0
文章快速检索  
高级检索
钠钙交换体亚型2在大鼠逼尿肌细胞中的表达与功能
钟晓1, 王平贤1, 胡文刚1, 王青青2, 李龙坤2, 黄赤兵1     
1. 400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院:泌尿外二科;
2. 400037 重庆,陆军军医大学(第三军医大学)第二附属医院:泌尿外一科
[摘要] 目的 检测大鼠逼尿肌细胞是否表达钠钙交换体亚型2(NCX2),并测试其功能。方法 10只大鼠(7只雌性,3只雄性)为实验对象,取膀胱组织为实验组,大脑组织为对照组。首先利用急性酶分离技术,制备和培养大鼠逼尿肌细胞,再采用反转录-聚合酶链式反应和免疫印迹技术,检测大鼠膀胱组织中是否表达NCX2基因及蛋白;免疫荧光技术进一步明确NCX2与逼尿肌细胞的关系;膜片钳技术测试逼尿肌细胞是否存在NCX2电流。结果 首先制备了光镜下以梭形为主,免疫组化染色α-actin呈阳性的逼尿肌细胞;利用逆转录-聚合酶链式反应,在大鼠大脑组织、膀胱组织中分别发现NCX2 mRNA表达;免疫印迹技术在上述组织中检测NCX2的蛋白相对表达量,差异均未见统计学意义;免疫荧光双抗进一步证实NCX2蛋白与逼尿肌细胞共表达;膜片钳检测到逼尿肌细胞上的NCX2电流,电流密度为(0.79±0.45) pA/pF。结论 发现NCX2表达于大鼠逼尿肌细胞,电生理证实NCX2具有维持逼尿肌细胞内钙离子平衡的能力,其生理作用需要进一步的探索。
[关键词] 大鼠     膀胱     平滑肌     钠钙交换体亚型2     膜片钳    
Expression of sodium/calcium exchanger subtype 2 and its physiological role in detrusor cells of rats
ZHONG Xiao1 , WANG Pingxian1 , HU Wengang1 , WANG Qingqing2 , LI Longkun2 , HUANG Chibing1     
1. First Department of Urology, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China;
2. Second Department of Urology, Second Affiliated Hospital, Army Medical University (Third Military Medical University), Chongqing, 400037, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation for Young Scholars of China (81400761)
Corresponding author: HUANG Chibing, E-mail: 13808303508@163.com
[Abstract] Objective To investigate the expression of sodium/calcium exchanger subtype 2 (NCX2) and explore its physiological role in detrusor cells of rats. Methods The bladder tissue was taken from 7 female and 3 male Wistar rats with the brain tissue as the control, and the detrusor cells were isolated from the bladder tissue using acute enzyme digestion technique. RT-PCR and Western blotting were used to detect the expression of NCX2 at mRNA and protein respectively in the bladder and brain tissues of the rats. Double-label immunofluorescence assay was used to verify the localization of NCX2 expression in the detrusor cells. NCX2 current was recorded using the whole-cell patch-clamp technique on the detrusor cells in the presence of the antagonist KB-R7943 (5 μmol/L). Results The acutely isolated detrusor cells showed predominantly a spindle-shaped morphology under microscope and were immunocytochemically positive for α-actin. NCX2 expression was detected in both the bladder and brain tissues of the rats with similar expression levels between the 2 tissues. Double-label immunofluorescence confirmed that NCX2 expression was localized on the detrusor cells, and NCX2 currents were detected in the detrusor cells with a current density of 0.79±0.45 pA/pF. Conclusion NCX2 is expressed on the detrusor cells of rats and the electrophysiological evidence obtained suggests that NCX2 contributes to the maintenance of intracellular calcium homeostasis in the detrusor cells, but its exact physiological role still needs further investigation.
[Key words] bladder     smooth muscle cells     sodium/calcium exchanger subtype 2     patch-clamp technique     rats    

