ZHOU Lin, E-mail:linzhou65@hotmail.com
肾脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤是临床最常见的急重症之一。近年来，随着灾害、创伤复合伤及各类介入手术的增加，其发病率呈逐年上升趋势。在常规住院患者中发生率为3%~7.2%，重症监护病房(ICU)患者中发生率为5%~30%，病死率更是高达28%~82%，并且预后不良[1-2]，造成严重的社会经济和家庭负担。近曲小管细胞受损是肾脏缺血再灌注损伤的主要病理基础[3]，但是其小管损伤的具体调控分子机制尚不清楚。因此，明确近曲小管细胞损害发生机制，寻找有效干预靶点，阻断I/R损伤的最终发生，对于肾脏器官功能保护具有重大意义。
G蛋白偶联受体激酶(G protein-coupled receptor kinase 4，GRK)家族是一类丝氨酸/苏氨酸激酶，由7种亚型组成，其中GRK4主要在肾脏等组织中高丰度表达[4]。我们前期研究发现，GRK4参与了原发性高血压在内多种慢性心血管和肾脏疾病的发生，其机制可能与GRK4激活肾脏内肾素-血管紧张素系统(renin-angiotensin system，RAS)及增加AT1R介导的尿钠排泄障碍有关[5-6]。但是，GRK4是否参与调控急性肾脏缺血再灌注损伤的发生，目前尚不清楚。因此，本研究通过建立GRK4转基因小鼠急性肾脏I/R模型，探讨GRK4对肾脏急性缺血再灌注损伤的影响及其作用机制。
1 材料与方法 1.1 实验材料人源性GRK4转基因C57BL/6小鼠由北京华夏凯奇生物技术有限公司构建和鉴定。GRK4、AT1R兔源性抗体购于美国Santa Cruz公司。磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase，GAPDH)兔源抗体购于武汉三鹰公司。山羊抗兔IRDye800 CW二抗购于美国LI-COR生物科技公司。TUNEL细胞凋亡检测试剂盒(in situ cell death detection kit，POD)购自罗氏公司。总超氧化物歧化酶(superoxide dismutase，SOD)检测试剂盒(WST-8法)、脂质氧化(MDA)检测试剂盒(lipid peroxidation MDA assay kit)购于南京建成生物科技公司。RIPA细胞裂解液(RIPA lysis buffer)、蛋白质BCA法定量试剂盒、乙二胺四乙酸(EDTA)-柠檬酸钠抗原修复液、4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液和抗荧光淬灭封片剂购自碧云天生物科技公司。苏木精、伊红购于美国Sigma公司。戊巴比妥钠、PBS、多聚甲醛等均为市售分析纯。
1.2 动物模型的制备与分组选取SPF级饲养条件，健康野生型小鼠[8周龄，体质量(21.34±0.42)g]和GRK4转基因型C57BL/6小鼠[8周龄，体质量(21.87±0.68)g]各12只，由第三军医大学大坪医院实验动物中心提供[合格证号SCXK(渝)2012-0005]。各型分别按随机数表法分为4组(n=6)：野生型假手术对照组、野生型肾脏缺血再灌注损伤组、GRK4转基因型假手术对照组、GRK4转基因型肾脏缺血再灌注损伤组。构建肾脏缺血再灌注损伤模型前[7]，小鼠禁食24 h。1 %戊巴比妥钠水溶液、60 mg/kg腹腔注射麻醉小鼠，麻醉后剃净腹部毛发，将小鼠固定于恒温加热台，碘伏消毒腹部皮肤切口区域，腹部中央行剖腹术，游离暴露一侧肾门部结扎肾动脉和输尿管，切除该侧肾脏，留取肾脏组织标本。暴露对侧肾脏的肾门部分离肾动脉，用微动脉夹将肾动脉进行咬合夹闭造成肾脏缺血，肾脏由鲜红色变为紫黑色，假手术对照组肾门不夹闭。缺血夹闭45 min后，松开血管夹，见肾脏由紫黑色恢复鲜红色，表明成功恢复血流灌注。腹腔放入约1 mL温生理盐水，缝合切口后放回笼中恢复。术后小鼠正常进食水24 h后，经眼球静脉丛取血。将肾脏组织纵向剖开，一部分于4%多聚甲醛中固定，其余肾脏冻存于-80 ℃冰箱。
