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FoxM1通过Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌细胞5-8F增殖、迁移的影响
万婕1, 祝琳2, 雷越1, 刘亚男1, 文韬宇1, 李丹丹1, 叶琳3, 陈鸿雁1     
1. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院耳鼻喉科;
2. 646000 四川 泸州,西南医科大学附属医院耳鼻咽喉头颈外科;
3. 400016 重庆,重庆医科大学附属第一医院胸心外科
[摘要] 目的 探讨FoxM1对鼻咽癌细胞5-8F恶性生物学行为的影响及其可能机制。方法 将化学合成的靶向FoxM1的siRNA转染鼻咽癌细胞5-8F(FoxM1-siRNA组),并设立空白对照组、阴性对照组,采用RT-PCR及Western blot检测FoxM1表达变化。采用MTT法、FCM法、Transwell法分别检测下调FoxM1表达对细胞增殖、周期、凋亡、迁移的影响。Western blot检测下调FoxM1表达后β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9蛋白表达变化。结果 转染FoxM1-siRNA的5-8F细胞FoxM1 mRNA和蛋白表达水平降低(P<0.05)。下调FoxM1表达可抑制5-8F细胞增殖(P<0.05),FoxM1-siRNA组的凋亡率为(22.68±0.67)%,较阴性对照组[(11.74±1.36)%]和空白对照组[(10.94±1.52)%]显著增加(P<0.05),细胞周期阻滞于G0/G1期。FoxM1-siRNA组细胞穿膜数(100.00±10.97)明显低于阴性对照组(246.00±6.66)和空白对照组(233.70±12.41),细胞迁移能力降低(P<0.05)。下调FoxM1的表达可抑制β-catenin细胞核表达,抑制C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9总蛋白表达(P<0.001)。结论 FoxM1表达下调抑制鼻咽癌细胞5-8F的增殖,诱导细胞凋亡,降低细胞迁移能力,使细胞周期阻滞于G0/G1期。其机制可能是通过抑制Wnt通路关键蛋白β-catenin细胞核表达从而抑制Wnt通路活性实现的。
[关键词] 鼻咽癌     FoxM1     Wnt/β-catenin信号通路     细胞增殖     细胞迁移    
Effect of siRNA mediated FoxM1 silencing on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells via Wnt/β-catenin signaling pathway
WAN Jie1 , ZHU Lin2 , LEI Yue1 , LIU Yanan1 , WEN Taoyu1 , LI Dandan1 , YE Lin3 , CHEN Hongyan1     
1. Department of Otolaryngology, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016;
2. Department of Otolaryngology, Head and Neck Surgery, Affiliated Hospital of Southwest Medical University, Luzhou, Sichuan Province, 646000, China;
3. Department of Cardiothoracic Surgery, the First Affiliated Hospital of Chongqing Medical University, Chongqing, 400016
Supported by the National Clinical Key-discipline Construction Program of China (2012-649)
Corresponding author: CHEN Hongyan, E-mail: chenhongyan1963@hotmail.com
[Abstract] Objective To investigate the effect of siRNA mediated FoxM1 silencing on malignant behaviors of nasopharyngeal carcinoma cell line 5-8F via Wnt/β-catenin signaling pathway. Methods The FoxM1-siRNA by chemical synthesis was transfected into 5-8F cells, and the blank and negative control cells were set up. Real-time PCR (RT-PCR) and Western blotting were used to detect the mRNA and protein levels of FoxM1 respectively. MTT assay, flow cytometry and Transwell chamber test were used to determine the effect of FoxM1 on proliferation, apoptosis, cell cycle distribution and migration of 5-8F cells. The protein expression levels of β-catenin, C-Myc, Cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 were detected by Western blotting. Results The mRNA and protein levels of FoxM1 were decreased obviously after FoxM1-siRNA transfection in 5-8F cells (P < 0.05). When compared with the blank and negative control cells, the silence also inhibited the proliferation (P < 0.05), but enhanced apoptotic rate [(22.68±0.67)% vs (10.94±1.52)% and (11.74±1.36)%, P < 0.05], arrested the cell cycle at G0/G1 phase, and decreased the number of invaded cells (100.00±10.97 vs 233.70±12.41 and 246.00±6.66) and cell migration ability (P < 0.05). Furthermore, Western blotting demonstrated that the nuclear protein level of β-catenin and the total protein levels of C-Myc, Cyclin D1, MMP-2 and MMP-9 were decreased after FoxM1-siRNA transfection (P < 0.05). Conclusion siRNA mediated FoxM1 silencing increases the apoptotic rate, inhibits the proliferation, reduces the migration, and arrests cell cycle at G0/G1 phase in nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells. Its mechanism may be through suppressing the expression of β-catenin, key protein of Wnt signaling pathway, and thus inhibiting the activation of the pathway.
[Key words] nasopharyngeal carcinoma     FoxM1     Wnt/β-catenin signaling pathway     proliferation     migration    