近年,以尿频、尿急伴或不伴尿失禁等症状为主要临床表现的膀胱过度活动症(overactive bladder,OAB)的发病率呈现递增趋势[1],其中以逼尿肌过度活动(detrusor overactivity, DO)为主。目前对DO的研究,从分子水平上有所进展,提出了多种学说,例如异位起搏细胞、逼尿肌细胞自律性异常增高等,但仍然未能找到致病的关键。临床治疗主要以缓解症状为主。其中逼尿肌细胞的钙离子失衡导致自律性异常增高,一直是研究的重要方向[2]。课题组早期对于触发细胞内钙离子增高包括T型钙离子通道及其亚型[3]、钙池操控钙离子通道[4],均发现在DO中发挥作用。而平衡细胞内的排钙通道,包括NCX、内质网钙泵(sarco/endoplasmic reticulum Ca2+-ATPase,SERCA)研究较少。结合文献,我们认为钠钙交换体亚型2(NCX2),一类在脑细胞中发挥重要保护作用的排钙通道,是否也在逼尿肌细胞上表达,并发挥维持细胞内钙离子平衡的作用。因此,本研究利用RT-PCR、免疫印迹及免疫荧光探查逼尿肌细胞是否表达NCX2,同时进一步利用膜片钳技术鉴定其功能。

1 材料与方法 1.1 动物

10只正常成年Wistar大鼠(2月龄),雌雄不拘(7只雌性,3只雄性),体质量200~220 g,购自陆军军医大学(第三军医大学)第三附属医院(野战外科研究所)实验动物中心。取膀胱组织为实验组,大脑组织为对照组。实验符合陆军军医大学(第三军医大学)动物实验伦理要求。

1.2 主要试剂和仪器

Orion 720A pH计(Orion公司,美国),倒置相差显微镜(Olympus公司,日本),纯水仪(Millipore公司,法国),EPC-10膜片钳放大器、Pulse膜片钳采样软件(Heka公司,德国),细胞灌流槽(Warner公司,美国),细胞灌流装置(自制),软质玻璃电极毛坯(Drummond公司,美国),三维定向推进器、PC-10垂直式电极拉制仪(Narishige公司,日本)。TCS-SP5共聚焦显微镜(Leica公司,德国),胶原酶H、木瓜蛋白酶、无钙Hanks液、DTE、大豆胰蛋白酶抑制剂、BSA、Iberiotoxin等试剂和化学药品均为美国Sigma公司产品,DMOG(Gayman公司),Trizol细胞总RNA提取试剂(Fermentas公司),RT-PCR试剂盒,TaKaRa Taq酶(TaKaRa公司),采用的引物由天津TaKaRa合成,DMEM培养基、胎牛血清(HyClone公司,美国),抗体和免疫荧光实验相关试剂购于北京中山公司和英国Abcam公司,阻滞剂KB-R7943(Sigma公司,美国)。

1.3 分离细胞的原代培养和免疫组化染色鉴定

细胞分离方法参考文献[5],整个过程需要无菌操作。将分离好的细胞加入含有胎牛血清的DMEM培养基上置于37 ℃培养孵箱中培养。滴加1 :100稀释的SM-α-actin单克隆抗体(一抗),置37 ℃反应1 h后,转入4 ℃过夜。滴加1 :50稀释的FITC标记的二抗,湿盒中37 ℃孵育1 h后,用PBS清洗。置于显微镜下观察、拍照,鉴定染色结果。

1.4 逆转录-聚合酶链式反应(RT-PCR)

