原发性肝细胞肝癌是全球常见的恶性肿瘤之一, 严重威胁着人类健康, 病死率在恶性肿瘤中居第三位, 我国每年确诊的肝癌人数占全世界一半以上[1]。因此研究其发生发展的分子机制, 寻求一种新的治疗方式有着深远的意义。
Jmjd3在肝癌组织和肾癌中高表达[2-3], 运用RNAi技术敲低Jmjd3可以诱导细胞发生凋亡[4-6]。GSK-J4作为Jmjd3选择性抑制剂, 能够有效抑制Jmjd3在多种细胞中的表达, 发挥调控巨噬细胞炎症反应[7], 治疗儿童脑干肿瘤[8], 诱导T细胞急性淋巴细胞白血病细胞发生凋亡等作用[9]。肿瘤的进展等免疫过程常伴有STAT3异常激活, 并与肿瘤增殖、凋亡及某些生物学行为等存在密切联系, 如上皮细胞-间充质转化(EMT)[10-11]。EMT是上皮细胞通过特定程序转化为具有间充质细胞表型的生物学行为, 使细胞的骨架发生变化, 增强形变能力, 从而促进肿瘤的侵袭和转移, 常伴随E钙黏蛋白(E-caderin)和波形蛋白(Vimentin)[12]等分子标记表达改变。有研究表明, 抑制STAT3信号通路激活, 能够有效抑制肿瘤细胞的侵袭[13-14]。因此, 抑制STAT3激活的药物将有抑制HCC生长的可能。本研究旨在运用Jmjd3选择性抑制剂GSK-J4作用于HCC细胞株, 观察其对HCC的影响及初步探讨其可能的机制, 为后期深入研究提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 主要材料RPMI1640培养基和胎牛血清购自以色列BI公司, 青霉素/链霉素抗生素购自美国Gibco公司, GSK-J4购自美国Bimake抑制剂公司, 人重组白细胞介素6(recombinant human interleukin 6, rhIL-6)购自上海生工, 细胞计数试剂盒(cell counting kit-8, CCK-8)购自日本Dojindo公司, Annexin V(FITC)/PI染色剂购自碧云天公司, Transwell小室购自Corning公司, 基质胶(ECM)购自Sigma公司, 抗兔Jmjd3购买自英国Abcam公司; 抗兔H3K27me3多克隆抗体、抗兔Bcl2多克隆抗体、抗兔Bax多克隆抗体、抗兔Caspase3多克隆抗体、抗兔E-cadherin单克隆抗体、抗兔Vimentin单克隆抗体、抗兔p-STAT3多克隆抗体购自美国Cell Signaling Technology公司; 抗兔STAT3多克隆抗体、辣根过氧化物酶(HRP)标记的山羊抗兔及山羊抗鼠购自北京中山金桥生物公司; 鼠源抗β-actin购自博士德公司, 细胞总RNA提取试剂Trizol购买自TaKaRa公司, 逆转录试剂All-in-One cDNA Synthesis SuperMix和2×SYBR Green qPCR Master Mix购买自美国Bimake公司, ECL化学发光试剂购自美国Advansta公司。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养人正常肝细胞株L02和人肝癌细胞株HepG2、SMMC7721购自美国菌种保藏中心(ATCC), 以含有10%胎牛血清和1%青霉素/链霉素的RPMI1640在37 ℃ 5%CO2的条件下培养, 当细胞处于对数生长期时, 以含有EDTA的0.25%胰酶消化传代或接种至相应孔板进行后续实验。取对数生长期细胞进行后续实验, 细胞分为GSK-J4处理组和对照组, GSK-J4分为:0, 10, 30, 50 μmol/mL进行处理[7]。
1.2.2 实时荧光定量PCR检测Jmjd3 mRNA表达将L02、HepG2和SMMC7721以TRIzol裂解, 严格按照说明书进行细胞总RNA提取, T100 Thermal Cycler system进行浓度和纯度测定, 并进行逆转录反应得到cDNA模板, 测得cDNA浓度和纯度后进行PCR反应。所使用基因及引物序列如下:Jmjd3上游引物为5′-GCAGGGAAGAAAATCGCTTA-3′, 下游引物为5′-ACA-GCCCTCGCAGTGTCA-3′; GAPDH上游引物为5′-CACCCACTCCTCCACCTTTGAC-3′, 下游引物为5′-GTCCA-CCACCCTGTTGCTGTAG-3′。使用Bio-Rad CFX96TM PCR仪进行反应, 条件为:95 ℃预热5 min激活热启动DNA聚合酶, 而后95 ℃ 15 s和60 ℃ 30 s反应45个循环。结果用2-△△Ct值进行计算并分析, 各组实验均独立重复3次。