1.3 肾脏功能检测将静脉血标本以3 000 r/min离心10 min，分离上层血清。由第三军医大学大坪医院检验科采用Analyzer Medical Systems SaBa18全自动生化分析仪，测定血清肌酐、血尿素氮等肾脏功能指标。
1.4 肾脏组织病理检查和损伤评分用4%多聚甲醛溶液固定肾脏组织24 h，常规脱水、石蜡包埋、切片厚度4 μm，二甲苯脱蜡、酒精透明、HE染色、中性树胶封片剂封片。在光学显微镜下，每张切片选取肾皮质区10个视野，采用两人盲法，随机拍照观察肾脏组织的损伤病理改变。在显微镜下观察小管细胞变性死亡、出现管型的所占比例，进行小管损伤半定量病理评分[8]。具体评分标准为：0分为正常；1分为≤10%；2分为11%~25%；3分为26%~50%；4分为51%~75%；5分为≥75%，400倍镜下按象限各选取3个视野评分，并取评分的算术平均值。
1.5 TUNEL试剂盒检测肾小管细胞凋亡情况将肾脏组织石蜡切片常规脱蜡后，放入乙二胺四乙酸(EDTA)柠檬酸钠抗原修复液中，微波炉加热15 min。用磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤3次，在标本上滴加50 μL TUNEL检测液(含有2 μL TdT酶、48 μL荧光标记液)，避光37 ℃孵育1 h，PBS洗涤3次。4，6-二脒基-2-苯基吲哚(4，6-diamidino-2-phenylindole，DAPI)染液50 μL染核1 min，PBS洗涤3次，抗荧光淬灭封片剂封片。在荧光显微镜下观察，每张切片在400倍镜下选取皮质区6个视野，计数小管细胞凋亡数，并取计数的算术平均值。
1.6 肾脏组织氧化应激指标检测根据总SOD和MDA检测试剂盒说明书，利用酶联免疫吸附实验法分别测定肾脏组织中总SOD和MDA含量，结果用组织总蛋白浓度进行校正，总SOD活性单位为U/mg，MDA含量单位为nmol/mg。
1.7 蛋白质免疫印迹检测GRK4及AT1R的表达称取肾脏组织80 μg放入玻璃研磨匀浆器中，加入400 μL RIPA细胞裂解液，经超声破碎和冰上裂解后，4 ℃ 12 000×g离心40 min，取上清为各组提取的肾脏组织的总蛋白。采用蛋白质BCA定量法(碧云天)测定蛋白质浓度。取等体积2倍上样缓冲液混合后100 ℃煮沸10 min。将100 μg变性后的蛋白质进行十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)电泳分离，湿转至硝酸纤维素(nitrocellulose blotting membranes，NC)膜，含5 %脱脂奶粉TBST溶液室温下封闭1 h。分别用兔源性GRK4抗体(Santa Cruz，1 :500)、AT1R抗体(Santa Cruz，1 :500)和GAPDH(武汉三鹰，1 :1 000)4 ℃孵育过夜。室温复温30 min后，TBST 10 min/次、洗涤3次，羊抗兔IRDye800二抗(1 :10 000)室温孵育1 h，TBST 10 min/次、洗涤3次。采用美国LI-COR公司的Odyssey双色红外荧光成像系统，扫描确定分析蛋白条带。结果经过Quantity One软件对条带面积的灰度值分析，以内参GAPDH灰度的比值校正作为相对浓度，进行定量分析。