按照Trizol试剂使用说明, 提取膀胱组织和对照大脑组织总RNA。逆转录反应操作按照试剂说明进行。NCX2上游引物: 5′-GCTGGCCTTCTCGGTCACAC-TG-3′, 下游引物: 5′-GGCTGGCGAAGAGAATGTAGA-GG-3′, 片段大小173 bp;GAPDH上游引物:5′-ACGGGAAGCTCACTGGCATGG-3′, 下游引物: 5′-GCCGCCTGCTTCACCACCTTCT-3′, 片段大小124 bp。扩增条件: 95 ℃变性5 min→95 ℃ 75 s→58 ℃ 60 s, 72 ℃ 60 s (30个循环)→72 ℃ 10 min, 扩增产物在同一张琼脂糖凝胶上进行电泳。采用凝胶成像分析仪(Fluors-TM Multimage,BIORAD公司)及图像分析软件(PDQuest,BIORAD公司)对电泳条带进行灰度分析,以GAPDH作为内参照,计算NCX2相对表达值。

1.5 蛋白印迹和免疫荧光

提取膀胱组织和对照组大脑组织,参照既往实验的方法[5]。等量蛋白质分别采用12%或5% SDS-聚丙烯酰胺凝胶垂直电泳进行分离,转膜,摇动封闭(TBST+5%脱脂奶粉)1 h,洗膜后加入兔抗NCX2多克隆抗体(1 :1 000稀释),4 ℃过夜,洗膜后加入辣根过氧化物酶,用化学发光底物进行发光显迹。免疫荧光采用兔抗NCX2多克隆抗体(1 :200稀释)联合抗大鼠平滑肌单克隆抗体(1 :200稀释)4 ℃过夜,然后莱卡TCS-SP5共聚焦显微镜观察。

1.6 膜片钳检测NCX2电流

参照既往实验方案[5],将培养好的大鼠膀胱平滑肌细胞采用全细胞膜片电压钳制技术记录钠钙交换体(Na+/Ca2+,NCX)电流。细胞静息电位为-40 mV,采用斜坡刺激从-100~+50 mV,时程1 600 ms,可以得到一内向电流,为包括NCX在内的排除细胞内钙离子的电流,经NCX阻滞剂KB-R7943(5 μmol/L)前后相减所得电流差值即为NCX电流。

1.7 统计学方法

采用SPSS 18.0统计软件,符合正态分布的计量资料数据以x±s表示,进行独立样本t检验和配对t检验。以P < 0.05为差异有统计学意义。

2 结果 2.1 细胞的分离与鉴定

急性分离的大鼠膀胱逼尿肌细胞,在倒置显微镜下观察,膀胱平滑肌细胞呈蚯蚓状、纺锤状、圆棒状等多种形态,细胞长度为50~200 μm。细胞原代分离培养3 d后,可见细胞贴壁伸展,细胞形态大小不一,呈梭形、不规则形、三角形或扇形,核卵圆形、居中,倒置显微镜下观察到7 d后细胞生长旺盛,形态同前(图 1A)。免疫组化染色检测到细胞SM-α-actin呈阳性反应,光镜下观察梭形细胞胞浆内见纵行排列的棕黄色丝状物(图 1B)。

A:原代培养7 d(×100);B:SM-α-actin阳性细胞(×400) 图 1 原代细胞培养及逼尿肌细胞鉴定

2.2 RT-PCR、蛋白印迹检测两组NCX2的表达

RT-PCR检测NCX2 mRNA表达显示,大鼠膀胱组织NCX2 mRNA表达为大脑组织的1.03倍,差异无统计学意义(P > 0.05,图 2A)。蛋白印迹实验显示,大鼠膀胱与脑组织NCX2的蛋白表达水平分别为(0.64±0.18)、(0.76±0.21),两组间差异无统计学意义(P > 0.05,图 2B)。

A:NCX2 mRNA表达  1:标准,2:实验组,3:对照组;B:NCX2的蛋白表达  1:实验组,2:对照组 图 2 RT-PCR和免疫印迹检测大鼠膀胱及大脑组织NCX2 mRNA与蛋白表达

2.3 免疫荧光鉴定NCX2与逼尿肌细胞共表达

共聚焦显微镜观察可见:逼尿肌细胞呈梭形、不规则形,表面荧光染色为绿色;NCX2表达呈现红色;细胞核卵圆形、梭形居中呈蓝色;图像融合后NCX2表达于逼尿肌细胞表面呈金黄色(图 3)。

