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应用mycalolide B初步建立斑马鱼帕金森病模型
段凌晗1, 吴永梅2, 李淑蓉2, 苏炳银1     
1. 610500 成都,成都医学院:人体解剖与组织胚胎学教研室;
2. 610500 成都,成都医学院:发育与再生四川省重点实验室
[摘要] 目的 应用mycalolide B(MB)建立斑马鱼帕金森病(Parkison’s disease,PD)模型,观察斑马鱼行为学、形态学及多巴胺神经元的变化并进行系统评价。方法 同亲代斑马鱼单次产卵200~300枚,简单随机化分为7组:对照组(0.2% DMSO)、MB10组(10 μg/L MB)、MB20组(20 μg/L MB)、MB40组(40 μg/L MB)、MB80组(80 μg/L MB)、MB160组(160 μg/L MB)、1-甲基-4-苯基-1,2,3,6-四氢吡啶(MPTP)组(200 μmol/L MPTP),每组30枚胚胎,于浓度梯度下培养;统计存活率,分析行为学变化,利用激光共聚焦显微镜观察多巴胺神经元生长情况,并与MPTP组进行比较分析。结果 MB效应浓度33.4~50.3 μg/L时,成斑马鱼出现发育迟缓、脊椎畸形、心包水肿、平衡失态、震颤等;运动速率降低明显(P<0.05);Vmat2-GFP标记的阳性细胞减少(P<0.01);synuclein蛋白沉积(P<0.05)。结论 建立斑马鱼PD模型的MB效应浓度为33.4~50.3 μg/L;MB诱导的斑马鱼PD模型与MPTP模型相比,行为学、多巴胺神经元数量减少方面相似,且较不产生synuclein的MPTP模型更具模式学意义。
[关键词] mycalolide B     1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶     帕金森病     模型     斑马鱼    
A zebrafish model of Parkinson's disease established using mycalolide B
DUAN Linghan1 , WU Yongmei2 , LI Shurong2 , SU Bingyin1     
1. Department of Anatomy, Histology and Embryology, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan Province, 610500, China;
2. Sichuan Provincial Key Laboratory of Development and Regeneration, Chengdu Medical College, Chengdu, Sichuan Province, 610500, China
Supported by the General Program of National Natural Science Foundation of China (31371215)
Corresponding author: SU Bingyin, E-mail: subingyinn@163.com
[Abstract] Objective To establish a zebrafish model of Parkinson's disease (PD) using mycalolide B (MB), and evaluate the model by observing zebrafish behavior, morphology and dopamine neurons. Methods A total of 200~300 parental zebrafish eggs from a single spawning were randomly divided into 7 groups: control group, MB10 group (10 μg/L), MB20 group (20 μg/L), MB40 group (40 μg/L), MB80 group (80 μg/L), MB160 group (160 μg/L) and 1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine (MPTP) group (200 μmol/L), with 30 embryos in each group. The embryos were cultured under the concentration gradient, and the survival rate and behavioral changes were observed. Laser confocal microscopy was used to observe the growth of dopamine neurons. And all the results of MB treatment groups were compared with MPTP group. Results The effective concentration of MB was 33.4~50.3 μg/L, which resulted in the abnormities such as growth retardation, spinal deformity, pericardial edema, balance loss and tremor, etc. The movement rate was significantly decreased (P<0.05). There were less Vmat2-GFP positive cells (P<0.01) and more synuclein protein deposition (P<0.05). Conclusion MB at an effective concentration of 33.4~50.3 μg/L can be used to establish zebrafish PD model. The zebrafish model induced by MB are similar with the MPTP model in behaviors and fewer dopamine neurons, but better than the other one for synuclein production.
[Key words] mycalolide B     1-methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine     Parkinson's disease     models     zebrafish    