1.8 统计学分析采用SPSS 23.0软件分析，计量资料结果以x±s表示；计量资料两组间比较采用两独立样本t检验；多组间比较采用双因素方差分析。
2 结果 2.1 肾脏缺血再灌注损伤后GRK4蛋白表达量增高野生型小鼠的实验结果表明，与假手术对照组相比，缺血再灌注损伤后的肾脏功能受损，血清中的肌酐[(172.79±6.94)vs(23.88±5.18)μmol/L，P < 0.05]和尿素氮[(45.41±6.53)vs(7.17±0.81)mmol/L，P < 0.05]均出现明显升高，差异具有统计学意义，表明成功建立了小鼠肾脏缺血再灌注损伤模型。同时，与假手术对照组对比，缺血再灌注损伤组小鼠肾脏组织中GRK4蛋白的相对表达量[(2.30±0.05)vs(1.04± 0.13)，P < 0.05]出现明显上升，差异具有统计学意义，提示GRK4可能参与了缺血再灌注后肾脏损伤的发生，如图 1所示。
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| 1：野生型假手术对照组；2：野生型缺血再灌注损伤组 图 1 蛋白质免疫印迹检测肾脏缺血再灌注损伤对小鼠肾脏功能和GRK4蛋白表达量的影响 |
2.2 过表达GRK4加重肾脏缺血再灌注后小鼠肾功能损伤
进一步在GRK4转基因小鼠上研究结果发现，与野生型小鼠缺血再灌注组比较，GRK4转基因型小鼠缺血再灌注组血清中肌酐[(263.30±12.68)vs (172.79±6.94) μmol/L，P < 0.05]和尿素氮[(68.19± 5.93)vs(45.41±6.53) mmol/L，P < 0.05]明显升高，提示过表达GRK4加重肾脏缺血再灌注后肾功能损伤，见图 2。
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| A：血肌酐含量；B：血尿素氮含量 a：P < 0.05，与假手术对照组比较；b：P < 0.05，与野生型小鼠比较 图 2 过表达GRK4对肾脏缺血再灌注后小鼠血肌酐、血尿素氮的影响(n=6，x±s) |
2.3 过表达GRK4促进肾脏缺血再灌注后病理结构损伤
观察光镜下肾脏组织病理切片，假手术对照组肾脏组织结构均无明显损伤。野生型小鼠缺血再灌注损伤组的肾脏皮质区结构有明显损伤，肾小管所在肾脏间质出现充血、蛋白管型，局部肾小管上皮细胞出现固缩死亡和炎性细胞浸润。与野生型小鼠缺血再灌注损伤组对比，GRK4转基因型小鼠缺血再灌注损伤组的肾脏病理损伤更加严重，肾小管内出现大量蛋白管型、肾间质明显出血、肾小管细胞出现大面积死亡，镜下可见炎症细胞大量浸润。肾小管病理损伤评分结果[(3.59±0.41)vs(2.33±0.51)，P < 0.05]，与光镜观察结果一致，差异具有统计学意义，提示过表达GRK4可以促进缺血再灌注后肾脏病理结构的损伤，见图 3。
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| 红色箭头示肾间质充血；白色箭头示蛋白管型；黑色箭头示死亡细胞；蓝色箭头示炎性细胞浸润 图 3 HE染色检测过表达GRK4对肾脏缺血再灌注损伤后小鼠肾脏病理结构的改变 |
2.4 过表达GRK4加重肾脏缺血再灌注后氧化应激和细胞凋亡