A:Myosin蛋白;B:NCX2;C:DAPI;D:融合 图 3 共聚焦显微镜观察NCX2与Myosin蛋白共同表达于大鼠逼尿肌细胞上

2.4 膜片钳检测NCX2的电流

膜片钳检测到逼尿肌细胞在+40 mV时NCX电流为(2.85±0.52)pA/pF,加入KB-R7943(5 μmol/L)后在+40 mV时NCX电流为(2.07±0.44)pA/pF。膜片钳倒置显微镜下逼尿肌细胞形态见图 4。加入与未加入阻滞剂的两者电流相减,为逼尿肌细胞NCX2的电流大小,电流密度为(0.79±0.45)pA/pF。

图 4 逼尿肌细胞形态  (倒置显微镜×400)

3 讨论

膀胱过度活动症,是泌尿外科门诊最常见的排尿功能障碍疾病。其中逼尿肌不稳定是临床上膀胱过度活动症的最常见原因,表现为膀胱储尿期出现的逼尿肌异常收缩[6]。前列腺增生和膀胱颈抬高,分别是男性和女性发病的常见诱因,它们均会造成膀胱出口的部分梗阻(partial bladder outlet obstruction, PBOO)。因此,利用膀胱出口部分梗阻方法,建立逼尿肌不稳定疾病模型,是国内外公认的研究方法。但目前,逼尿肌不稳定的发病机制不明,出现了众多学说,如异常起搏细胞、胆碱能受体异常、钙离子失衡等[7-9]。临床上以盆底训练、胆碱能受体拮抗剂、钙通道阻滞剂等综合治疗为主。虽然治疗后症状缓解达70%~75%,但随着时间的推移,患者依从性逐渐减弱,是导致这类疾病复发或加重的重要因素之一。因此,研究逼尿肌不稳定的发病机制是研发潜在治疗药物和手段的重要方向,对于预防DO的发生,或进一步长期而有效地控制疾病的发展至关重要,一直是尿动力学研究的热点和难点。

在PBOO所致的逼尿肌不稳定模型中,尿潴留膀胱内压力增高, 引起血管阻力增加, 使膀胱缺血缺氧;排空后膀胱压下降,血流恢复,膀胱血流出现再灌注变化[10]。本课题组既往利用PBOO模型,在大鼠膀胱中发现尿潴留后组织内ROS含量增高,逼尿肌收缩力下降[11];应用超氧化物歧化酶(SOD)可以预防和改善尿潴留后逼尿肌的收缩能力,证实了PBOO与逼尿肌细胞缺血缺氧有关[12]。LIN等[13]通过组织形态学改变及化学发光法观察组织活性氧形成, 发现膀胱自身组织(上皮、逼尿肌及间叶组织)及血液中中性粒细胞均参与活性氧形成。并进一步推测随着活性氧的增高,可能通过引发细胞内线粒体功能障碍,导致膜内外钙离子交换失衡,而诱发逼尿肌细胞的异常收缩。

钙离子是细胞内外最常见的信号传递因子,在平滑肌细胞的兴奋-收缩偶联机制中发挥重要作用。细胞内钙离子的失衡,一方面由于细胞表面钙离子进入增多,如在大鼠的支气管哮喘模型中,ROS引发的细胞内钙离子闪烁,是支气管平滑肌细胞异常兴奋的机制[14];另一方面则由于胞内钙离子排除减少导致。目前发现心肌细胞主要通过4个通路维持胞内钙稳态:SERCA、NCX、细胞膜上钙泵、线粒体的钙转运体。在兔心肌细胞中, 细胞内70%的Ca离子由SERCA重吸收, 28%的钙离子通过NCX正向转运模式排钙[15],因此研究NCX的正向模式有重要意义。当细胞膜电位高于逆转电位时, NCX处于正向模式, 将Ca离子外排。目前尚缺乏研究正向模式的特异性阻滞剂,因此在本实验中用NCX2的反向模式来反向证实其正向能力。有研究显示,在缺氧条件下,肺动脉平滑肌细胞NCX排钙能力减低,激活反向模式,加重细胞内钙离子负担[16]。因此,研究更集中于NCX反向模式所致的细胞内钙超载机制。

