急性心肌缺血严重危害人类健康。临床上对急性心肌缺血的治疗方法主要有药物溶栓治疗、冠状动脉旁路移植手术及介入冠脉成型治疗等。然而由于治疗时间窗短, 治疗不及时等原因, 通常会造成各种不可逆的心肌梗死^[1]。因此, 发展新的改善心肌缺血的治疗方法, 恢复心肌血流灌注十分必要。以往研究发现, 低强度超声辐照具有非创伤性扩张血管、侧枝循环开放、上调VEGF、增强血管通透性等作用^[2-3]。本课题组在此基础上设想, 在急性心肌缺血实施各种介入或药物治疗前, 早期实现低强度超声治疗, 能够从开放侧枝循环的角度改善心肌血供, 降低心肌梗死面积, 减少缺血再灌注损伤的发生。为此本研究拟通过建立大鼠急性心肌缺血模型, 用不同超声机械指数单独或联合微泡对大鼠缺血心肌进行超声辐照, 每次20 min, 总共3次照射, 28 d后观察心脏射血功能, 以此初步探讨不同机械指数超声以及联合微泡对大鼠急性心肌缺血模型心脏收缩功能的影响。

1 材料与方法 1.1 实验动物

健康6~8周雄性SD大鼠70只, 体质量约200 g, 由陆军军医大学第二附属医院动物实验中心提供, 饲养环境清洁级。

1.2 实验材料

1.2.1 动物呼吸机

ALC-V8, 呼吸频率调节范围:60次/min, 呼吸比调节1 :1, 潮气量调节范围:2~3 mL。

1.2.2 超声治疗仪

飞依诺VINNO70彩色多普勒超声诊断仪, 所配X4-12 L高频线阵探头, 其发射频率4~12 MHz。该仪器配备微泡空化调控功能(即VFLASH功能), 并具有自适应可变焦域(ROI)的弱聚焦式超声发射功能^[4]。本实验采用该仪器的VFLASH功能将整个心脏置于ROI进行辐照, 辐照的具体机械指数(MI)为1.4和0.7, 其中MI=1.4的脉冲宽度为5个周期, MI=0.7为18个周期, VFLASH频率4 MHz, 脉冲重复频率20 Hz, 脉冲时间1.2 s, 脉冲间隔时间2 s, 总治疗时间长20 min。

1.2.3 小动物超声仪

VisualSonics FujiFilm公司Vevo 2100型高频高分辨率小动物超声成像系统, MS250高频线阵探头(中心频率18 MHz), 具备实时彩色多普勒血流成像、频谱多普勒血流检测、M型超声心动图成像、心脏舒缩功能测量分析、二次谐波超声造影成像等功能。

1.2.4 超声造影剂

陆军军医大学第二附属医院超声科自制“脂氟显”脂质包膜微泡, 核心气体为全氟丙烷, 平均粒径2 μm, 浓度为(4~10)×10⁹/mL^[5]。

1.3 实验方法

1.3.1 大鼠急性心肌缺血模型的建立^[6-7]

大鼠腹腔注射10%水合氯醛溶液(4 g/kg)麻醉后, 将其仰卧固定四肢及上齿于实验台, 经口腔气管插管, 连接小动物呼吸机, 设置参数:呼吸次数60次/min, 呼吸比1 :1, 潮气量2~3 mL。胸部备皮消毒, 于第4肋间开胸并充分暴露心脏。以左冠状动脉为标志结扎左冠状动脉前降支, 结扎前于心脏表面滴1~2滴盐酸利多卡因注射液以预防心律失常。当观察到心脏表面发白, 运动减弱, 初步提示结扎成功。关闭胸腔, 逐层缝合至皮肤。手术完成后即刻M型超声心动图测量大鼠左心收缩功能, 随后尾静脉团注0.1 mL脂氟显并用VINNO70高频探头进行超声造影(CEUS), 显示左室前壁及心尖部心肌缺血造影增强缺损(图 1), 证明急性心肌缺血大鼠模型建立成功。建模成功者术后连续3 d肌注青霉素溶液, 每天2次, 每次20×10⁴U。