与野生型假手术对照组比较，野生型小鼠缺血再灌注损伤组的肾脏组织中，总SOD明显下降[(73.82± 5.47)vs(105.38±9.79)U/mg，P < 0.05]、MDA含量升高[(13.15±0.81)vs(6.37±0.54)nmol/mg，P < 0.05]，差异有统计学意义，提示缺血再灌注损伤引起肾脏氧化应激水平升高。对比野生型小鼠缺血再灌注损伤组，GRK4转基因型小鼠缺血再灌注损伤组肾脏中总SOD降低[(46.42±5.23)vs(73.82±5.47)U/mg，P < 0.05]、MDA含量升高[(16.55±0.85)vs(13.15±0.81)nmol/mg，P < 0.05]更为明显，差异有统计学意义(图 4)。细胞凋亡发生与氧化应激水平的增高密切相关，进一步观察肾脏组织切片TUNEL染色发现，假手术对照组小鼠的肾脏组织内均未见明显细胞凋亡。但是，野生型小鼠缺血再灌注损伤组肾脏组织中，TUNEL阳性凋亡细胞数目增多；GRK4转基因型小鼠缺血再灌注损伤组的肾脏中，凋亡小管细胞数目增加更为明显，差异有统计学意义(P < 0.05)，提示过表达GRK4增加了肾脏缺血再灌注损伤后肾脏氧化应激，促进细胞凋亡的发生，加重肾脏小管细胞的丢失，如图 5所示。
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| A：SOD含量；B：MDA含量 a：P < 0.05，与假手术对照组比较；b：P < 0.05，与野生型缺血再灌注损伤组比较 图 4 过表达GRK4对肾脏缺血再灌注后小鼠肾脏氧化应激的影响(n=6，x±s) |
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| 图 5 过表达GRK4对肾脏缺血再灌注后小鼠肾脏细胞凋亡的影响(TUNEL ×400) |
2.5 过表达GRK4促进肾脏AT1R蛋白表达、加重肾脏组织的氧化应激
组织细胞内RAS系统的激活与氧化应激、调控凋亡密切相关，检测肾脏组织RAS系统中关键蛋白AT1R的表达发现，与野生型小鼠假手术对照组相比，GRK4转基因型小鼠假手术对照组的肾脏AT1R蛋白表达量出现明显增高[(1.75±0.05)vs(0.89±0.04)，P < 0.05]，差异有统计学意义，提示过表达GRK4可以促进AT1R表达量增加。与假手术对照组对比，肾脏AT1R蛋白表达在缺血再灌注损伤后升高；与野生型小鼠缺血再灌注损伤组比较，过表达GRK4小鼠肾脏缺血再灌注损伤后，肾脏组织中AT1R蛋白表达量升高更加明显[(3.92±0.06)vs(2.31±0.09)，P < 0.05]，差异有统计学意义，提示肾脏缺血再灌注损伤后，过表达GRK4可以促进AT1R表达，增加肾脏组织内氧化应激水平，加重肾脏小管细胞凋亡、损伤发生，如图 6所示。
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| 1：野生型假手术对照组；2：野生型缺血再灌注损伤组；3：GRK4转基因型假手术对照组；4：GRK4转基因型缺血再灌注损伤组 图 6 蛋白质免疫印迹检测过表达GRK4对缺血再灌注损伤后小鼠肾脏AT1R蛋白表达量的影响 |
3 讨论
肾脏缺血再灌注(ischemia-reperfusion，IR)损伤是临床心肌梗死、心力衰竭、休克后，以及围术期(如心脏手术、大血管手术、肾部分切除术和肾移植等)术后常见重要并发症[1-2]，是急性缺血性肾功能衰竭的重要损伤环节，同时也是高血压肾病肾功能损伤的重要因素。既往研究表明GRK家族参与了多种慢性肾脏和心血管疾病的发生过程[9]，但其是否调控急性肾脏缺血再灌注损伤，目前尚不清楚。
