胃癌(stomach cancer)是全世界发病率最高的肿瘤之一，也是中国的第2大常见肿瘤。我国的胃癌患病率和死亡率均是世界水平的2倍多[1]。相比其他国家，我国的胃癌防治形势更加严峻。尽管近年来胃癌的综合治疗取得一定进步，但胃癌患者5年总体生存率仍不令人满意[2]。化疗敏感性降低是胃癌患者治疗失败的主要原因之一。顺铂(cisplatin)是治疗胃癌的一线化疗药，但顺铂化疗敏感性降低在临床上较为普遍，成为影响胃癌预后的重要因素。因此，深入研究胃癌顺铂化疗敏感性降低的分子机制，对胃癌的治疗有重要意义。细胞自噬是真核生物中一种高度保守的分解和回收细胞内物质(包括蛋白质、损伤的细胞器等)的过程。大量研究表明，细胞自噬不仅参与维持生理状态下的细胞稳态，而且与肿瘤的发生发展[3-5]、化疗敏感性[6-10]等密切相关。近年研究表明，升高的自噬水平能抑制肿瘤细胞对顺铂的化疗敏感性。但目前顺铂激活细胞自噬的机制尚不清楚。文献[11]报道，顺铂发挥作用是通过与DNA结合，引起交叉联结，造成DNA损伤，进而杀伤肿瘤细胞。因此，DNA损伤修复能力对顺铂化疗敏感性有着重要作用[12]。O-6-甲基鸟嘌呤-DNA甲基转移酶(O-6-methylguanine-DNA methyl-transferase，MGMT)能够将DNA鸟嘌呤上的烷基转移到自身，使DNA鸟嘌呤还原，而MGMT则因烷基化而失去活性，最终被细胞内的蛋白酶体系统降解清除，从而完成修复过程。文献[13]报道，在胆囊癌细胞中，顺铂能抑制MGMT启动子转录活性，从而抑制MGMT mRNA表达。亦有研究表明，DNA损伤可激活细胞自噬[14]。由此我们推测，顺铂可能通过影响DNA损伤修复蛋白MGMT从而激活细胞自噬，影响肿瘤细胞化疗敏感性。本研究旨在明确MGMT与细胞自噬的相互关系，探讨顺铂激活肿瘤细胞自噬的具体机制，以求为增强顺铂在胃癌中的化疗敏感性提供新的策略。
1 材料与方法 1.1 细胞株人胃癌细胞株SGC-7901系本科实验室保存。
1.2 主要试剂和药品高糖DMEM培养基和青霉素链霉素双抗溶液(HyClone公司)，胎牛血清(Biological Industries公司)，LC3、MGMT抗体(Cell Signal Technology公司)，p62抗体(Santa公司)，GAPDH抗体、IP蛋白裂解液、PMSF、BCA蛋白浓度测定试剂盒、山羊抗鼠和山羊抗兔二抗(碧云天公司)，qRT-PCR引物(上海捷瑞公司)，过表达MGMT慢病毒载体(吉玛公司)，顺铂(齐鲁制药)。
1.3 方法 1.3.1 细胞培养人胃癌SGC-7901细胞置于含1%青霉素链霉素双抗溶液和10%胎牛血清的高糖DMEM培养基中，于5%CO2、37 ℃细胞培养箱中培养。
1.3.2 Western blot法检测自噬相关蛋白、MGMT蛋白IP裂解液提取总蛋白，经BCA蛋白浓度测定试剂盒定量，加入SDS沸水浴5 min使蛋白变性。蛋白上样量为30 μg，经SDS-PAGE凝胶电泳分离，湿转法将蛋白转移0.2 μm PVDF膜上，5%脱脂牛奶室温封闭2 h，一抗4 ℃过夜孵育(MGMT、LC3、1 :1 000，p62：1 :500，GAPDH：1 :10 000)，二抗孵育2 h(山羊抗鼠1 :5 000，山羊抗兔1 :10 000)，ECL化学发光法曝光。
1.3.3 qRT-PCR法检测MGMT基因mRNA表达水平TRIzol法提取细胞总RNA，经TaKaRa反转录酶试剂盒逆转录得到cDNA，按说明书使用TaKaRa的SYBRⅡ试剂检测MGMT基因mRNA水平，PCR反应体系为20 μL。GAPDH作为内参，每个标本均设3个复孔。MGMT引物上游：5′-TTTTCCAGCAAGAGTCGTTCAC-3′，下游：5′-GGGACAGGATTGCCTCTCAT-3′，片段长度157 bp；GAPDH引物上游：5′-GGAGCGAGATCCCTCCAAAAT-3′，5′-GGCTGTTGTCATACTTCTCATGG-3′，片段长度191 bp。引物由上海捷瑞生物工程公司合成。数据分析采用ΔΔCt法。