1.2.3 CCK-8法检测不同剂量GSK-J4对HepG2细胞增殖的影响以每孔3000个HepG2分别铺满96孔板。GSK-J4以无菌磷酸盐缓冲液(PBS)溶解, 实验分为空白组(1640培养基), 对照组(不加药)及GSK-J4处理组(0、10、30、50 μmol/mL)4个浓度梯度, 加入完全培养基中分别处理细胞24 h及48 h, CCK-8实验前4 h以含血清新鲜1640培养基替换旧培养基。每组设3个复孔, 每孔加入10 μL CCK-8反应液, 37 ℃, 5% CO2条件下孵育1 h后在酶标仪450 nm波长处测得光密度值, 每组均重复3次, 计算平均值, 根据测得结果进行统计。计算细胞活力(%)=(处理组-空白组)/(对照组-空白组)×100%。
1.2.4 流式细胞仪Annexin V(FITC)/PI染色法检测HepG2细胞凋亡HepG2细胞凋亡通过Annexin V(FITC)/PI双染法流式细胞术分析进行测定。将处于对数生长期的HepG2以每孔约105个细胞接种于6孔板中, 实验分为:对照组、GSK-J4(30 μmol/mL)组、GSK-J4(50 μmol/mL)组, 处理24 h。处理结束后胰酶消化后离心, 以500 μL预冷PBS重悬制成单细胞悬液, 向细胞悬液中加入5 μL Annexin V(FITC)和5 μL PI染色溶液, 在室温下暗室中孵育15 min, 分别在488 nm和560 nm处进行检测。
1.2.5 Western blot技术检测Jmjd3、H3K27me3、Bcl2、Bax、Caspase3、E-cadherin、Vimentin、STAT3和p-STAT3在蛋白水平的表达情况取6孔板内对数生长期细胞, 每孔加入120 μL蛋白裂解液(PMSF :RIPA=1 :100), 细胞刮均匀刮涂孔板后冰上静置10 min, 重复3次, 将裂解产物转移至1.5 mL EP管, 4 ℃ 12 000 r/min 15 min离心后, 吸取上清入EP管, 二辛可宁酸法(bicinchoninic acid, BCA)测定蛋白浓度后加入2×蛋白上样缓冲液, 煮沸15 min后电泳。以每泳道30 μg上样, 80 V浓缩胶, 120 V下层胶的电压进行SDS-PAGE电泳, 甲醇激活PVDF膜3 min后湿转法100 V压法电转, 5%脱脂牛奶室温封闭2 h。抗Jmjd3(1 :500)、抗H3K27me3 (1 :1 000)、抗Bcl2(1 :1 000)、抗Bax(1 :1 000)、抗Caspase3(1 :1 000)、抗E-cadherin(1 :1 000)、抗Vimentin(1 :1 000)、抗STAT3(1 :1 000)、抗p-STAT3(1 :1 000)、抗β-actin(1 :500), 4 ℃房间孵育过夜。TBST液洗膜3次, 每次10 min; HRP标记的山羊抗兔(1 :5 000)、HRP标记的羊抗小鼠(1 :5 000),37 ℃孵育1 h, TBST洗膜3次, 每次10 min。ECL化学发光试剂盒在Fusion FX7仪器上进行曝光。Image J软件进行灰度值分析, 以β-actin为内参, 目的条带灰度值/内参灰度值表示结果, 各实验均独立重复3次。
1.2.6 Transwell实验以预冷的RPMI1640 :ECM= 1 :7比例配制后, 滴入60 μL稀释后的基质胶于Transwell小室的聚碳酸酯膜上(24 μm), 充分覆盖膜上的微孔, 过夜干燥。HepG2培养至对数生长期, 再以无血清培养基培养6 h, 使其处于饥饿状态。每个上室接种2×104个细胞, 共200 μL无血清培养基, 下室加入500 μL含有10%胎牛血清的RPMI1640培养基。将细胞分为:对照组、GSK-J4(30 μmol/mL)、GSK-J4(50 μmol/mL)处理组, 24 h后, 棉签擦除上室的基质胶和细胞, PBS洗涤1 min后以4%多聚甲醛固定10 min, PBS洗涤1 min后结晶紫染色10 min, 再以PBS将小室漂洗干净, 镜下观察, 400倍镜下, 取5个视野拍照记录结果并计数。
