TPX2 (targeting protein for Xklp2)是一种定位于人类染色体20q11.1的微管相关蛋白,其表达水平与细胞周期密切相关,在细胞周期的G1~S期开始被检测到,在细胞完成分裂后消失,是一种调节细胞有丝分裂的重要蛋白质[1]。TPX2在细胞的表达异常可致细胞有丝分裂异常,甚至可影响细胞凋亡和细胞周期的调控,致使细胞多倍体及异倍体形成,终致细胞增殖异常及恶性转化而发生肿瘤。最近研究证实,TPX2在许多人类肿瘤中存在异常表达现象,在肿瘤细胞的过表达能促进肿瘤细胞的恶性增生及细胞转移[2]。目前国内外关于TPX2基因对肿瘤影响的研究主要集中于肿瘤细胞沉默TPX2基因研究肿瘤细胞的生物学变化,且对其机制探讨较少。本课题组前期研究证实TPX2在宫颈癌细胞中表达水平的改变可影响宫颈癌细胞的功能[3]。为进一步研究TPX2在宫颈癌发生、发展中的作用,本研究前期实验构建了TPX2基因慢病毒表达质粒,并筛选出TPX2基因过表达的人宫颈癌HeLa细胞稳定细胞株[4],利用其来研究过表达TPX2对宫颈癌细胞的凋亡及侵袭的作用及其分子机制,旨在为揭示TPX2基因作为宫颈癌临床治疗靶点提供实验依据及机制。
1 材料与方法 1.1 主要试剂及细胞DMEM培养液购自美国Gibco公司;胰蛋白酶、胎牛血清购自美国HyClone公司;AnnexinV-FITC/PI双染法细胞凋亡检测试剂盒购自美国BD公司;RIPA裂解液和BCA蛋白检测试剂盒均购自美国Abcam公司;HRP-conjugated goat anti-Rabbit IgG购自美国Jackson公司;β-actin、TPX2、Caspase-3、Bax、nm23-H1、TIMP-1、Bcl-2及MMP-9抗体均购自Abcam公司;PVDF Transfer Membrane购自美国Millipore公司;Transwell小室购自美国Corning公司;Matrigel Basement Membrane Matrix购自美国BD公司;人宫颈癌HeLa细胞株为本实验室保存。
1.2 TPX2基因过表达慢病毒载体的构建及实验分组本课题前期实验构建了TPX2基因过表达慢病毒载体并测定了其表达效果[4]。简述如下:设计并合成TPX2基因的上下游引物,PCR方法扩增得到TPX2序列并将其重组克隆到慢病毒穿梭质粒LV11中,将构成的质粒转化DH5α感受态细胞,提取阳性克隆质粒进行酶切鉴定及测序,酶切及测序结果示正确后,将重组质粒及辅助质粒转染293T细胞进行病毒包装,检测其滴度,将成功包装的过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)及阴性对照载体(LV11-NC)分别感染人宫颈癌细胞HeLa,G418筛选得到TPX2基因过表达稳转细胞株,实时荧光定量PCR和Western blot分别检测TPX2 mRNA和蛋白的表达效果。选取稳定感染过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)并有效过表达TPX2的HeLa细胞作为实验组即过表达组,将稳定感染慢病毒载体(LV11-NC)的HeLa细胞为阴性对照组,未感染病毒的人宫颈癌HeLa细胞作为空白对照组(CON)。将上述3种细胞用含10%胎牛血清的DMEM培养基,置于37 ℃、5%CO2饱和湿度细胞培养箱中培养。当细胞融合度约为70%时,用0.25%胰蛋白酶消化并传代。
1.3 流式细胞术检测各组细胞凋亡的变化成功构建的3组细胞:空白对照组(CON)、阴性对照组(LV11-NC)及过表达组(LV11-TPX2)细胞培养72 h后,用不含EDTA的胰蛋白酶消化细胞,离心收集细胞,微量离心机2 000 r/min离心5 min,弃培养基。用冷PBS洗涤细胞2次(2 000 r/min离心5 min),收集细胞。用400 μL的binding buffer重悬细胞。在细胞悬液中避光加入5 μL AnnexinV-FITC染液,4 ℃反应15 min。反应后再避光加入10 μL的PI混匀,4 ℃反应5 min。在1 h内用FCM检测[5]。