本课题建立C57BL/6小鼠肾脏缺血再灌注动物模型，采用ALC-HTP动物恒温系统控制实验小鼠体温于37 ℃，保证动物模型的稳定性。肾脏缺血再灌注损伤后，缺血再灌注组小鼠血肌酐和血尿素氮，均比假手术对照组明显升高；HE染色、TUNEL染色发现肾小管上皮细胞严重变性、炎细胞浸润和凋亡细胞增加；我们检测了缺血再灌注损伤后肾脏组织中GRK4的改变，发现其蛋白表达量出现明显升高。为了证明GRK4在缺血再灌注损伤中的作用，我们成功构建了GRK4转基因型小鼠。在过表达GRK4小鼠上，进一步证实其在肾脏缺血再灌注损伤中作用及机制。
GRK4是GRK激酶家族主要成员之一，GRK家族是体内一类重要的丝氨酸/苏氨酸激酶，该家族具有7个亚型。其中，GRK1和GRK7主要分布在视网膜；GRK2、GRK3、GRK5和GRK6在机体表达广泛；而GRK4则分布局限，主要在肾脏等器官中表达丰富，主要存在于皮质区的近曲小管细胞中[10]。在既往研究中发现，心脏中表达丰富的GRK2可以明显加重心肌梗死后细胞死亡，抑制GRK2可保护缺血后心肌细胞丢失[11]。本研究发现小鼠过表达GRK4后可明显加重肾脏I/R损伤。与野生型小鼠缺血再灌注损伤组相比，GRK4过表达小鼠再灌注24 h后，血清中肌酐和尿素氮明显升高；同时肾脏病理形态学损伤也更加严重，小管内出现了大量蛋白管型、肾间质明显出血、肾小管细胞出现大面积死亡、镜下可见炎症细胞大量浸润，肾小管病理损伤评分结果也与光镜观察结果一致。这些结果均证实，GRK4在肾脏I/R损伤中扮演了促进损伤的角色和作用。
肾脏缺血再灌注损伤发病机制复杂，目前认为多种分子及细胞内信号通路参与其中，主要包括再灌注诱发RAS系统激活，造成细胞内大量活性氧(ROS)爆发，导致细胞炎症、凋亡和坏死的增加[12-13]。有研究认为肾脏损伤时肾小管上皮细胞损伤有坏死和凋亡同时发生，二者在其中的作用取决于肾脏损伤的严重程度[14-15]。在本实验中，缺血再灌注损伤后小鼠肾脏组织内细胞凋亡指标明显升高，支持细胞凋亡在缺血再灌注损伤中的具有重要作用的观点。为研究GRK4的激活是否造成肾小管上皮细胞的凋亡，我们对GRK4转基因型小鼠肾脏缺血再灌注损伤后进行凋亡检测，发现过表达GRK4的肾脏组织，缺血再灌注损伤后TUNEL阳性凋亡数目明显增加，提示GRK4可以促进肾脏缺血再灌注损伤后肾脏组织中细胞凋亡的发生。
大量研究显示，细胞内氧化应激与凋亡发生密切相关，组织中RAS系统的激活可以明显加重氧化应激和凋亡的发生[16-17]。我们前期研究也发现，使用RAS系统抑制剂阿列吉伦，可以降低细胞内氧化应激和凋亡，缓解肾脏缺血再灌注损伤[18]。为研究GRK4是否促进肾脏缺血再灌注损伤后细胞氧化应激和RAS系统的激活，本研究发现对比野生型小鼠，GRK4转基因型小鼠肾脏缺血再灌注损伤后，抗氧化酶SOD的活力下降、脂质氧化产物MDA上升，氧化应激水平加重。我们进一步研究发现，GRK4转基因型小鼠可以促进AT1R含量增高；而肾脏缺血再灌注损伤后，肾脏AT1R含量进一步增加。提示肾脏缺血再灌注损伤后，GRK4可以通过上调肾脏AT1R表达，促进小管细胞氧化应激的加重、增加肾脏细胞凋亡的发生。
综合本文实验结果表明，GRK4可以明显加重肾脏缺血再灌注损伤，其机制可能与上调AT1R的表达、增加细胞氧化应激和凋亡有关。但是，GRK4在肾脏缺血再灌注损伤后是如何促进下游AT1R基因表达增加的调控机制，仍需要后续进一步研究。本研究首次发现，GRK4可能是参与肾脏缺血再灌注损伤的关键致病分子，为提高未来临床合并高血压病患者肾脏I/R损伤的预防和治疗，保护患者肾脏功能，提供了重要的分子靶点。
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