鼻咽癌是具有地方流行性的头颈部恶性肿瘤,常见于我国南方地区[1]。现代影像、放疗技术的改进和化疗的应用,使鼻咽癌局控率得到明显提高,但复发和远处转移现已成为鼻咽癌治疗失败的主要原因[2]。研究鼻咽癌发病的分子机制,为复发和远处转移的治疗提供新思路具有重要性和必要性。人叉头盒M1(forkhead box M1,FoxM1)转录因子,属于Forkhead转录因子家族,共享该家族中长100个氨基酸序列的“翼状螺旋”DNA结合结构域[3]。FoxM1在胚胎组织、多种肿瘤组织中高表达,而在分化成熟的细胞中不表达或者低表达[4],对肿瘤分子诊断和靶向干预研究具有重要意义。FoxM1促进多种肿瘤细胞增殖、抑制凋亡、促进细胞衰老、侵袭转移、血管生成[4]。研究表明,在18 000例39种人类恶性肿瘤中,FoxM1已成为主要的不良预后指标[5]。β-catenin是Wnt信号转导通路中的关键信号分子,Wnt通路活化促进β-catenin在胞质中积聚并进入胞核,作用在TCF/LEF启动子上,在转录水平调控Wnt靶基因的表达[5]。经典的Wnt/β-catenin信号通路在肿瘤新陈代谢、胚胎发育、细胞结局、上皮间质转化中具有重要作用[6]。Wnt信号通路可诱导FoxM1去泛素化,稳定FoxM1的结构和表达,从而驱动β-catenin入核,促进肿瘤恶性生物学行为相关基因的转录[7]

本课题组前期研究结果显示,FoxM1在鼻咽癌组织中高表达,其阳性率为68.8%,并与鼻咽癌临床分期与组织分型密切相关[8],下调FoxM1抑制鼻咽癌细胞株CNE-2、C666的增殖、侵袭、转移,诱导细胞凋亡[9],但对其机制缺乏进一步研究。因此,本研究采用siRNA技术下调FoxM1表达,探讨FoxM1是否通过促进Wnt通路关键蛋白β-catenin的核转位,促进其与下游启动子结合而提高下游基因的转录水平,由此影响鼻咽癌恶性生物学行为。

1 材料与方法 1.1 材料

人鼻咽癌5-8F细胞株购自广州吉赛生物科技有限公司。胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购自德国PAN-biotech公司,RPMI1640培养基、四甲基偶氮唑盐(methyl thiazolyl tetrazolium,MTT)、二甲基亚砜(dimethyl sfoxido,DMSO)、2.5 g/L胰蛋白酶购自Sigma公司。Transwell小室、基质胶购自BD公司。RNA提取试剂TRIzol、逆转录试剂盒、SYBR Green购自TaKaRa公司。RIPA蛋白裂解液、二辛可宁酸(bicinchoninc acid,BCA)法蛋白提取试剂盒购自上海碧云天公司。核蛋白提取试剂盒购自上海贝博公司。PVDF膜、ECL化学发光试剂盒购自Milipore公司。兔抗人FoxM1单克隆抗体(monoclonal antibody,mAb)、兔抗人β-catenin mAb、兔抗人MMP-2 mAb、兔抗人MMP-9 mAb、兔抗人C-MycmAb、兔抗人Cyclin D1 mAb、兔抗人GAPDH mAb均购自Abcam公司。辣根过氧化物酶标记的山羊抗兔IgG购自武汉博士德公司。PCR引物由TaKaRa公司合成。