帕金森病(Parkison’s disease,PD)开始阶段就会出现突触退行性改变,投射到纹状体的突触比黑质神经元减少更严重。多巴胺神经元由突触开始的逆行性死亡被认为在PD初期起了决定性的作用,才会导致之后PD进程的推进。Dynactin是轴突逆行轴浆运输关键蛋白,通过对家族性PD患者的基因分析,发现杂合变异体dynactin与该疾病发生的相关性高。敲除dynactin可造成小鼠胚胎期死亡。敲低dynactin后,会减少逆向运输,dynactin突变体可以造成严重的PD症状。更重要的是dynactin的表达量会随着年龄增长而增长,但在PD患者大脑中的dynactin表达却会出现显著降低[1]。所以,从降低大脑中dynactin的表达量入手,建立模拟衰老PD模型是一个很好的研究方向。mycalolide B(MB)是一种特异性抑制剂,能有效地抑制逆行运输的关键因子dynactin的产生[2]。而斑马鱼作为很好的神经科学模式动物,有易于繁殖、生长周期短、与脊椎动物包括人类相似的神经发育等特点。目前,已在斑马鱼中鉴定出PD相关的基因(如DJ-1、LRRK2、PARKIN和PINK1)。1-甲基-4-苯基-1, 2, 3, 6-四氢吡啶(1-Methyl-4-phenyl-1, 2, 3, 6-tetrahydropyridine,MPTP)能诱导PD模型多巴胺水平下降以及行为上的缺陷。早期的研究表明用MPTP处理幼鱼可以导致vDC区域的多巴胺神经元明显减少[3]。MPTP模型的缺点是不能造成一个路易士小体累积[4],该模型在一定程度上并不能类比真实的PD患者。所以,学者们一直尝试构建一个更接近人群发病特点的动物模型。MB造成的PD模型相比MPTP可能的优点为:①更能结合机体衰老过程;②MPTP不能造成路易小体的形成,而dynactin突变可以造成路易小体形成;③MPTP造成线粒体紊乱,而通过影响dynactin敲低形成的PD模型,可能和线粒体无关[5]。所以,本研究尝试使用动物模型构建的常规手段,从生存率、致死浓度、有效浓度、形态学和行为学等不同方面对可能产生适宜模型的各浓度梯度MB组样本进行系统评估,旨在为PD疾病研究奠定模型基础。

1 材料与方法 1.1 动物模型的制备

所用斑马鱼为Vmat2-GFP转基因斑马鱼(中科院上海神经科学研究所杜久林教授赠予),于28 ℃下在北京爱森公司净水系统中培养1个月以上,光照:黑夜比例为14 :10,雌雄分别饲养5~7 d,交配前1 d以1 :1的雌雄性成熟斑马鱼配对,交配当日清晨光亮10 min内推出隔板,交配。受精1 h内收集胚胎,剔除死胚。同亲代斑马鱼单次产卵200~300枚,简单随机化分为7组:①对照组:0.2%DMSO处理;②MB10组:10 μg/L MB处理;③MB20组:20 μg/L MB处理; ④MB40组:40 μg/L MB处理;⑤MB80组:80 μg/L MB处理;⑥MB160组:160 μg/L MB处理;⑦MPT P组:200 μmol/L MPTP处理,每组30枚卵。培养在28 ℃培养箱中用于后续实验。

1.2 主要试剂及仪器

Mycalolide B(日本Wako公司),MPTP(美国Sigma公司),抗体synuclein (德国SYSY公司,128 002),抗体Dynactin(美国OriGene公司,TA340044),抗体GAPDH(英国Abcam公司,ab181602)。使用仪器包括Olympus FV1000激光共聚焦显微镜和Olympus SZX16体视荧光显微镜。

1.3 斑马鱼发育形态观察

在受精后24、48、72、96、120 h观察各组胚胎,用解剖显微镜观察胚胎固缩、心包水肿、卵黄吸收时间及脊椎、短尾畸形等[6]。计算生存率和孵化率。用0.003% (200 μmol/L)褪黑素(propylthiouracil,PTU)处理受精24 h胚胎,抑制黑色素生成。采用激光共聚焦显微镜观察间脑Vmat2-GFP斑马鱼神经元生长。采用synuclein抗体免疫荧光染色观察每组收集的15~40枚胚胎,其中一抗按1 :200稀释,荧光二抗按1 :600稀释。

1.4 斑马鱼行为学实验

1.4.1 运动速率实验

把对照组、MB10组、MB20组、MB40组及MPTP组斑马鱼(n=30)放入90 mm方格垫底的透明培养皿中,适应环境5 min后,测量机械刺激(受精后4 d)或自由活动5 min的运动距离(受精后5、6 d),整个过程使用顶置摄像机拍摄5 min,分析斑马鱼游泳样式、距离,统计描点,并计算时间速率。

1.4.2 明暗室实验

将受精后5~7 d的对照组、MB40组、MPTP组斑马鱼(n=30)置于明暗室各半的培养皿中(可在明暗室间自由活动),适应20 min,用顶置摄像头拍摄8 min,分析各组斑马鱼在明暗室停留时间,计算各组斑马鱼在明室所待的百分比(明室时长/总时长)。

