近年来随着内镜技术不断发展,内镜黏膜下剥离术(endoscopic submucosal dissection,ESD)已成为早期食管癌等消化道早期癌及癌前病变的首选治疗方法[1],但食管EDS术后黏膜缺损导致医源性的深溃疡、急性炎症反应、食管局部黏膜下纤维结缔组织增生、胶原沉积、食管壁的纤维化, 进而导致食管狭窄形成,造成不同程度的吞咽困难,严重影响患者的生活质量[2]。目前就防治食管ESD术后狭窄问题已有大量研究[3-5], 主要解决方法包括扩张治疗、药物治疗、支架治疗以及新兴的生物治疗。细胞分子水平研究多是对于术后增生性瘢痕成纤维细胞或者瘢痕疙瘩成纤维细胞的研究[6-10]:通过抑制炎症反应、拮抗生长因子作用及基因干预促进其凋亡,最终达到减少细胞过度增殖及细胞外基质分泌的目的。这些研究不仅仅本身存在一些问题,而且多为对食管狭窄形成后的干预,较少对于狭窄形成前期、初期的预防研究。
在食管愈合的过程中成纤维细胞的功能异常与瘢痕过度形成及纤维化直接相关[11-12]。TGF-β1可通过刺激以成纤维细胞为主的间质细胞增殖,促进其转化为肌成纤维细胞和瘢痕成纤维细胞,产生更强的分泌及收缩能力,使胶原大量在细胞外沉积,同时诱导组织纤维化的发生[13-14]。本研究采用小鼠成纤维细胞L929作为研究对象,动态观察在具有多种生物学效应的细胞因子TGF-β1刺激下L929细胞增殖、转分化及胞外基质分泌情况,为体外研究食管狭窄形成早期或前期提供实验依据。
1 材料与方法 1.1 细胞L929细胞株来自本实验室。
1.2 主要试剂国产胎牛血清购于Excell公司(FCS500),DEME培养基购于Gibco公司,Recombinant Mouse TGF-β1 Protein购于R﹠D Systems,BCA试剂盒购于江苏碧云天生物科技研究所,MinuteTM Protein Extraction Kits购于Invent生物技术公司,引物合成与设计由生工生物工程(上海)股份有限公司提供,逆转录及qPCR试剂盒购于TaKaRa公司,兔抗α-SMA购于Abcam公司,鼠抗TIMP-1、鼠抗MMP-1购于北京博奥森生物技术有限公司,山羊抗兔IgG、山羊抗鼠IgG购于中杉金桥公司,CCK-8购于东仁化学科技(上海)有限公司,Mouse Pro-Collagen Ⅰ α 1 Simple Step ELISA® Kit(ab210579)购于Abcam公司,Mouse Pro-Collagen Ⅲ ELISA® Kit(F5763)购于上海西唐生物科技有限公司。
1.3 实验分组及细胞培养取冻存L929细胞复苏,加含10%胎牛血清DEME高糖培养基培养,每2~3天换液1次,每4~5天传代1次,取第3代细胞用于实验。实验分为两组:①空白对照组:细胞不做处理;②TGF-β1组:用10 ng/mL TGF-β1持续刺激,依据刺激时间不同又分为24、48、72、96、120 h 5个亚组。
1.4 CCK-8法检测细胞增殖将细胞以3×103/孔接种于5个96孔板中,空白对照组加普通培养基,TGF-β1组用含10 ng/mL TGF-β1的培养基培养,每组4个复孔。分别于细胞铺板后的第1、2、3、4、5天向孔板中加入10 μL CCK-8,于细胞培养箱内孵育2 h后,使用酶标仪测定450 nm波长处光密度值[D(450)]。
1.5 qPCR检测α-SMA、Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原、MMP1、TIMP1 mRNA表达用硫氰双胍-酚-氯仿一步抽提法(TRIzol)提取细胞总RNA,测定浓度及纯度。取1 μg总RNA,按照TaKaRa逆转录试剂盒说明书步骤进行逆转录,随后用SYBR Premix Ex Taq kit试剂盒测定各基因表达量,以GAPDH作为内参。反应条件:95 ℃预变性30 s,95 ℃变性5 s,60 ℃退火30 s,40个循环,完成PCR扩增。采用2-ΔΔCt法进行数据统计分析。所用引物见表 1。