1.3 统计学分析数据用SPSS 20.0统计学软件进行分析, One-way ANOVA方法进行多组间数据比较, 最小显著差异(LSD)法进行两两均数比较, 数据以x±s表示。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 HepG2细胞中Jmjd3表达上调, H3K27me3表达下调RT-PCR及Western blot检测Jmjd3在mRNA和蛋白水平的表达, Western blot检测H3K27me3表达。结果发现, Jmjd3在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中mRNA水平(P < 0.05, P < 0.01, 图 1A)和蛋白水平表达(P < 0.01, 图 1B、C)较正常肝细胞株L02明显升高; H3K27me3蛋白在肝癌细胞HepG2、SMMC7721中表达较L02明显下调, 差异具有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01, 图 1C、D)。以上数据表明, Jmjd3在HepG2、SMMC7721肝癌细胞中表达高于正常肝细胞L02, H3K27me3则显著低于正常肝细胞。
2.2 GSK-J4抑制HepG2细胞株增殖
为探索GSK-J4对肝癌细胞增殖的影响, 将GSK-J4分为:0、10、30、50 μmol/mL处理HepG2细胞, 分别于24、48 h后酶标仪下450 nm测定光密度, 采用细胞活力表示实验结果, 并绘制曲线。结果显示, 30 μmol/mL和50 μmol/mL的GSK-J4在处理后均能有效抑制HepG2的增殖能力, 且呈剂量依赖关系, 差异具有统计学意义(P < 0.01, 图 2)。以上数据表明, GSK-J4能抑制肝癌细胞HepG2增殖。
2.3 GSK-J4通过抑制Jmjd3上调H3K27me3诱导肝癌细胞株HepG2凋亡
诱导肿瘤细胞发生凋亡已经被证实为一种有效抑制肿瘤生长的方法, 为此我们同样用30 μmol/mL和50 μmol/mL的GSK-J4处理HepG2细胞24 h, 离心收集细胞进行流式检测凋亡。结果表明, 与对照组相比, 30 μmol/mL和50 μmol/mL的GSK-J4处理后细胞凋亡明显增加, 且以晚期凋亡最为明显, 差异具有统计学意义(P < 0.01, 图 3)。为了验证GSK-J4是否能抑制Jmjd3, 发挥调控H3K27me3的作用, 我们用30 μmol/mL和50 μmol/mL的GSK-J4处理HepG2细胞, Western blot技术检测Jmjd3、H3K27me3的表达。结果表明, 与对照组相比, 30 μmol/mL和50 μmol/mL的GSK-J4处理组Jmjd3表达显著下调, H3K27me3的表达显著上调(P < 0.01, 图 4), 表明GSK-J4能有效抑制Jmjd3并上调H3K27me3表达。Western blot检测凋亡相关蛋白Bcl2、Bax、Caspase3在GSK-J4处理24 h后蛋白水平的变化。结果发现, 与对照组相比, GSK-J4处理组Bcl2表达降低(P < 0.05, P < 0.01), Bax、Caspase3表达明显增高(P < 0.01, 图 4)。表明GSK-J4能够有效诱导HepG2肝癌细胞发生凋亡, 抑制肝癌细胞的生长。
2.4 GSK-J4通过抑制EMT形成减弱HepG2细胞侵袭性
抑制肿瘤细胞的侵袭能力能显著阻断其发生发展的进程。将HepG2细胞分别设为:对照组、GSK-J4(30 μmol/mL)、GSK-J4(50 μmol/mL)处理组, 通过Transwell基质凝胶体外侵袭力实验显示, HepG2细胞的体外侵袭能力被明显抑制(图 5A), 24 h后穿过覆盖基质胶微孔的每视野细胞数量GSK-J4(30 μmol/mL)处理组(P=0.03), GSK-J4(50 μmol/mL)处理组(P= 0.009, 图 5B)显著低于对照组。以上数据表明, GSK-J4能有效抑制HepG2细胞的侵袭能力。肿瘤细胞EMT是其获得细胞形变能力, 促进侵袭的重要机制, 常伴随有E-cadherin、Vimentin等分子标记物表达变化。为了更深入了解GSK-J4抑制侵袭的机制, 我们用Western blot技术检测30 μmol/mL和50 μmol/mL处理后HepG2细胞中E-cadherin、Vimentin的变化情况。结果显示, 与对照组相比, GSK-J4处理组E-cadherin表达上调, Vimentin表达下调, 差异具有统计学意义(P < 0.05, P < 0.01, 图 5C, D)。
2.5 GSK-J4抑制IL-6/STAT3信号通路的激活
