胃癌(gastric cancer, GC)是常见的消化系统肿瘤，在我国发病率接近30%[1-2]。由于胃癌早期发病症状不太明显，确诊时已发展为晚期，细胞的侵袭和转移能力明显，预后差，5年生存率不足20%[3-4]。近年来，随着分子生物学的不断发展，虽然胃癌的发病率和病死率显著降低，但仍然是癌症死亡的第三大原因[5]。手术结合药物化疗是目前临床上治疗胃癌的主要手段，但是复发率较高，药物治疗的并发症较多。双氢青蒿素(dihydroartemisinin, DHA)是一种半合成的青蒿素衍生物，具有抗肿瘤的作用[6-7]。有研究发现，DHA能抑制卵巢癌SKOV3细胞的增殖，诱导细胞凋亡[8]。最新研究表明，DHA能够通过激活JNK1/2和p38 MAPK通路促进胃癌细胞的凋亡，提示DHA对胃癌具有一定的抗癌活性[9]。本实验采用不同浓度的DHA作用于BGC-823和SGC-7901细胞，观察DHA对胃癌细胞BGC-823和SGC-7901增殖、侵袭、迁移和凋亡能力及Wnt/β-catenin通路的影响，进一步探讨DHA可能的作用机制，旨在为临床上DHA抗肿瘤治疗提供一定的实验依据。
1 材料与方法 1.1 主要试剂与材料人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞(中国科学院上海细胞生物研究所)，胎牛血清、新生小牛血清和胰蛋白酶(美国HyClone公司)，青霉素/链霉素(北京鼎国昌盛生物技术公司)，DMEM培养基和RPMI1640培养基(美国Gibco-BRL公司)，BCA法蛋白浓度测定试剂盒(碧云天公司)，AV939、兔抗人Dvl2、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1抗体(美国Sigma公司)，鼠抗人GAPDH单克隆抗体(武汉博士德生物工程有限公司)，SKL2001(Millipore公司)，HRP标记的羊抗兔IgG和羊抗鼠IgG(美国CST公司)，DHA(奥伦生物公司)。
1.2 细胞培养与分组常规使用含10%胎牛血清和双抗(青霉素100 U/L，链霉素100 mg/L)的DMEM培养液(胃癌BGC-823细胞)和RPMI1640培养液(胃癌SGC-7901细胞)，在37 ℃，5%CO2的饱和湿度恒温培养箱中培养，隔天换液。用无血清的DMEM/RPMI1640培养基将DHA稀释成不同的浓度：10 μmol/L(低浓度)、20 μmol/L(中浓度)及40 μmol/L(高浓度)。将BGC-823和SGC-7901细胞分为低剂量组、中剂量组、高剂量组和空白对照组，将对数生长期的细胞接种至6孔板，1×105/孔，当细胞汇合度达70%~80%，实验组加入3种浓度的DHA溶液，空白对照组加入等量无血清的DMEM/RPMI1640培养基，Wnt抑制剂组加入高浓度DHA和XAV939(1 μmol/L)，Wnt激动剂组加入高浓度DHA和SKL2001(20 μmol/L)，每组重复设置5个孔。
1.3 MTT法检测细胞增殖活力取对数生长期的BGC-823和SGC-7901细胞，以5×103/孔接种到96孔板中，细胞贴壁后，加入不同浓度的DHA(10、20、40 μmol/L)分别孵育24、48、72 h后，移去含DHA的培养基，加入10 μL/孔MTT(5 mg/mL)于37 ℃孵育4 h，弃去上清，每孔加入150 μL DMSO，用酶标仪测定各孔在570 nm波长的光密度值[D(570)]，每个样本设置3个复孔。
1.4 划痕实验检测细胞迁移将对数生长期的胃癌细胞以2×105/孔接种到提前在底部画好刻度的6孔板，当细胞汇合度达到95%时，移去培养基，用已消毒的10 μL枪头垂直划一条泳道，用PBS洗涤2次后，在显微镜下拍照，记录0 h细胞泳道的距离。然后加入不同浓度的含无血清培养基DHA，培养48 h后，在显微镜下观察细胞迁移情况，拍照，每组细胞随机选取5处划痕位置测量宽度。细胞相对迁移能力＝(0 h划痕距离－48 h划痕距离)/0 h划痕距离×40%。
1.5 Transwell实验检测细胞侵袭用Matrigel包被Transwell小室基底膜上室面，室温过夜。取在对数生长期的胃癌细胞，经胰酶消化后，1×105/孔于24孔板Transwell中，Transwell小室的上室加入200 μL含不同DHA浓度的无血清培养基，在Transwell下室加入600 μL 15%胎牛血清的DEMR/RPMI1640培养基。常规培养48 h后，4%多聚甲醛固定10 min，用PBS清洗2次，甲醇透化5 min，加入1%结晶紫染色液染色5 min，PBS洗涤2遍，在显微镜下观察细胞并计数。
1.6 流式细胞仪检测细胞周期取对数生长期的胃癌细胞，以3×105/孔接种于6孔板，用不同浓度的DHA作用于胃癌细胞48 h，胰酶消化收集细胞，PBS洗涤后制备成细胞悬液，加入预冷的70%乙醇，4 ℃固定过夜。加入PBS洗涤2次后弃上清，加入PI工作液，室温下避光孵育30 min后，流式细胞仪检测细胞周期。
1.7 流式细胞仪检测细胞凋亡不同浓度的DHA孵育胃癌细胞(3×105/孔)48 h后，用预冷的PBS洗涤2次，加入10 μL Annexin V-FITC和5 μL碘化丙啶染色液(0.25 mg/mL)，轻轻混匀，室温避光孵育20 min，流式细胞仪检测细胞凋亡。