1.5 荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)检测

采用TRNzol试剂提取对照组、MB40组、MPTP组斑马鱼(n=80)总RNA,通过NanoDrop2000检测RNA浓度后,取1 μg mRNA反转录成cDNA。PCR反应程序:95 ℃预变性3 min,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,72 ℃延伸15 s,循环数40。qRT-PCR引物及其序列见表 1。各组实验最少重复3次。mRNA的相对表达量使用△△Ct法计算。

表 1 qRT-PCR引物序列及其产物大小
引物 序列 产物大小(bp)
DJ-1 上游:5′-CCTGCTGTGAAAGAGGTGTTG-3′
下游:5′-ACTGTGCTGCCATATGCAATAC-3′ 223
PARKIN 上游:5′-GAGGAGTTTCACGAGGGTCC-3′
下游:5′-TGAGTGGTTTTGGTGATGGTC-3′ 243
LRRK2 上游:5′-GGATCTGTCACAGATTGGTG-3′
下游:5′-CTAGTGGAATATCTGCGGAC-3′ 261
PINK1 上游:5′-GGCAATGAAGATGATGTGGAAC-3′
下游:5′-TTGTGGGCATGAAGGAACTAAC-3′ 251
β-actin 上游:5′-TGGCAAAGGGAGGTAGTTG-3′
下游:5′-GTGAGGAGGGCAAAGTGG-3′ 232

1.6 Western blot检测

使用裂解液于冰上裂解对照组、MB40组、MPTP组(n=80)斑马鱼。采用BCA法测定蛋白浓度,按体积加入5×上样缓冲液,95 ℃水浴加热5 min。Western blot检测具体操作如下:将提取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(100 V)后,转移至PVDF膜上,封闭,加一抗(1 :500~1 :1 000) 4 ℃孵育过夜,加二抗(1 :3 000)37 ℃孵育2 h,显色检测并使用化学发光成像采集图片。各组实验最少重复3次。使用Image J软件测定、分析各条带灰度值,其与内参的灰度值比值表示蛋白含量。

1.7 统计学分析

采用Sigma Stat 3.5标准化计算指南,50%有效作用浓度(50% effective concentration,EC50)和50%致死浓度(50% lethal concentration,LC50)为统计曲线图50%取点位置值(Origin8)。采用Graphpad 5统计软件,采用双因素方差分析时间、浓度影响,组间比较采用独立样本t检验。检验水准:α=0.05。

2 结果 2.1 MB与MPTP致斑马鱼胚胎(幼鱼)存活率及孵化效率下降

存活率统计结果显示:与对照组相比,在受精后24 h内,MB160组达到全数致死量,对照组在24 h内自然死亡率<10%(表 2)。MB80组死亡率与时间成正比,72 h后畸形严重,游泳运动障碍明显;孵化期即受精后72~96 h未有幼鱼死亡;96 h后逐渐死亡,并在120 H死亡率最高。对照组胚胎受精后48 h开始孵化,72 h完成。MB10、MB20、MB40、MB80组均有不同程度孵化困难,72 h大量胚胎未孵化,MB10组孵化率为(11.1±5.4)%、MB20组为(27.2±3.4)%、MB40组为(34.8±9.1)%、MB80组为(58.3±7.2)%;96 h各组胚胎孵化均完成,MB造成胚胎卵化延迟但不造成死亡样本产生的情况,可能与胚胎畸形、出膜动力降低有关(图 1)。另一方面,由于持续性运动缓慢,导致MB80组120 h出现幼鱼死亡。与MPTP组相比,MB20、MB40组存活率及孵化效率均较为相似(表 2)。

表 2 各组斑马鱼胚胎(幼鱼)在各时间点的存活率(x±s)
组别 受精后24 h 受精后48 h 受精后72 h 受精后96 h 受精后120 h
对照组 90.9±1.3 90.9±1.3 90.9±1.3 90.9±1.3 90.9±1.3
MB10组 88.6±1.5 78.6±1.9d 78.6±1.9a 78.6±1.9a 78.6±1.9a
MB20组 83.5±1.1a 71.6±1.5ad 71.6±1.5a 64.2±2.5ac 64.2±2.5a
MB40组 66.1±4.5b 66.1±4.5b 66.1±4.5b 66.1±4.5b 56.8±6.1bc
MB80组 74.2±9.5b 58.7±5.3bd 58.7±5.3b 58.3±4.9b 7.6±7.2bd
MB160组 8.1±5.1b 0bc 0b 0b 0b
MPTP组 87.9±3.8 86.4±3.6 83.9±4.7a 80.9±5.3a 64.8±18.6ad
a:P<0.05,b:P<0.01,与对照组比较;c:P<0.05,d:P<0.01,与受精后24 h比较