基因 | 引物序列(5′→3′) | 片段长度(bp) |
α-SMA | 上游:AGGGGAATGAAAAGCCGGAA 下游:TAGGATATGCCTGGGGGTC |
286 |
Col Ⅰ | 上游:ACTGTCTTGCCCCAAGTTCC 下游:TGGGCATCTGGTTTAGCCTT |
121 |
Col Ⅲ | 上游:ACGTAGATGAATTGGGATGCAG 下游:GGGTTGGGGCAGTCTAGTG |
154 |
MMP1 | 上游:TGACCTCCACAGTTGACAGG 下游:CACATCAGGCACTCCACATC |
122 |
TIMP1 | 上游:CCCTTCGCATGGACATTTAT 下游:CAGATGCCAGAGATGCAAAG |
352 |
GAPDH | 上游:GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT 下游:CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC |
132 |
1.6 Western blot检测α-SMA、MMP1、TIMP1蛋白表达
细胞培养液,用PBS洗涤细胞2遍,加100 μL裂解液/孔(MinuteTM Protein Extraction Kits)使之与细胞充分接触后将细胞刮下,吸至离心柱中,4 ℃ 10 000×g离心1 min,取滤液,用BCA试剂盒测蛋白浓度,将样品终浓度均调为2 μg/μL,常规蛋白变性。取30 μg/孔进行聚丙烯酰胺凝胶(SDS-PAGE)变性电泳,100 V湿转80 min将蛋白转移至PVDF膜。使用含有5%脱脂奶粉的TBST 37 ℃封闭2 h,TBST洗膜5 min。加入一抗鼠抗MMP1、鼠抗TIMP1、兔抗α-SMA,4 ℃孵育过夜,洗膜10 min,重复3次。孵育二抗,分别加山羊抗鼠IgG、山羊抗兔IgG,37 ℃孵育1.5 h,TBST洗膜10 min,重复5次。ECL显色试剂盒显色。Image J对图像进行分析,以相应蛋白条带灰度值比β-tublin蛋白带灰度值表示蛋白含量。
1.7 ELISA测定Ⅲ型前胶原、Ⅰ型前胶原合成提取蛋白,方法同1.6。严格按照ELISA试剂盒使用说明进行操作。450 nm波长处读取光密度值[D(450)],根据绘制的标准曲线得出Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原含量,以pg/mL表示。
1.8 统计学分析各组实验重复3次。计量资料以x±s表示,采用SPSS 20.0统计软件,组间多重比较采用单因素方差分析,两组间比较采用独立样本t检验。检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 TGF-β1对L929细胞增殖的影响从生长曲线分析结果可以看出,与空白对照组相比,TGF-β1组细胞在2、3、4、5 d的增殖能力明显增高,差异有统计学意义(P<0.05,图 1)。
2.2 TGF-β1对L929细胞α-SMA的影响
检测肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA,与空白对照组比较,TGF-β1组刺激不同时间细胞α-SMA mRNA明显增高,差异有统计学意义(P<0.05,图 2A)。α-SMA mRNA随时间呈先升高、再降低、再升高趋势。Western blot检测结果可见,α-SMA蛋白在TGF-β1刺激24 h组降低,48 h组升高至最大值,72、96、120 h组再降低,但仍高于空白对照组(P<0.05,图 2B、C)。
2.3 TGF-β1对L929细胞Ⅰ、Ⅲ型前胶原合成的影响