1.8 RT-PCR检测Wnt/β-catenin相关蛋白的表达不同浓度的DHA溶液处理胃癌细胞48 h后，常规收集胃癌细胞，并按照TRIzol试剂盒步骤提取细胞中总RNA，以β-actin为内参，qRT-PCR按照SYBR Green试剂盒说明书进行反应体系的配制，检测Dvl2、GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1在细胞中的表达水平。PCR引物均采用Primer5软件设计，并由宝生物工程(大连)有限公司合成。Dvl2引物序列为5′-AGGATACCACCCTTCCGTTG-3′(正义链)和5′-GGCGCCAAGTACTTTTTCAA-3′(反义链)，扩增片段大小为109 bp；GSK-3β引物序列为5′-GACGCTCCCTGTGATTTATGTC-3′(正义链)和5′-GTTAGTCGGGCAGTTGGTGTAT-3′(反义链)，扩增片段大小为537 bp；β-catenin引物序列为5′-CGGTACATGCATGACTGAGAC-3′(正义链)和5′-GTCACGTGGTACGACGTCAGAT-3′(反义链)，扩增片段大小为310 bp；Cyclin D1引物序列为5′-GAGTAGTGCGAAGCATAGGTCT-3′(正义链)和5′-CTAGCACGAGTAGTCGAGCGC-3′(反义链)，扩增片段大小为455 bp。β-actin引物序列为5′-ACGAGACCIACCTTCAACTCCATC-3′(正义链)和5′-TAGAAGCATTTGCGGTGGACGA-3′(反义链)，扩增片段大小为304 bp。
1.9 Western blot检测Wnt/β-catenin相关蛋白的表达不同浓度的DHA溶液处理胃癌细胞48 h后，常规收集胃癌细胞，用RIPA裂解液裂解细胞后离心，取上清液，用BCA试剂盒测定蛋白浓度。在SDS-PAGE凝胶中，每个泳道加入40 μg的蛋白样品，110 V电泳分离蛋白，电转至PVDF膜，5%脱脂奶粉室温封闭1 h，然后将条带分别加入Dvl2、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1一抗液中，4 ℃孵育过夜，TBST洗膜3×10 min，二抗37 ℃孵育2 h，TBST洗膜3×30 min，ECL显影。运用Quantity One软件分析目的蛋白条带与β-actin灰度比值，计算相对表达量。
1.10 统计学分析计量资料以x±s表示，采用SPSS 21.0统计软件进行组间单因素方差分析，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 DHA抑制胃癌细胞的增殖用不同浓度的DHA刺激BGC-823和SGC-7901细胞24、48、72 h，细胞增殖活性明显下降，与空白对照组比较，DHA可显著抑制胃癌细胞的增殖，且随着作用时间和作用浓度的增加，细胞增殖抑制率逐渐增加(P＜0.05)，见图 1。
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| 1：空白对照组；2：DHA低剂量组；3：DHA中剂量组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较；b：P＜0.05，与24 h比较 图 1 DHA作用不同时间对BGC-823(A)和SGC-7901(B)细胞增殖的影响 |
2.2 DHA对胃癌细胞周期的影响
DHA对胃癌细胞周期的影响见图 2。与空白对照组比较，DHA能够增加S期细胞比例，减少G2/M期细胞比例(P＜0.05)。这提示DHA可将BGC-823和SGC-7901细胞阻滞在S期。
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| A：流式细胞术检测DHA对BGC-823和SGC-7901细胞周期的影响；B、C：分别为DHA对BGC-823(B)和SGC-7901(C)细胞周期的影响 1：空白对照组；2：DHA低剂量组；3：DHA中剂量组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较 图 2 DHA对BGC-823和SGC-7901细胞周期的影响 |
2.3 DHA诱导胃癌细胞凋亡
流式细胞术检测细胞凋亡情况见图 3。不同剂量的DHA能明显促进人胃癌BGC-823和SGC-7901细胞的凋亡，随着DHA剂量的增加，细胞凋亡率明显增加，与空白对照组比较，差异有统计学意义(P＜0.05)。
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| A：流式细胞术检测DHA对BGC-823和SGC-7901细胞凋亡的影响；B、C：分别为DHA对BGC-823(B)和SGC-7901(C)细胞凋亡率的影响 1：空白对照组；2：DHA低剂量组；3：DHA中剂量组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较 图 3 DHA对BGC-823和SGC-7901细胞凋亡的影响 |