图 1 各组斑马鱼发育变化的大体形态学观察

2.2 MB与MPTP致斑马鱼发育异常

在斑马鱼发育过程中,与对照组相比,MB40、MB80、MB160组在受精后24 h出现明显的发育迟缓及畸形,统计EC50半数致发育迟缓的MB浓度为33.4 μg/L。72 h统计MB10、MB20、MB40和MB80浓度梯度下心包水肿情况,EC50半数致心包水肿浓度为40.0 μg/L,MPTP组(81.0±5.6)%出现心包水肿、尾部畸形。96 h统计幼鱼畸形率,计算得到MB处理EC50半数致畸形浓度为50.3 μg/L,MPTP组尾部畸形率达到(64.3±2.6)%。其中MB80组相对于对照组几乎全部发育迟缓2 h左右,且胚胎内出现尾部弯曲畸形、脊柱僵直畸形(图 1)。MPTP组和MB处理组斑马鱼都出现游泳姿态异常,特征性表现为平衡失态、震颤,可能由脊椎畸形、肌张力增高、心包水肿造成,且MB处理浓度在26.9 μg/L即有半数出现。MB处理组的LC50逐日降低,分别为108.2(受精后1 d)、80.0(受精后2 d)、80.0(受精后3 d)、26.2 μg/L(受精后4 d)。

2.3 MB与MPTP致斑马鱼运动能力减弱

MB各组和MPTP组孵出卵壳困难,孵出后再次出现死亡峰。机械刺激后,幼鱼游泳速率降低,自由活动速率降低(图 2A)。胚胎发育到受精后4 d不会自由活动,对机械刺激和光刺激都有良好反应。对照组机械刺激后在水上层游动,但MB20及以上浓度组、MPTP组均对机械刺激反应迟钝,表现为不正常的游泳姿态、平衡欠失、靠近器皿底部游动。机械刺激实验统计结果可见:对照组运动速度与MB10组前30 s比较,差异无统计学意义(P>0.05);而60 s后,与对照组相比,其他组斑马鱼出现有不同程度的运动速率下降(P<0.05,图 2B),提示斑马鱼运动耐力减弱。

1:对照组;2:MB10组;3:MB20组;4:MB40组;5:MPTP组;a:P<0.01,与对照组比较
A:各组自由运动速度;B:各组受机械刺激后运动速率
图 2 各组斑马鱼行为学变化

使用双因素方差分析各组自由运动的速度数据发现:MB各处理组自由运动速度受药物影响显著(P<0.01),不受时间单因素影响(P=0.797 9),受时间与药物双因素影响(P<0.01),证明时间上有累积;其中MB10组不受时间影响,MB20组和MB40组都受到时间和浓度双因素影响,表现为自由活动速率明显减少;MPTP组受MPTP影响(P<0.01),表现为自由活动速率显著降低,不受单因素时间(P=0.080 4)或药物、时间双因素影响(P=0.259 7)。

斑马鱼受精后5 d进行明暗室实验,连续观察3 d,发现相对于对照组,MB40组在明室所待时间百分比差异无统计学意义(P>0.05),说明MB40组并未造成斑马鱼焦虑或抑郁。而MPTP组相对于对照组、MB40组,在明室所待时间百分比明显减少[(49.8± 8.9) % vs (98.0±2.1)%、(96.2±4.7)%,P<0.01]。

2.4 MB导致Vmat2阳性神经元减少及synuclein沉积

Vmat2-GFP转基因斑马鱼标记包括多巴胺神经元在内的单胺类神经元,在斑马鱼腹侧间脑,GFP标记Vmat2神经元类似人类的“黑质区”,可在活体下观察多巴胺神经元状态。使用激光共聚焦显微镜观察受精后3 d胚胎,MB40组间脑Vmat2荧光统计量相当于对照组的(46.7±0.2)%,MPTP组相当于对照组的(38.8±0.1)%,说明MB40组和MPTP组较对照组幼鱼多巴胺神经元数量明显减少(P<0.01,图 3A)。

A:受精后3 d各组Vmat2表达;B:免疫荧光检测受精后3 d各组synuclein蛋白表达方框显示间脑观察区;激光共聚焦显微镜×20,右下角框×60 图 3 激光共聚焦显微镜观察Vmat2-GFP转基因斑马鱼间脑神经元