1.3.2 实验分组及处理

模型大鼠70只用随机数字表法分为5组:单纯超声辐照组包括高机械组(HMI, MI=1.4, n=11)和低机械指数组(LMI, MI=0.7, n=17), 高机械指数联合微泡组(HMB, MI=1.4, n=15)和低机械指数联合微泡组(LMB, MI=0.7, n=16), 空白对照组(n=11)。实验处理前用小动物超声检测各组大鼠心功能, 然后按照随机分组情况, 进行相应的超声治疗(以下简称治疗), 各组处理的MI值见以上分组。各组大鼠于模型建立后24、72、96 h按照实验方案进行超声治疗, 显示完全左心室, 切换到VFLASH模式, 选择设定好的治疗参数, 将整个心脏置于弱聚焦框内, 治疗过程中以0.05 mL/min的速度缓慢匀速推注稀释后脂氟显微泡(0.1 mL微泡原液稀释于10 mL生理盐水中)1 mL。术后第28天在超声造影进行左心室内膜勾画的情况下测量左心室收缩功能。实验中注意VINNO70超声诊断治疗一体机的高频探头时刻显示左室长轴, 保证不脱位。

1.4 实验数据采集

1.4.1 大鼠存活率

建模成功后参与治疗的大鼠记录其存活时间, 以28 d为终止目标, 计算存活率。

1.4.2 大鼠左心室收缩功能

治疗后存活时间满28 d各组鼠(HMI组8只, LMI组8只, HMB组3只, LMB组8只, 对照组9只), 用M型法测量大鼠左心室收缩功能尤其是射血分数(EF), 取样线位于乳头肌平面及乳头肌与心尖之间, 重复测量2~3次, 取平均值。

1.4.3 病理检测

第28天处死所有大鼠, 完整切取整个心脏固定于4%多聚甲醛溶液, 石蜡包埋制作切片, HE染色, 光学显微镜观察各组大鼠心脏组织病理变化。

1.5 统计学处理

使用SPSS 19.0统计软件, 各组大鼠28 d存活率比较采用χ²检验; 大鼠心脏收缩功能EF值以x±s表示, one-way ANOVA法两两比较各组EF值。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 存活率比较

取建模成功且参与治疗的大鼠, 以28 d为标准, 比较各组大鼠长期存活率:HMI组存活8只(72%), LMI组存活8只(47%), HMB组存活3只(20%), LMB组存活8只(50%), 对照组存活9只(82%)。HMI组与LMI组无统计学差异(χ²=1.797, P>0.05), LMI组与LMB组无统计学差异(χ²=0.00, P>0.05), 单纯超声治疗组与对照组均无统计学差异(χ²=0.259, P>0.05), HMI组高于HMB组, 差异有统计学意义(χ²=5.23, P < 0.05)。

2.2 各实验组大鼠心功能测量

one-way ANOVA法检验各组EF值差异, 各组数据满足方差齐性, 且各组数据之间有统计学差异(F＝ 9.91, P < 0.01)。EF值:HMI组(MI=1.4)为(87.71± 4.69)%, LMI组(MI=0.7)为(78.04±7.35)%, HMB组[(MI=1.4)+MB]为(75.09±9.47)%, LMB组[(MI=0.7)+MB]为(76.43±6.83)%, 空白对照组为(64.97±9.37)%。HMI、LMI组与空白对照组比较差异均具有统计学意义(P < 0.01, P < 0.05), HMI组与LMI组差异具有统计学意义(P < 0.01), LMI组与LMB组差异无统计学意义(P>0.05)。

2.3 建模28 d后大鼠心肌病理检测

28 d后, 空白对照组大体观察可见左心室扩大, 外形不规则, 前壁及心尖部梗死区室壁缺血坏死呈白色, 心肌组织薄弱呈薄翼状, 镜下未见正常心肌组织。其余各组镜下见心肌细胞结构清晰, 排列一致, 室壁厚薄基本一致, 各组均可见少量炎性细胞浸润及肌间纤维组织增生(图 2)。