目前已发现并能实现克隆的NCX成员有3大家族,血管平滑肌中NCX主要亚型为NCX1和NCX2。前期本课题组在膀胱ICC样细胞中证实NCX3的存在[5],并推测其对于调控膀胱兴奋性发挥作用。NCX2被认为限定表达于脑组织和骨骼肌组织中[17]。本研究证实NCX2也表达于膀胱逼尿肌上。NCX1与NCX2在功能上可能存在较大差异。在血管平滑肌细胞的研究中发现,NCX1可能在原发性高血压、肺动脉高压、平滑肌细胞增殖等具有重要作用[15]。在大脑缺血再灌注模型中,NCX2则发挥重要的脑细胞保护作用[18]。本研究在逼尿肌细胞上虽然证实了NCX2的存在,利用电生理证实具有排除细胞内钙离子能力,发挥平衡逼尿肌细胞内钙离子的重要作用,从而保护逼尿肌细胞。但在预实验阶段并没有在PBOO的动物模型中发现NCX2的表达显著增高。因此,在膀胱中,我们并不确定NCX2是否能发挥类似大脑细胞中的缺血再灌注保护机制,或者参与其他疾病的发生和发展。未来,对NCX2在逼尿肌细胞中的作用,还需要通过进一步建立相关疾病的动物模型来验证。