1.3.4 GFP-LC3质粒转染检测细胞自噬小体水平胃癌SGC-7901细胞在12孔板中爬片，过夜培养，当细胞融合至60%~70%时，转染GFP-LC3表达质粒，转染6 h后换液。24 h后加入终浓度为10 μg/mL的顺铂和培养基预混液，处理24 h后，于激光共聚焦显微镜下采集图像。
1.4 统计学分析采用SPSS 22.0统计软件，计量资料数据以x±s表示，两组间比较用t检验以及单因素方差分析。检验水准：α=0.05。
2 结果 2.1 顺铂激活胃癌SGC-7901细胞自噬，且呈剂量依赖性为证明在胃癌细胞中顺铂是否激活细胞自噬，分别用不同浓度的顺铂处理胃癌SGC-7901细胞24 h，Western blot检测自噬相关蛋白变化情况。结果显示，随着顺铂浓度升高，自噬底物蛋白p62逐渐降低，自噬标志分子Ⅱ和Ⅰ型微管相关蛋白轻链3(mircotuble-associated protein light chain 3，LC3)的比值逐渐增高(图 1)。
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1：对照组；2~4：5、10、20 μg/mL顺铂处理组 A：Western blot检测顺铂处理24 h后p62和LC3蛋白表达；B、C：半定量分析结果a: P < 0.05，与对照组比较 图 1 Western blot检测顺铂激活胃癌SGC-7901细胞自噬 |
同时，用10 μg/mL顺铂处理转染GFP-LC3表达质粒的胃癌SGC-7901细胞24 h后，激光共聚焦显微镜下观察发现，与对照组相比，顺铂组胃癌SGC-7901细胞中的自噬小体数量明显增加(图 2)。说明顺铂可激活胃癌SGC-7901细胞自噬，且呈剂量依赖性。
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| A：对照组；B：10 μg/mL顺铂处理组 ↑：自噬小体 图 2 顺铂处理胃癌SGC-7901细胞后GFP-LC3荧光蛋白变化 |
2.2 顺铂剂量依赖性抑制胃癌SGC-7901细胞MGMT水平
为证明MGMT是否参与顺铂对胃癌SGC-7901细胞的作用，分别采用qRT-PCR和Western blot检测经不同浓度的顺铂处理胃癌SGC-7901细胞24 h后，MGMT mRNA及蛋白水平变化。如图 3所示，随着顺铂浓度增大，MGMT mRNA(P < 0.05)和蛋白水平均呈剂量依赖性减低。说明顺铂能剂量依赖性地抑制MGMT。
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1：对照组；2~4：5、10、20 μg/mL顺铂处理组 a：P < 0.05，与对照组比较 A：qRT-PCR检测；B、C：Western blot检测及半定量分析 图 3 qRT-PCR与Western blot检测顺铂处理胃癌SGC-7901细胞24 h后MGMT mRNA和蛋白水平变化 |
2.3 MGMT抑制胃癌SGC-7901细胞基础自噬水平
在胃癌SGC-7901细胞中用慢病毒载体过表达MGMT，qRT-PCR结果表明，过表达MGMT组的MGMT mRNA相对表达量(523.100±19.000)明显高于空载组(1.001±0.029，P < 0.05)。Western blot检测结果表明，与空载组相比，过表达MGMT组可有效地高表达MGMT(图 4A、B)。同时，与空载组相比，过表达MGMT组的自噬底物蛋白p62增加，自噬标志分子LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值显著下降(图 4C~E)。表明过表达MGMT可抑制细胞基础自噬水平。
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1：空载组；2：过表达MGMT组 a：P < 0.05，与空载组比较 A、B：Western blot法验证MGMT过表达效果及其半定量分析；C~E：Western blot检测过表达MGMT后胃癌SGC-7901细胞自噬水平及其半定量分析 图 4 MGMT抑制胃癌SGC-7901细胞基础自噬水平 |