3 讨论

急性心肌缺血不仅需要血管介入或药物溶栓等治疗方法快速恢复冠脉主干的供血, 同时也需要探索从心肌微血管水平刺激血管扩张、侧枝循环开放或血管新生的治疗新方法, 尤其是在没有介入条件的情况下。低强度超声作为一种新型的无创治疗技术, 正在受到行业的广泛关注, 尤其是超声的扩血管效应和刺激微血管新生的作用, 可能从微循环水平改善心肌供血, 值得深入研究。

前期研究发现, 超声对犬乳内动脉照射时产生的扩血管效应使大动脉明显扩张, 其机制可能与一氧化氮(NO)及前列腺素的释放有关^[8]。随后更多研究证实超声的扩血管效应主要由空化等机械效应刺激产生, 具体与小动脉血管的短暂扩张、微血管生成等有关。BELCIK等^[9]发现, 通过对结扎髂动脉骨骼肌造影定量分析, 发现超声能够有效改善小鼠缺血骨骼肌的血流灌注, 使微血管灌注指数增加了40% ~50%, 其原因可能与超声通过微射流、冲击波等机械效应刺激以及内皮型一氧化氮合酶(eNOS)的激活有关。最新研究表明^[10], 治疗超声微泡空化增强小鼠缺血肌肉血流灌注依靠的是通过不同嘌呤信号转导通路的组合引起剪切力依赖的ATP增加。

已知各冠状动脉主干的分支在心肌毛细血管水平均有吻合, 因此在冠脉一支主干急性血栓形成的情况下, 可以通过扩张开放侧枝循环减少该区域的心肌缺血, 使缺血心肌重新获得血流灌注^[11]。XIE等^[12]早期在对急性心肌缺血猪模型进行超声微泡溶栓治疗时, 发现在冠状动脉造影未显示血管再通的情况下, 缺血区心肌微循环灌注得到显著改善。以上研究结果提示低强度超声的扩血管效应可能产生枝循环开放, 使缺血肌肉重新获得侧枝血供, 从而有效减少心肌损伤和梗死面积。

为验证超声治疗对左室收缩功能的增强作用, 并进一步观察超声参数变化对治疗效果的影响作用, 本实验采用的心肌缺血模型是业界通常采用的动物模型^[13]。左室射血分数测量结果表明, 各超声治疗组左心室平均EF值较空白对照组均有显著提高, 其中HMI组提高了约35%, LMI组提高了约20%, HMB组提高了约15.6%, LMB组提高了约17.6%。该实验结果与SHINDO等^[2]研究结果一致, 再次证实了3次、每次20 min的超声辐照有助于改善左心室收缩功能。