参考文献
[1] IRWIN D E, MILSOM I, HUNSKAAR S, et al. Population-based survey of urinary incontinence, overactive bladder, and other lower urinary tract symptoms in five countries: results of the EPIC study[J]. Eur Urol, 2006, 50(6): 1306–1314. DOI:10.1016/j.eururo.2006.09.019
[2] SUI G, FRY C H, MALONE-LEE J, et al. Aberrant Ca2+ oscillations in smooth muscle cells from overactive human bladders[J]. Cell Calcium, 2009, 45(5): 456–464. DOI:10.1016/j.ceca.2009.03.001
[3] FRY C H, JABR R I. T-type Ca2+ channels and the urinary and male genital tracts[J]. Pflugers Arch, 2014, 466(4): 781–789. DOI:10.1007/s00424-014-1446-x
[4] ZHAO B, ZHONG X, BAI X, et al. Changes in store-operated calcium channels in rat bladders with detrusor overactivity[J]. Urology, 2014, 84(2): 491–491. DOI:10.1016/j.urology.2014.05.007
[5] ZHONG X, DENG J, HE P, et al. Reverse mode of the sodium/calcium exchanger subtype 3 in interstitial cells of Cajal from rat bladder[J]. Urology, 2013, 82(1): 254–257. DOI:10.1016/j.urology.2013.02.049
[6] RACHANENI S, ARYA P, LATTHE P. Urinary nerve growth factor: a biomarker of detrusor overactivity? A systematic review[J]. Int Urogynecol J, 2013, 24(10): 1603–1609. DOI:10.1007/s00192-013-2104-0
[7] JUSZCZAK K, MACIUKIEWICZ P, DREWA T, et al. Cajal-like interstitial cells as a novel target in detrusor overactivity treatment: true or myth?[J]. Cent European J Urol, 2014, 66(4): 413–417. DOI:10.5173/ceju.2013.04.art5
[8] MANSFIELD K J, LIU L, MOORE K H, et al. Molecular characterization of M2 and M3 muscarinic receptor expression in bladder from women with refractory idiopathic detrusor overactivity[J]. BJU Int, 2007, 99(6): 1433–1438. DOI:10.1111/j.1464-410X.2007.06866.x
[9] DENG J, HE P, ZHONG X, et al. Identification of T-type calcium channels in the interstitial cells of Cajal in rat bladder[J]. Urology, 2012, 80(6): 1389.e1–7. DOI:10.1016/j.urology.2012.07.031
[10] SAITO M, MIYAGAWA I. Bladder dysfunction after acute urinary retention in rats[J]. J Urol, 2001, 165(5): 1745–1747. DOI:10.1097/00005392-200105000-00093
[11] 李文刚, 方强, 杨景, 等. 活性氧在急性尿潴留大鼠膀胱功能损害中的作用研究[J]. 第三军医大学学报, 2005, 27(4): 331–333.
LI W G, FANG Q, YANG J, et al. Roles of reactive oxygen species in acute retention bladder in rats[J]. J Third Mil Med Univ, 2005, 27(4): 331–333. DOI:10.3321/j.issn:1000-5404.2005.04.015
[12] 李文刚, 方强, 卢根生, 等. 急性尿潴留大鼠膀胱组织黄嘌呤氧化还原酶活性变化及其意义[J]. 第三军医大学学报, 2006, 28(9): 973–975.
LI W G, FANG Q, LU G S, et al. Changes of xod activity induced by acute urinary retention in rats[J]. J Third Mil Med Univ, 2006, 28(9): 973–975. DOI:10.3321/j.issn:1000-5404.2006.09.033
[13] LIN A T, CHEN K K, YANG C H, et al. Mannitol facilitates rabbit urinary bladder recovery from overdistension injury[J]. Urology, 2000, 56(4): 702–707. DOI:10.1016/S0090-4295(00)00702-0
[14] TUO Q R, MA Y F, CHEN W, et al. Reactive oxygen species induce a Ca2+-spark increase in sensitized murine airway smooth muscle cells[J]. Biochem Biophys Res Commun, 2013, 434(3): 498–502. DOI:10.1016/j.bbrc.2013.03.102
[15] SHATTOCK M J, OTTOLIA M, BERS D M, et al. Na+/Ca2+ exchange and Na+/K+-ATPase in the heart[J]. J Physiol, 2015, 593(6): 1361–1382. DOI:10.1113/jphysiol.2014.282319
[16] ZHANG S, DONG H, RUBIN LJ, et al. Upregulation of Na+/Ca2+ exchanger contributes to the enhanced Ca2+ entry in pulmonary artery smooth muscle cells from patients with idiopathic pulmonary arterial hypertension[J]. Am J Physiol, Cell Physiol, 2007, 292(6): C2297–C2305. DOI:10.1152/ajpcell.00383.2006
[17] NISHIYAMA K, AZUMA Y T, MORIOKA A, et al. Roles of Na+/Ca2+ exchanger isoforms NCX1 and NCX2 in motility in mouse ileum[J]. Naunyn Schmiedebergs Arch Pharmacol, 2016, 389(10): 1081–1090. DOI:10.1007/s00210-016-1271-1
[18] KHAKSAR S, BIGDELI M R. Anti-excitotoxic effects of cannabidiol are partly mediated by enhancement of NCX2 expression in animal model of cerebral ischemia[J]. Eur J Pharmacol, 2017, 794: 270–279. DOI:10.1016/j.ejphar.2016.11.011
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201710150
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

钟晓, 王平贤, 胡文刚, 王青青, 李龙坤, 黄赤兵.
ZHONG Xiao, WANG Pingxian, HU Wengang, WANG Qingqing, LI Longkun, HUANG Chibing.
钠钙交换体亚型2在大鼠逼尿肌细胞中的表达与功能
Expression of sodium/calcium exchanger subtype 2 and its physiological role in detrusor cells of rats
第三军医大学学报, 2018, 40(4): 302-306
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(4): 302-306
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201710150

文章历史

收稿: 2017-10-23
修回: 2017-11-02

相关文章

工作空间