2.4 DHA抑制胃癌细胞的侵袭和迁移
Transwell侵袭实验结果显示，低、中、高3个不同浓度的DHA作用于胃癌细胞48 h后，显著降低了胃癌细胞侵袭的数量(P＜0.05，图 4A)，且DHA抑制胃癌细胞的侵袭能力呈一定的浓度依赖性。划痕实验结果显示，在细胞划痕48 h后，与空白对照组比较，DHA组细胞的划痕愈合速度显著变慢(P＜0.05，图 4B)。提示DHA可以抑制BGC-823和SGC-7901细胞的侵袭和迁移能力。
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| 1：空白对照组；2：DHA低剂量组；3：DHA中剂量组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较 图 4 DHA对BGC-823和SGC-7901细胞侵袭(A)和迁移(B)的影响 |
2.5 DHA对胃癌细胞Dvl2、GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1 mRNA表达量的影响
低、中、高3个不同浓度的DHA作用于胃癌细胞48 h后，采用RT-PCR检测Dvl2、GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1 mRNA的表达量，结果见图 5。与空白对照组比较，DHA组BGC-823和SGC-7901细胞Dvl2、β-catenin和Cyclin D1 mRNA的表达量明显降低(P＜0.05)，同时GSK-3β mRNA的表达量较空白对照组升高(P＜0.05)。
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| 1：空白对照组；2：DHA低剂量组；3：DHA中剂量组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较 图 5 RT-PCR检测各组BGC-823(A)和SGC-7901(B)细胞中Wnt/β-catenin相关蛋白的表达 |
2.6 DHA对胃癌细胞Dvl2、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1蛋白表达量的影响
低、中、高3个不同浓度的DHA作用于胃癌细胞48 h后，采用Western blot进一步检测Dvl2、GSK-3β、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达量，结果见图 6。与空白对照组比较，DHA组BGC-823和SGC-7901细胞Dvl2、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达量明显降低(P＜0.05)，同时GSK-3β蛋白的表达量较空白对照组升高(P＜0.05)，进一步说明DHA作用于胃癌细胞后导致GSK-3β的磷酸化水平降低。
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| 1：空白对照组；2：DHA低剂量组；3：DHA中剂量组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较; A、B: BGC-823细胞Western blot检测蛋白表达及半定量分析结果；C、D: SGC-7901细胞Western blot检测蛋白表达及半定量分析结果 图 6 Western blot检测各组BGC-823和SGC-7901细胞中Wnt/β-catenin相关蛋白的表达 |
2.7 阻断或激活Wnt/β-catenin信号通路后DHA对胃癌细胞侵袭和迁移的影响
进一步研究DHA通过抑制Wnt/β-catenin信号通路激活参与胃癌细胞的侵袭和迁移，采用XAV939抑制和SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路。Transwell侵袭实验结果(图 7A)显示，SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路后，高浓度DHA作用于胃癌细胞，胃癌细胞侵袭的数量与空白对照组比较未见明显差异(P>0.05)，而XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路后，DHA对胃癌细胞侵袭的数量进一步增加。划痕实验结果(图 7B)显示，SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路后，能够明显抑制DHA对划痕愈合速度减慢的影响(P＜0.05)，而XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路后，进一步减慢了划痕愈合速度。提示DHA可能是通过调节相应靶蛋白的表达抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制胃癌BGC-823和SGC-7901细胞的侵袭和迁移。
