OS中均呈阳性表达,并且Real-time PCR检测发现在低级别骨肉瘤细胞系MG63中的表达要明显低于高级别细胞系Saos2、U2OS (P < 0.05),Western blot检测蛋白水平同Real-time PCR结果一致(图 1)。

A:RT-PCR检测结果a:P < 0.05,与MG63细胞比较;B:Western blot检测结果 图 1 3种骨肉瘤细胞系Notch3 mRNA及蛋白表达

2.2 下调U2OS细胞中Notch3基因的表达及鉴定

Real-time PCR检测结果显示,siNotch3与Control组相比,siNotch3组的Notch3 mRNA水平显著下降(P < 0.05),Western blot检测发现其在蛋白水平较Control组也明显下调(图 2),说明siNotch3干扰效果明显,siNotch3 RNA干扰系列可用作下游实验。

A:RT-PCR检测结果a: P < 0.05,与Control组比较;B:Western blot检测结果 图 2 Control、siNotch3组细胞中Notch3 mRNA及蛋白表达

2.3 下调Notch3表达对骨肉瘤细胞U2OS增殖能力的影响

从检测第2天开始,siNotch3组细胞与Control组相比增殖能力明显下降(P < 0.05,图 3),说明下调Notch3表达后,骨肉瘤U2OS细胞增殖能力下降。

a: P < 0.05,与Control组比较 图 3 CCK-8检测Control和siNotch3组细胞的增殖能力

2.4 下调Notch3表达对骨肉瘤细胞U2OS侵袭力的影响

Transwell侵袭实验检测发现转染48 h后siNotch3组细胞侵袭数(29.63±2.67)明显低于Control组[(78.25±10.57),P < 0.05,图 4]。这表明下调Notch3表达后,骨肉瘤细胞U2OS的侵袭能力下降。

A: Control组;B: siNotch3组 图 4 倒置显微镜观察下调Notch3表达对U2OS细胞侵袭能力的影响(结晶紫)

2.5 下调Notch3表达对骨肉瘤细胞U2OS迁移能力的影响

转染48 h后划痕实验结果显示,siNotch3组细胞24 h迁移距离为(0.87±0.07),明显小于Control组[(1.86±0.05),P < 0.05,图 5]。这说明降低Notch3的表达后,骨肉瘤细胞U2OS的迁移能力减弱。

图 5 下调Notch3表达对骨肉瘤U2OS细胞迁移能力的影响

2.6 下调Notch3表达对骨肉瘤细胞U2OS凋亡率的影响

与Control组相比,siNotch3组细胞的早期凋亡率由0.73%上升至3.59%,而晚期凋亡率由1.15%上升至3.41%,总凋亡率由(1.86±0.38)%增加到(8.09± 1.19)%,差异均有统计学意义(P < 0.05,图 6)。这说明敲低Notch3后,骨肉瘤细胞U2OS凋亡率显著增加。

A:Control组;B:siNotch3组 图 6 流式细胞仪检测下调Notch3表达对U2OS细胞凋亡率的影响

3 讨论

骨肉瘤是好发于儿童和青少年的骨原发恶性肿瘤,具有较高的复发和转移率。随着多学科治疗和新辅助化疗的应用,患者的5年生存率有了明显提高[5],但由于化疗抵抗和早期肺转移,导致患者预后一直不理想[6]。因此,亟需进一步探索骨肉瘤的发生、发展机制,开发更为有效的靶向治疗药物。

Notch信号通路在胚胎发育和细胞命运决定过程中起着至关重要的作用。目前已发现4种Notch受体(Notch1-4)和5种配体(DLL1、DLL3、DLL4和Jagged1、Jagged2)。当Notch受体和相应配体结合后,经过酶切释放胞内活性段(NICD),NICD转移入核后,进一步激活下游效应分子hes1、hey1等转录而发挥作用[7]。近年来,多项研究表明Notch通路的异常在胃癌、乳腺癌、肝癌、肺癌等多种肿瘤的发生、发展中发挥重要作用[8-11]。但由于Notch受体和配体类型较多,在不同肿瘤中,Notch可能发挥促癌或抑癌的作用;另外,Notch通路与其他信号通路的相互作用机制也需要深入探讨。

尽管在骨肉瘤中也存在Notch通路关键分子的上调[12-13],但基本集中在Notch1[14-15]。Notch3作为Notch家族的重要成员,近年来有研究表明其与肿瘤细胞的增殖、凋亡、侵袭、转移、化疗抵抗等密切相关。ZHANG等[16]研究发现Notch3在尿路上皮癌组织中高表达,Notch3高表达能促进尿路上皮癌的生长和化疗抵抗。在胰腺癌中,抑制Notch3表达能够抑制PI3K/Akt激活进而增强癌细胞对吉西他滨的敏感性[17]。Notch3和pS6过表达与卵巢上皮癌的进展和不良预后相关[18]。而目前Notch3在骨肉瘤中的功能和作用机制尚不清楚。

本研究通过Real-time PCR和Western blot检测了Notch3在骨肉瘤细胞系中的表达,发现Notch3在MG63、Saos2、U2OS等骨肉瘤细胞系中均呈阳性表达,并且在不同级别骨肉瘤细胞中Notch3的表达水平有差异,在恶性程度高的骨肉瘤细胞中Notch3表达更高,提示Notch3可能在骨肉瘤发生、发展中发挥重要作用。为了进一步研究Notch3对骨肉瘤细胞生物学特性的影响,我们选择了其中高表达Notch3的U2OS细胞做研究模型,发现通过siRNA下调Notch3表达后,明显抑制了骨肉瘤细胞U2OS的增殖、侵袭、迁移能力,而与Control组相比凋亡率显著增加。这为下一步研究Notch3对骨肉瘤细胞增殖、凋亡、侵袭、转移等影响的分子机制,以及与Src、PI3K/Akt、ERK等其他通路的相互作用关系奠定了基础。

综上所述,Notch3可能是Notch通路在骨肉瘤中的关键受体,并作为促癌基因参与了骨肉瘤的发生与演进。这为骨肉瘤的发病机制研究和开发靶向药物提供了新的方向和策略,但有关其作用机制尚有待进一步研究。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711019
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

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彭动斌, 唐雪峰, 高自然, 吕杨帆, 郭乔楠.
PENG Dongbin, TANG Xuefeng, GAO Ziran, LYU Yangfan, GUO Qiaonan.
下调Notch3表达对骨肉瘤细胞生物学特性的影响
Effect of down-regulating Notch3 expression on biological characteristics of osteosarcoma cells
第三军医大学学报, 2018, 40(7): 551-555
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(7): 551-555
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201711019

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收稿: 2017-11-03
修回: 2017-12-07

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