在此基础上, 为了进一步对超声参数的影响作用进行观察, 本实验结合前期研究基础设置了两种不同机械指数(MI)的超声治疗参数。机械指数指相关生物效应的计算值, 其计算公式为, 用来估量潜在的生物效应。本实验分别设置了MI=1.4的高机械指数组及MI=0.7的低机械指数组, 且对两组脉冲宽度进行了调整, 以使其平均声能量相等。实验结果证实, 在辐照能量相同的情况下, 应用不联合微泡的高MI超声辐照产生的缺血心肌收缩功能改善效果(EF提高约35%)优于应用低MI超声辐照(提高了约20%)。根据BELCIK等^[9]研究结果, 超声改善小鼠骨骼肌血流灌注的可能机制为通过提高震荡压力波动产生的内切性剪切力和eNOS的激活。而随着MI的升高, 其产生的机械效应也相应增加, 因此理论上可能更容易产生剪切应力升高刺激血管扩张效应。但在进一步加入脂质微泡造影剂的对比研究中, 实验结果则产生了预期外效应:高MI联合微泡组动物平均EF值虽然较空白对照组有所升高, 但较单独高MI组低, 且其动物生存率显著降低; 而低MI联合微泡组动物平均EF值及存活率与单独低MI组比较无显著差异。微泡造影剂作为有效的外源性空化核, 在大剂量[本实验中约(4~10)×10⁷/只]注入血池内时, 不仅能够显著降低空化阈值, 还能够大大增强超声空化效应, 而空化效应的增强无疑可显著提高血管内局部机械刺激效应^[14]。BELCIK等^[9]对骨骼肌血流灌注的影响实验研究结果与该理论一致, 证实微泡的应用能够增强超声对骨骼肌的扩血管效应, 而我们的结果则与之相反, 究其原因, 我们认为主要与不同疾病模型动物的基础病理生理状态有关。既往研究表明, 空化效应, 尤其是瞬态空化效应, 不仅会引起局部空间内流体应力的变化, 当其发生在生物膜附近时还可能对邻近组织/细胞产生可逆/不可逆性损伤效应。对于正常及长时间缺血骨骼肌而言, 尽管高机械指数超声辐照联合微泡产生的空化损伤效应可能引起局部微血管组织液渗出、间质水肿, 但由于组织基础生理状态好, 且骨骼肌并非影响动物存活的重要生理器官, 因此高强度超声空化作用可能产生更强烈的血管刺激效应^[15]。而对于急性缺血心肌, 由于组织本身处于缺血水肿期, 强烈的空化效应引起的血管损伤可能进一步加重组织肿胀, 从而抵消可能带来的血管扩张效应。此外, 心肌组织间质的神经传导系统也可能由于严重的水肿产生功能紊乱, 引起小动物心律失常(以期前收缩为主)^[15], 并且单次治疗时间长达20 min, 这可能是导致该治疗组小动物死亡率增高的原因。在本研究中, 尽管超声空化辐照治疗产生了较为显著的心功能改善作用, 但各治疗组动物存活率较对照组均有所降低, 与预期不符。其原因一方面可能与上述超声空化引起的心肌组织病理改变导致功能不耐受有关, 另一方面可能与麻醉药物的影响作用有关。由于动物无法有效配合, 因此治疗组大鼠的麻醉深度要求较高, 以保证长达20 min治疗的稳定性及有效性, 而空白对照组大鼠由于无需进行辐照治疗, 因此麻醉深度可适当降低。由于本实验所采用麻醉药物的有效剂量与致死剂量很接近, 因此在连续治疗时间间隔较短的3次治疗内, 麻醉药物对对照组的影响比治疗组小。对于大鼠心脏收缩功能测量的方法, 双平面辛普森法显然更为准确。然而因为在前期预实验中发现, 对于正常鼠来说, 双平面辛普森法可用, 而对于建模术后的大鼠, 由于心脏前方手术疤痕及缝合线等的存在, 导致声窗差无法穿透, 即使在造影剂填充心腔的情况下, 亦无法用辛普森法完整的勾画出内膜的边缘, 因此选用了常规M型法多次测量取平均值的方法。本实验的局限也在于因为术后疤痕的存在, 尚未对心肌血流灌注做定量造影分析。

本实验结果证实了在急性期连续多次、长时间超声空化作用可有效改善急性缺血动物心肌收缩功能, 且初步证实了在平均声能相同的情况下, 高机械指数短脉冲辐照较低机械指数长脉冲辐照效果佳, 而对于急性缺血心肌, 微泡增强的超声效应可能反而减弱其心功能改善疗效。

诊断超声是一种已经在临床安全应用60余年的低强度超声, 我国和美国FDA对诊断超声的能量限定为:平均声强(I_SPTA)低于720 mW/cm²、MI低于1.9等。诊断超声比以往文献报道的低强度治疗超声平均声强更低, 利用诊断超声实施心肌缺血治疗不仅具有安全性好, 而且具有可视化, 可以克服心脏声窗狭窄等客观困难因素。

VINNO70诊断治疗一体机在常规超声诊断的基础上, 增加了VFLASH微泡空化调节功能, 在诊断超声剂量下多参数可调, 通过5个参数调控空化强度, 满足了微气泡谐振、膨胀、内爆等的控制, 精准程度显著提高, 并具有普通超声仪无法实现的ROI弱聚焦式超声治疗靶区调节功能, 可一次性针对性的对较大的治疗区域进行覆盖, 并通过超声影像实时监控其过程。在临床治疗中, 对急性心肌缺血患者, 在接受溶栓或经皮导管冠脉成形术的准备期间, 若使用诊断超声对患者缺血部位进行20~30 min的超声辐照, 可有效扩张血管, 早期开放侧枝循环改善心肌缺血, 可达到缩小心肌梗死范围或降低冠脉成型术后缺血再灌注损伤发生的目的。