1.2 方法

1.2.1 细胞培养

人鼻咽癌5-8F细胞于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中,置37 ℃、50 mL/L CO2饱和湿度的孵箱中培养。每24小时观察细胞状态,PBS清洗换液。待细胞融合度约80%时行细胞传代。

1.2.2 FoxM1-siRNA最佳序列筛选

选取本课题组前期筛选最佳FoxM1-siRNA序列,由上海吉玛公司合成。转染人5-8F细胞株,利用荧光定量PCR及Western blot检测下调效果。

1.2.3 细胞转染

6孔板铺板,每孔20万细胞,待细胞贴壁后,将siRNA、转染试剂siRNA-mate、无血清1640混合物加入6孔板。设置FoxM1-siRNA组(细胞转染靶向FoxM1的siRNA)、阴性对照组(细胞转染NC-siRNA),以未经处理的细胞作为空白对照组,转染24~72 h进行后续实验。

1.2.4 荧光定量PCR检测人5-8F细胞株FoxM1 mRNA水平

取处于对数生长期的人鼻咽癌5-8F细胞,转染48 h后,按PCR试剂说明书提取细胞总RNA,并反转录为cDNA,进行PCR扩增。FoxM1上游引物为5′-GAACTCCATCCGCCACAACC-3′,下游引物为5′-TTGGCACTGGGGTGAATGG-3′;β-actin上游引物为5′-CC-ACGAAACTACCTTCAACTCC-3′,下游引物为5′-GTG-ATCTCCTTCTGCATCCTGT-3′。反应体系体积为10 μL,用量分别为:SYBR Green 5.0 μL、cDNA 1.0 μL、上游引物0.4 μL、下游引物0.4 μL,DEPC水3.2 μL。反应条件:95 ℃预变性30 s,(95 ℃变性5 s,60 ℃退火60 s)×40个循环。FoxM1的mRNA相对表达量采用2-ΔΔCt公式计算。

1.2.5 Western blot检测FoxM1及Wnt信号通路相关基因的蛋白水平

人鼻咽癌5-8F细胞转染48 h后,分别提取FoxM1-siRNA组、NC-siRNA阴性对照组、空白对照组细胞总蛋白及核蛋白。沸水高温变性10 min后,行100 g/L SDS-PAGE,PVDF转膜,5%蛋白干粉TBST封闭2 h,分别加入1:800稀释的兔抗人FoxM1 mAb,1:5 000兔抗人β-catenin mAb,1:2 000兔抗人MMP-2 mAb、兔抗人MMP-9 mAb、兔抗人GAPDH mAb,1:600兔抗人C-Myc mAb、兔抗人Cyclin D1 mAb,4 ℃孵育过夜。TBST清洗3次,每次5 min,加入1:2 000稀释的辣根过氧化酶标记山羊抗兔IgG于37 ℃敷箱孵育1 h。TBST清洗3次,每次约10 min,ECL化学发光试剂盒显影,实验重复3次。

1.2.6 MTT法检测下调FoxM1后对5-8F细胞增殖的影响

人鼻咽癌5-8F细胞转染24 h后,收集各组细胞制成悬液,于96孔板接种细胞,每孔200 μL体系,每孔细胞2×103个,设6个复孔,置于敷箱中培养。分别在培养24、48、72、96 h后,每孔加入5 mg/mL的MTT溶液20 μL,敷箱中培养4 h,抽去液体,每孔加入150 μL DMSO,避光震荡10 min,酶标仪检测各孔光密度值[D(570)],绘制生长曲线。

1.2.7 Transwell小室法检测下调FoxM1对5-8F细胞迁移能力的影响

在24孔板内放置Transwell小室,转染人鼻咽癌5-8F细胞,24 h后制成细胞悬液,将含4×103个细胞的悬液400 μL加入上室。含10%胎牛血清的RPMI1640培养基600 μL加入下室。置于敷箱内培养,培养20 h,取出小室,40 g/L多聚甲醛固定20 min,结晶紫染色5 min。PBS冲洗后,显微镜下随机5个视野(×100)计数穿膜细胞,每组实验重复3次。