1.4 Transwell小室基底膜侵袭实验检测各组细胞侵袭能力将冻存于-20 ℃的BD Matrigel置于4 ℃融化开, 和无血清培养基按1 :4稀释,加入Transwell上室各30 μL,在37 ℃培养箱中孵育过夜。收集各组细胞,血球计数板计数,使细胞密度为104/mL,向Transwell上室每孔加入100 μL细胞悬液。24孔板下室中加入500 μL含15% FBS的DMEM培养基,正常培养48 h。弃去滤膜上、下室的培养液,用棉球擦去上表面未侵袭的细胞,向下室加入500 μL PBS,轻轻吹打PBS达到清洗滤膜下表面的作用,重复1次。然后向下室加入4%多聚甲醛500 μL,使滤膜下表面浸在其中固定细胞,固定20 min,弃去固定液,倒置Transwell小室,使滤膜下表面朝上,自然风干。风干后直接在倒置的Transwell小室的滤膜下表面滴上数滴结晶紫染液,作用30 min;PBS清洗1遍,并在倒置显微镜下观察拍照计数[5]。
1.5 Western blot检测凋亡及侵袭相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax、nm23-H1、TIMP-1及MMP-9的表达在各组细胞中加入细胞裂解液,全部刮取细胞转移至1.5 mL离心管中,10 000 r/min, 4 ℃离心10 min,取30 μL上清,加入10 μL上样缓冲液,100 ℃加热处理10 min,BCA法测定蛋白浓度。样品使用8% SDS-PAGE电泳分离,电泳条件为80 V电泳30 min,120 V电泳70 min,将蛋白转移至PVDF膜上。用含5%脱脂奶粉的TBST封闭转印膜1 h。加入稀释好的一抗,4 ℃条件下孵育过夜。加入稀释好的二抗,室温震荡孵育1 h。用新配制的1×PBST缓冲液洗涤3次,每次10 min。把ECL底物进行化学发光检测,并对其进行X线片曝光。显影定影处理后,胶片用扫描仪扫描,并使用Gel-Pro analyzer软件进行灰度分析定量[5]。
1.6 统计学分析应用SPSS 15.0统计软件进行分析,数据均采用 x±s表示,组间比较,先进行方差齐性检验,方差齐,采用单因素方差分析,方差不齐,采用Kruskal-walls test检验,检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 TPX2基因过表达慢病毒载体感染HeLa细胞后TPX2 mRNA和蛋白质的表达荧光定量PCR检测结果表明,空白对照组、阴性对照组及过表达组HeLa细胞中TPX2 mRNA的转录水平分别为(1.00±0.01)、(1.05±0.02)及(2.92±0.25);空白对照组及阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05),LV11-TPX2感染组明显高于空白对照组及阴性对照组(P < 0.05)。Western blot检测结果显示,空白对照组、阴性对照组及LV11-TPX2感染组HeLa细胞中TPX2蛋白的表达水平分别为(0.61±0.03)、(0.68±0.07)及(0.98±0.15);空白对照组及阴性对照组差异无统计学意义(P>0.05),LV11-TPX2感染组明显高于空白对照组及阴性对照组(P < 0.05, 图 1)。
2.2 重组慢病毒LV11-TPX2感染HeLa细胞前后细胞凋亡的变化
过表达组细胞的凋亡率为(17.30±2.47)%,阴性对照组细胞的凋亡率为(25.27±2.48)%,空白对照组细胞的凋亡率为(24.43±1.55)%;与空白对照组及阴性对照组比较,过表达组细胞凋亡率均明显减少(P < 0.05),阴性对照组和空白对照组比较差异无统计学意义(P>0.05,图 2)。
2.3 重组慢病毒LV11-TPX2对HeLa细胞侵袭的影响
过表达组穿过基底膜细胞数为(85.00±6.25)个,低于阴性对照组[(47.00±4.58)个]及空白对照组[(55.33±5.51)个, P < 0.05], 空白对照组与阴性对照组比较差异无统计学意义(P>0.05, 图 3)。
2.4 Western blot检测凋亡及侵袭相关蛋白Bcl-2、Caspase-3、Bax、TIMP-1、nm23-H1及MMP-9的表达
过表达组细胞中Bcl-2及MMP-9蛋白表达明显高于空白对照组及阴性对照组(P < 0.05),Caspase-3、Bax、TIMP-1及nm23-H1蛋白明显低于空白对照组及阴性对照组,差异有统计学意义(P < 0.05,图 4)。
3 讨论