qPCR检测结果显示,与空白对照组相比,TGF-β1组细胞Ⅰ型前胶原、Ⅲ型前胶原mRNA水平均明显升高(P<0.05,图 3)。ELISA结果显示,与空白对照组比较,TGF-β1 24 h组Ⅰ型前胶原含量明显增加(P<0.05,表 2),延长刺激时间Ⅰ型前胶原含量逐渐减少,96 h组达最低值,与空白对照组比较差异有统计学意义(P<0.05);TGF-β1组刺激不同时间Ⅲ型前胶原含量较空白对照组显著增多(P<0.05,表 2)。
组别 | Ⅰ型前胶原 | Ⅲ型前胶原 |
空白对照组 | 2 558.68±73.27 | 15.37±1.77 |
TGF-β1 24 h组 | 3 712.65±182.70a | 40.76±4.37a |
48 h组 | 2 337.54±121.45 | 62.76±3.01a |
72 h组 | 2 365.52±89.45 | 60.58±3.54a |
96 h组 | 1 997.06±68.44a | 71.87±0.48a |
120 h组 | 2 266.64±41.18 | 60.76±3.48a |
a:P<0.05,与空白对照组比较 |
2.4 TGF-β1对L929细胞MMP1、TIMP1表达的影响
与空白对照组比较,TGF-β1组MMP1 mRNA表达增高(P<0.05,图 4A),并随刺激时间的延长逐渐升高;TGF-β1组MMP1蛋白表达也较空白对照组增高(P<0.05, 图 4C),呈先升高、再降低、再升高的趋势,96 h组达最大值。与空白对照组比较,TGF-β1组TIMP1 mRNA表达增高(P<0.05,图 4B),表现为先增高、后降低、再增高,96 h组达最大值。TGF-β1组TIMP1蛋白表达也较空白对照组增高(P<0.05,图 4D),并有随时间延长逐渐增高的趋势。
3 讨论
TGF-β1在不同环境、不同发育阶段的细胞可表现出的不同效应,可调节细胞增殖、分化、细胞外基质及免疫应答等多个环节[15]。有学者在食管手术发生吻合口狭窄的研究中发现,与对照组比较,吻合口狭窄结缔组织生长因子(connective tissue growth factor,CTGF)和TGF-β1蛋白水平显著升高[16]。本研究主要关注成纤维细胞在单一细胞因子TGF-β1刺激环境下的增殖、转分化及胶原蛋白代谢的特点。实验结果显示TGF-β1刺激L929细胞增殖24 h后,TGF-β1组细胞外基质mRNA水平较空白对照组明显升高,并呈持续高表达水平,但蛋白及胶原的表达与mRNA并不完全一致,考虑与转录后修饰及蛋白相互作用等有关。其中肌成纤维细胞标志性蛋白α-SMA含量并不随TGF-β1刺激时间延长而呈线性增长,而是在短期内升高后又降低,可能与肌成纤维细胞的凋亡相关,还有待进一步验证。
有学者通过食管狭窄模型研究发现食管损伤后发生炎症反应及相伴随的实质纤维化,随着时间的延长,食管壁纤维化逐渐加重,并取代坏死组织,组织学上以成纤维细胞的过度增生和细胞外基质,尤其是胶原过度沉积,以及细胞外基质降解不足为特征[17]。而胶原的降解主要是通过酶促反应来完成,其中MMP1是胶原降解的关键酶。它由成纤维细胞、巨噬细胞等以酶原的形式分泌,在其他蛋白酶或因子作用下激活,分解Ⅰ、Ⅲ型胶原为2个小片段,进而被其他蛋白酶进一步分解,使得胶原合成与降解处于动态平衡[18]。TIMP1是MMP1最重要的抑制酶,按1:1与MMP1形成复合体,从而抑制酶的活性[19]。本研究中,TIMP1升高较MMP1延迟,所以推测MMP1降解作用使TGF-β1刺激下L929细胞分泌的Ⅰ型前胶原升高后降低,但对Ⅲ型前胶原作用则不明显。
本研究中TGF-β1刺激L929细胞120 h,促进细胞增殖作用明显,同时伴随细胞转分化及胶原分泌增加,以Ⅲ型前胶原为主,可以作为体外研究食管狭窄模型参考。后续我们将对正常成纤维细胞进行干预研究,以期在成纤维细胞过度增殖导致食管狭窄前调控其生长,从而避免或减轻纤维化的发生、发展及胶原过度沉积。食管EDS术后瘢痕形成及纤维化是多因素参与的复杂过程,其机制未被完全阐明[20],使用单一的生长因子是否能完全模拟其形成仍需进一步研究。
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