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| 1：空白对照组；2：DHA+SKL2001组；3：DHA+XAV939组；4：DHA高剂量组；a：P＜0.05，与空白对照组比较 图 7 阻断或激活Wnt/β-catenin信号通路后DHA对各组胃癌细胞侵袭(A)和迁移(B)的影响 |
3 讨论
越来越多的研究表明，青蒿素(artemisinin，ART)通过诱导细胞凋亡、抗血管生成、氧化应激等途径发挥抗肿瘤的作用[10-11]。YAMACHIKA等[12]研究发现ART通过诱导肿瘤细胞凋亡抑制肿瘤，与常规的药物相比，具有一定的选择性。双氢青蒿素(DHA)是从中草药青蒿素中分离出来的衍生物和活性代谢物，可以与亚铁原子发生反应，引起DHA过氧桥断裂而生成细胞内活性氧代谢产物，诱导肿瘤细胞发生氧化损伤[13-14]。最新研究表明，DHA也可能是一个潜在的化学预防药物，在多种人类肿瘤细胞，通过抑制细胞增殖、阻滞细胞周期、诱导细胞凋亡、抑制血管生成和转移等途径发挥抗肿瘤的作用[15-17]。
Wnt/β-catenin信号通路在进化上高度保守，参与调节细胞增殖、细胞极性和细胞黏附等多种细胞活动[18]。大量的研究发现，Wnt/β-catenin信号通路对结直肠癌、乳腺癌、肝癌等恶性肿瘤细胞的发生、发展起着关键性的作用[19-21]。癌症细胞中Wnt/β-catenin信号通路的异常激活与Wnt蛋白的异常表达、β-catenin蛋白的核转移等有关。在细胞核中，β-catenin蛋白与T细胞因子结合，促进靶基因的转录，激活下游基因，促进肿瘤细胞的增殖，抑制细胞凋亡。王文娟等[22]研究发现，DHA可以通过阻断Wnt/β-catenin信号通路抑制骨肉瘤细胞的增殖和侵袭。HUI等[23]的研究结果显示，DHA通过靶向作用Wnt/β-catenin信号通路抑制皮肤癌鳞状A431细胞的生长，促进Caspase-3蛋白的表达水平，降低Survivin蛋白的表达水平。同时多项研究表明Wnt/β-catenin信号通路在胃癌的发生、发展中发挥着重要作用[24-25]。Wnt蛋白是一种细胞生长的信号因子，可以作用于Frz蛋白，在LRP蛋白的作用下，激活细胞内的Dvl蛋白，诱导细胞内的信号转导，使GSK-3β发生磷酸化并抑制其活性，进而抑制β-catenin的降解，使得β-catenin蓄积。β-catenin蛋白在细胞连接处与E-cadherin形成黏附复合物，增加细胞间的黏附作用。胞质中游离的β-catenin转入细胞核，进一步激活下游Cyclin D1等靶基因的转录，使细胞的增殖和迁移能力增加。这些靶基因参与调控肿瘤的发生、发展和转移等过程。有研究表明，肺癌患者的β-catenin表达量越高，肿瘤的恶性程度和侵袭能力越高强，预后越差[26]。
BGC-823为一种低分化的胃腺癌细胞系，SGC-7901为一种中分化胃癌细胞系，在本研究中采用不同浓度的DHA处理BGC-823和SGC-7901细胞发现，DHA可以抑制胃癌细胞的增殖抑制率、侵袭细胞数、迁移愈合率，S期细胞比例呈浓度依赖性增加。在其他研究中也显示DHA对胃癌细胞增殖和侵袭的抑制作用，与本研究具有相近结果[9, 27]。在进一步机制性研究中，RT-PCR结果显示DHA能够抑制Dvl2、β-catenin和Cyclin D1 mRNA的表达，同时促进GSK-3β mRNA的表达量。Western blot结果显示DHA下调Dvl2、p-GSK-3β、β-catenin和Cyclin D1蛋白的表达，上调GSK-3β蛋白的表达。在Wnt/β-catenin信号通路中，GSK-3β可以抑制β-catenin蛋白而抑制细胞的增殖，而p-GSK-3β可以抑制GSK-3β的活性促进增殖。因此，DHA可能通过抑制Dvl2而减少GSK-3β磷酸化，进而抑制β-catenin和Cyclin D1来减少胃癌细胞增殖、侵袭和迁移。为进一步验证DHA通过Wnt/β-catenin信号通路发挥作用，采用XAV939和SKL2001抑制和激活Wnt/β-catenin信号通路，结果显示SKL2001激活Wnt/β-catenin信号通路可以逆转DHA对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用，XAV939抑制Wnt/β-catenin信号通路可以进一步加强DHA对胃癌细胞迁移和侵袭的抑制作用。这说明DHA可能是通过调节相应靶蛋白的表达抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制胃癌BGC-823和SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移。
总之，DHA可以通过调节相应靶蛋白的表达抑制Wnt/β-catenin信号通路的激活，从而抑制胃癌BGC-823和SGC-7901细胞的增殖、侵袭和迁移。DHA具有广泛的抗肿瘤作用，毒副作用小，可能是胃癌临床治疗的潜在替代药物，为胃癌的药物治疗开辟新的途径。
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