为了观察synuclein是否在模型中聚集,使用synuclein抗体进行免疫荧光染色,发现MB40组斑马鱼中有synuclein的沉积,其中明显沉积的占(20.2±4.1)%,并在间脑区域与GFP标记的Vmat2神经元重合。而MPTP组并未找到synuclein阳性标记物(图 3B)。qRT-PCR检测PD相关基因表达量(图 4A),与对照组比较,MB40组DJ-1和PARKIN表达差异明显(P<0.05),MPTP组DJ-1、LRRK2、PINK1表达差异明显(P<0.05)。Western blot检测结果显示MB40组dynactin较对照组和MPTP组明显减少[(0.4±0.1) vs (1.1±0.2)、(1.4±0.2),P<0.05,图 4B]。

1:对照组;2:MB40组;3:MPTP组;a:P<0.05,与对照组、MPTP组比较 图 4 PD相关基因DJ-1、LRRK2、PARKIN、PINK1 mRNA(A)和dynactin蛋白(B)的表达

3 讨论

20世纪80年代在松鼠猴注射MPTP获得PD模型,陆续应用到其他生物模式动物,现成为PD的主流建模药物。因为流行病学调查中发现PD患者反复摄入或接触MPTP物质的概率极低,以及利用MPTP建模具有不能造成synuclein沉积等缺点[6],所以迫使我们需要找到另一种建模方式进行PD机制的研究。使用MB建模不但对多巴胺能神经元有影响,也会产生synuclein聚集。这些有利的证据提示采用MB建模可能更有利于研究PD的发病机制。

本研究结果显示:在形态学和行为学方面,MB各处理组和MPTP组都有相似症状,表现为脊柱畸形、心脏水肿、平衡失态等症[7];斑马鱼的形态学改变可能和MB的致突变性和细胞毒性有关,其平衡失态和神经毒性有关[8]。行为学上异常,如游泳平衡失态、震颤、僵直、运动速率减慢和PD症状相似[9-11]。在其他方面,本研究中MB处理组表现为孵化推迟和出生后再次出现死亡高峰,综合其他运动症状分析,其可能由幼鱼运动能力减弱造成。明暗室实验中没有找到MB与焦虑、抑郁的证据,这可能提示与PD临床上晚期才会出现情志障碍的症状有关[12]。在病理学方面结果显示:与对照组相比,MB40组与MPTP组间脑神经元数量都有明显减少,且MB40组表现为synuclein沉积。因为多巴胺神经元减少被认为是PD最重要的病理依据[13],而在Vmat2-GFP转基因斑马鱼腹侧间脑,GFP标记Vmat2神经元类似人类的“黑质区”,所以间脑神经元的减少提示:MB能造成PD相似病理改变;有别于MPTP建模不能造成synuclein沉积的缺点[6],使用MB建模的斑马鱼能产生synuclein的沉积。

与其他模型相比,MB建模的优势是其能够运用于PD的机制研究,特别是与dynactin有关的机制研究。因为MB作为dynactin的特异性抑制剂[2],能模拟生理状态下dynactin的变化,即dynactin在老年人大脑中表达增加[14],而在PD患者脑部却降低这一变化[1]。其造成PD症状机制可能和dynactin受到抑制、细胞逆行轴浆运输受到阻止、产生多巴胺神经元功能代谢紊乱最终造成神经元死亡有关[2]。也有可能是dynactin受抑制后影响了其在有丝分裂中的作用,造成神经元的寿命减短[15]。通过对家族性PD患者的基因分析,发现杂合变异体dyncatin与疾病发生有高相关性[16]。dynactin全敲小鼠会在胚胎期死亡,敲降dynactin会造成逆向运输障碍[17],从而导致细胞产生caspase-8相关自噬,最终走向死亡[5]。dynactin突变体可以造成严重的PD症状[18],甚至纹状体胶质细胞变性[19]。以上dynactin与PD的高相关性提示应用MB建立PD模型的必要性。

综上所述,本研究利用MB成功构建了斑马鱼PD模型。推荐MB效应浓度在33.4~50.3 μg/L可得到较好的建模样本,所建模型很好地表现PD症状和病理改变。该模型的局限在于MB效应浓度区间较小,作为新药的运用时间较短,有待于在相关领域的应用研究进一步验证模型的可靠性。

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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201710051
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

段凌晗, 吴永梅, 李淑蓉, 苏炳银.
DUAN Linghan, WU Yongmei, LI Shurong, SU Bingyin.
应用mycalolide B初步建立斑马鱼帕金森病模型
A zebrafish model of Parkinson's disease established using mycalolide B
第三军医大学学报, 2018, 40(6): 487-493
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(6): 487-493
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201710051

文章历史

收稿: 2017-10-11
修回: 2017-12-18

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