STAT3信号通路的激活伴随着多种肿瘤的发生和发展, 包括HCC, 为此我们推测, GSK-J4能够抑制STAT3的激活。为验证我们的假设, 我们将HepG2细胞分为:对照组、GSK-J4(30 μmol/mL)、GSK-J4(50 μmol/mL)处理组, 以rhIL-6(10 ng/mL)处理各组细胞, Western blot检测Jmjd3、STAT3和p-STAT3蛋白水平变化。结果显示, GSK-J4(30 μmol/mL)、GSK-J4(50 μmol/mL)均能有效抑制HepG2细胞IL-6激活的STAT3磷酸化, p-STAT3较对照组明显降低(P < 0.01), 并显著下调Jmjd3的表达(P < 0.01, 图 6)。以上数据显示, GSK-J4能有效抑制rhIL-6对STAT3的磷酸化激活作用。
3 讨论
原发性肝细胞肝癌是一种常见的、预后差、具有高度致死性的恶性肿瘤, 且发病率在世界范围内仍逐年攀升, 严重威胁着人类的健康。本研究应用GSK-J4作用于HepG2细胞, 发现其能有效抑制Jmjd3并上调H3K27me3表达, 从而诱导HepG2细胞发生凋亡并减弱侵袭力, 为原发性肝细胞肝癌的防治提供了新的理论依据。
组蛋白甲基化修饰和乙酰化、磷酸化、泛素化修饰等是表观遗传学领域的一种重要的修饰方式, 其中去甲基化酶Jmjd3能在组蛋白多个赖氨酸位点如H3K27me3进行修饰, 使H3K27me3特异性去甲基化从而导致转录激活[15], Jmjd3通过修饰组蛋白多个赖氨酸位点发挥激活或抑制基因而起到调控细胞分化、诱导凋亡等作用[16-17]。H3K27me3是一种转录抑制性标记, 在前列腺癌研究中显示其具有特异性, 与前列腺癌的侵袭性密切相关[18], 敲除Jmjd3可以调控H3K27me3甲基化从而抑制霍奇金淋巴瘤的作用[19]。在本研究中, 我们发现Jmjd3在HCC细胞株中表达明显高于人正常肝细胞, 而H3K27me3则表达下调, 表明抑制Jmjd3表达可作为一个切入点进行论证, 这与TANG等[2]在肝细胞肝癌中的研究类似。因此, 为了探讨GSK-J4对Jmjd3在肝癌细胞中是否能诱导HepG2发生凋亡并减弱其侵袭力, 我们用不同浓度GSK-J4处理Hep2肝癌细胞, 通过CCK-8法筛选出有效浓度处理HepG2细胞, 流式细胞术检测凋亡率。结果表明, GSK-J4处理组的细胞凋亡率明显高于对照组, 主要以晚期凋亡为主。同时, Western blot检测发现GSK-J4处理组抗凋亡蛋白Bcl2表达降低, 促凋亡蛋白Bax、Caspase3表达上调而诱导凋亡, 达到抑制Hep2细胞增殖的目的。
信号转导子和转录激活子(STAT)在信号转导和转录激活上发挥了关键的作用, IL-6是一种能够诱导巨噬细胞M2极化的因子, 并能有效刺激肿瘤中STAT3的磷酸化[20]。STAT3的激活与肺腺癌、乳腺癌等恶性肿瘤EMT形成[21-22]及直肠癌细胞凋亡等密切相关[23]。抑制STAT3的磷酸化, 可显著抑制肿瘤的侵袭, 诱导凋亡等发生[24]。ENE等[25]用微阵列技术证实Jmjd3是STAT3基因的一个直接调控目标, 提示GSK-J4抑制Jmjd3诱导HCC凋亡并减弱侵袭, 有可能与某些信号通路有关, 如IL-6/STAT3通路。在本研究中, 通过Transwell实验我们发现GSK-J4能显著抑制HepG2肝癌细胞的侵袭能力, Western blot检测E-caderin和Vimentin在GSK-J4处理后的蛋白表达, 结果显示, GSK-J4能上调E-cadherin并下调Vimentin的表达, 进一步证实GSK-J4能通过抑制EMT的形成达到抑制HepG2肝癌细胞侵袭的目的。在本研究中, 我们将rhIL-6作用于GSK-J4处理后的HepG2细胞, Western blot检测Jmjd3、STAT3和p-STAT3的表达情况, 结果发现:GSK-J4能够有效抑制rhIL-6对STAT3的磷酸化激活, 同时抑制Jmjd3的表达。提示GSK-J4有可能通过抑制STAT3的磷酸化诱导HCC细胞株发生凋亡并减弱侵袭力。然而GSK-J4诱导HCC细胞凋亡的确切机制仍需进一步研究, 我们计划在今后的实验中增加免疫共沉淀和染色质免疫共沉淀等实验来验证STAT3和Jmjd3的相互作用关系, 探索其更深层次的关系。
综上, GSK-J4抑制Jmjd3的表达上调H3K27me3, 诱导HepG2肝癌细胞凋亡和减弱其侵袭, 其可能是通过IL-6/STAT3信号通路进而抑制HepG2细胞EMT实现的, 为治疗HCC提供了一个新的作用靶点和方法。
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