TPX2基因位于人类染色体20q11.2,近年已被研究者们认为是一种癌基因,其表达受细胞周期严格调控,其蛋白质是一种对细胞有丝分裂纺锤体的形成和稳定起重要作用的微管相关蛋白[1]。在细胞有丝分裂过程中,它紧密结合于纺锤体,动力蛋白Xklp2受其作用被靶向附着在纺锤体微管上,从而维持了纺锤体的正常极性[6]。许多人类恶性肿瘤的发生与发展被研究认为与TPX2基因的异常表达有关。它在膀胱癌、食管癌、乳腺癌、肺癌、胃癌、前列腺癌、肝癌等多种肿瘤中都存在表达异常现象,其异常表达程度与肿瘤的恶性度密切相关 [7-13]。有研究认为TPX2致肿瘤机制可能是与其参与了细胞有丝分裂纺锤体形成缺陷及DNA异常损伤反应有关[2]。查阅国内外文献,目前对TPX2的研究主要局限于它对细胞功能的影响,对其作用机制探究较少。本课题通过TPX2过表达慢病毒载体在宫颈癌细胞过表达TPX2基因,来研究过表达TPX2对宫颈癌细胞的凋亡及侵袭的作用及其分子机制。
本课题组前期实验构建了人TPX2基因慢病毒表达载体,感染人宫颈癌细胞HeLa并筛选出TPX2基因过表达的人宫颈癌HeLa细胞稳定细胞株[4]。选取稳定感染过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)并有效过表达TPX2的HeLa细胞作为实验组即过表达组,将稳定感染慢病毒载体(LV11-NC)的HeLa细胞为阴性对照组,未感染病毒的人宫颈癌HeLa细胞作为空白对照组。流式细胞术检测各组细胞的凋亡情况显示,HeLa细胞感染慢病毒载体LV11-TPX2后,感染组细胞凋亡率显著减少,为了阐明其凋亡相关机制,本课题研究了感染LV11-TPX2前后凋亡相关蛋白Bax、Bcl-2和Caspase-3的表达,结果显示,HeLa细胞被高表达TPX2基因后,Bcl-2表达水平明显上升,Caspase-3及Bax表达水平明显下降,提示TPX2高表达致细胞凋亡率减少与TPX2高表达致Bcl-2表达上升、Bax和Caspase-3水平降低密切相关。Caspase-3、Bcl-2及Bax是细胞凋亡调控中最重要的3个基因,Caspase-3是凋亡激活早期阶段的关键因子,Bax是促凋亡基因,Bcl-2是抑制细胞凋亡因子[14],Caspase-3被激活后能分解其相应的底物,从而致使其失去了对DNA的修复作用,细胞因而转向凋亡[15]。Bax和Bcl-2以形成异源或同源二聚体来调控细胞凋亡过程。当Bax超表达于细胞内时,Bax/Bax同源二聚体的形成数量增多,增强了细胞死亡信号,从而凋亡被启动。当Bcl-2在细胞内超表达时,形成了Bcl-2/Bax异源二聚体则会阻止细胞凋亡,延长细胞的存活期。细胞内Bax与Bcl-2间的比例关系在细胞存亡方面起着关键作用。Bax和Bcl-2是Caspase-3的上游凋亡调控基因,过表达的Bcl-2能阻止Caspase-3的活化,进而阻断细胞凋亡[16]。本研究结果表明,在HeLa细胞高表达TPX2后,Bcl-2表达增强,表明其抑制凋亡能力增强,Bax表达下降,提示促凋亡因素减少,Caspase-3表达减少,提示凋亡早期间段激活的酶减少,最终致细胞凋亡率减少,肿瘤细胞的“永生化”增殖能力增强,恶性程度增高。
TPX2高表达是否影响肿瘤细胞的侵袭能力?本研究利用Transwell小室基底膜侵袭实验来研究这个问题。结果显示,HeLa细胞感染过表达慢病毒载体(LV11-TPX2)后,穿膜细胞数显著增加,且发现高表达TPX2基因后,侵袭相关蛋白MMP-9表达明显增加,TIMP-1和nm23-H1显著下调。MMP-9能降解肿瘤细胞外基质,使肿瘤细胞体内屏障被破坏,从而致肿瘤细胞浸润转移[17];TIMP-1是MMP-9的抑制剂,能抑制肿瘤细胞的浸润转移[18];nm23-H1是一种肿瘤转移抑制基因,它能磷酸化细胞肌球蛋白轻链进而抑制肿瘤细胞的侵袭和转移[19]。本研究显示,在HeLa细胞高表达TPX2后,nm23-H1及TIMP-1表达降低,其抑制肿瘤细胞侵袭能力减弱,MMP-9表达增强,终致细胞侵袭能力增强,恶性程度增高。
综上所述,在宫颈癌细胞高表达TPX2后,能显著抑制细胞凋亡,可能与其增强了Bcl-2的表达水平,降低了Bax和Caspase-3水平有关;高表达TPX2的宫颈癌细胞侵袭能力增强可能与其上调了MMP-9的表达水平,下调了nm23-H1及TIMP-1水平有关。本研究为临床宫颈癌基因治疗研究提供了一种思路,即在宫颈癌细胞抑制TPX2基因的表达,诱导肿瘤细胞凋亡进而降低其侵袭能力来达到抑制肿瘤细胞浸润转移的目的。本研究仅在体外对过表达TPX2对人宫颈癌HeLa细胞侵袭和凋亡的影响进行了研究,存在着一定的局限性,期待继续在动物体内进行其研究,进一步揭示其作用及机制。
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