2.4 MGMT抑制顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬
为进一步明确MGMT对胃癌SGC-7901细胞自噬的抑制作用，我们接下来在MGMT组和空载组细胞中，分别采用10 μg/mL顺铂处理细胞24 h，经Western blot检测自噬相关蛋白。结果表明，与空载组相比，MGMT组的p62蛋白水平明显升高，LC3Ⅱ/LC3Ⅰ值明显降低(图 5)。表明过表达MGMT能抑制顺铂激活的细胞自噬。
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1：空载组+10 μg/mL顺铂；2：过表达MGMT组+10 μg/mL顺铂 A：Western blot法检测空载组和过表达MGMT组经顺铂处理后细胞自噬水平；B~D：半定量分析a：P < 0.05，与空载组+10 μg/mL顺铂比较 图 5 Western blot检测顺铂处理过表达MGMT胃癌SGC-7901细胞后自噬水平 |
3 讨论
顺铂是临床上常用的一种细胞非特异性化疗药，具有抗癌谱广、作用强、与多种抗肿瘤药物有协同作用、价格经济等优点，对于胃癌、头颈部鳞癌、卵巢癌、肺癌等肿瘤有良好的治疗效果。但顺铂耐药在临床上屡见不鲜。因此，研究如何提高顺铂化疗敏感性符合临床需求。
细胞自噬被认为是一种能降解、循环利用蛋白质和细胞器、为细胞提供能量的保护性机制，能减少饥饿、缺氧、能量缺乏和放化疗等外界刺激对细胞的影响。近年来研究发现，细胞自噬与肿瘤化疗敏感性之间存在紧密联系，因此调控自噬也被认为是提高肿瘤细胞化疗敏感性的可能方法之一[15]。既往研究表明，在鼻咽癌中，使用自噬抑制剂氯喹可以增加鼻咽癌细胞对顺铂的敏感性[16]；抑制细胞自噬水平，可减轻骨肉瘤细胞的顺铂耐药[17]。MA等[18]研究亦发现，在恶性胶质瘤细胞中，抑制自噬可促进顺铂诱导的细胞凋亡。以上研究表明，在多种肿瘤中顺铂均可激活细胞自噬，抑制细胞自噬能增强肿瘤细胞对顺铂的化疗敏感性[19-23]。本研究通过Western blot检测自噬底物蛋白p62、自噬标志分子LC3Ⅱ/LC3Ⅰ和GFP-LC3荧光显像等多种方法，评价顺铂激活的胃癌SGC-7901细胞自噬水平，发现顺铂可剂量依赖性激活胃癌SGC-7901细胞自噬，提示激活细胞自噬可能是顺铂化疗敏感性降低的原因之一。但目前顺铂激活细胞自噬的具体机制尚不明确。文献[24]报道，葫芦素B造成DNA损伤后，可通过激活PTEN信号通路进而激活保护性细胞自噬。遗传毒性物质造成DNA损伤后，其主要应答分子E2F1可上调LC3、自噬相关基因4和5(autophagy-related gene, ATG)、损伤相关自噬调节器(damage-related autophagy modulator, DRAM)等，进而激活细胞自噬[25]。提示药物造成的DNA损伤及DNA修复过程可激活细胞自噬。
MGMT是一种重要的DNA损伤修复分子。作为一种“自杀式”的DNA损伤修复酶，文献[18]报道在顺铂处理胆囊癌细胞后，MGMT mRNA表达水平下降。本研究通过qRT-PCR检测表明，在胃癌SGC-7901细胞中，顺铂可剂量依赖性地抑制MGMT mRNA水平，Western blot检测结果显示，顺铂亦可剂量依赖性地抑制MGMT的蛋白水平，提示MGMT可能参与了顺铂诱导的胃癌SGC-7901细胞损伤修复过程。同时，过表达MGMT的胃癌SGC-7901细胞中基础自噬水平及顺铂激活的细胞自噬水平均下降，顺铂可以通过抑制MGMT进而激活胃癌SGC-7901细胞自噬，为顺铂激活细胞自噬的具体机制提供了新的方向。本研究不足之处在于尚未解析MGMT抑制胃癌SGC-7901细胞自噬的具体机制，我们拟从MGMT影响自噬相关基因表达的角度，筛选自噬相关基因，从而进一步佐证MGMT对自噬的抑制作用。
综上所述，本研究发现顺铂可剂量依赖性地抑制胃癌SGC-7901细胞MGMT表达，进而激活细胞自噬、降低顺铂化疗敏感性，为更好地增强顺铂治疗胃癌临床疗效提供新策略。
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