1.2.8 Annexin V-FITC/PI双染色结合流式细胞术检测5-8F细胞凋亡

细胞转染48 h后,收集各组细胞,预冷PBS清洗2遍,加入500 μL的结合缓冲液重悬细胞,再加入5 μL的Annexin V-FITC,混匀后避光温室敷育15 min,上机前5 min,加入5 μL的PI染色,每组实验重复3次。

1.2.9 流式细胞术检测细胞周期

细胞转染48 h后,收集各组细胞,预冷PBS清洗2遍,以700 mL/L预冷无水乙醇重悬,4 ℃固定过夜后,PBS清洗2次,加入50 μg/mL PI和100 μg/mL RNA酶A,4 ℃避光孵育30 min后检测。

1.3 统计学分析

采用Graphpad软件对数据进行统计学分析,计量资料以x±s表示,两组比较采用独立样本的t检验,多组比较采用方差分析。检验水准α=0.05。

2 结果 2.1 siRNA转染5-8F细胞后FoxM1 mRNA和蛋白表达水平降低

荧光定量PCR检测结果显示,FoxM1-siRNA组中FoxM1 mRNA表达水平较阴性对照组和空白对照组显著降低(P<0.05,图 1)。Western blot检测结果显示,FoxM1-siRNA组中FoxM1蛋白表达水平较阴性对照组和空白对照组显著降低(P<0.05,图 2)。阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

a:P<0.05,与空白对照组和阴性对照组比较 图 1 荧光定量PCR检测各组细胞转染siRNA 48 h后FoxM1 mRNA的表达

A:Western blot检测结果  1:FoxM1-siRNA组;2:阴性对照组;3:空白对照组;B:半定量分析结果  a:P<0.05, 与空白对照组和阴性对照组比较 图 2 Western blot检测各组细胞转染siRNA 48 h后FoxM1蛋白的表达

2.2 下调FoxM1表达可抑制5-8F细胞增殖

采用MTT法检测下调FoxM1表达后对5-8F细胞增殖的影响,结果显示,FoxM1-siRNA组D(570)值增长缓于阴性对照组和空白对照组(P<0.05,图 3),细胞增殖受到抑制。阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

a:P<0.05,与空白对照组和阴性对照组比较 图 3 MTT法检测下调FoxM1后对5-8F细胞增殖的影响

2.3 下调FoxM1表达诱导5-8F细胞凋亡

细胞转染48 h后采用流式细胞术检测5-8F细胞凋亡率,结果显示,FoxM1-siRNA组的凋亡率较阴性对照组和空白对照组明显提高(P<0.05,图 4);阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义(P>0.05)。

A:流式细胞术检测各组细胞凋亡;B:细胞凋亡率半定量分析  1:FoxM1-siRNA组;2:阴性对照组;3:空白对照组; a:P<0.05, 与空白对照组和阴性对照组比较 图 4 流式细胞术检测下调FoxM1表达后对5-8F细胞凋亡的影响

2.4 下调FoxM1表达诱导5-8F细胞周期G0/G1期阻滞

细胞转染48 h后采用流式细胞术检测5-8F细胞周期,结果显示,下调FoxM1表达后,G0/G1期细胞数量增加,FoxM1-siRNA组G0/G1期比例较阴性对照组和空白对照组提高(P<0.05)。与对照组相比,下调FoxM1表达后,S期细胞数量明显减少(P<0.01);G2期无显著改变(P>0.05,图 5)。

A:流式细胞术检测结果;B:细胞周期分布  1:FoxM1-siRNA组;2:阴性对照组;3:空白对照组;a:P<0.05,b:P<0.01,与空白对照组和阴性对照组比较 图 5 流式细胞术检测下调FoxM1对各组5-8F细胞凋亡的影响

2.5 下调FoxM1表达可抑制5-8F细胞迁移能力

Transwell迁移实验结果显示,FoxM1-siRNA组细胞穿膜数明显低于阴性对照组和空白对照组,细胞迁移能力降低,差异均有统计学意义(P<0.01,图 6)。阴性对照组和空白对照组间差异无统计学意义(P>0.01)。

A:Transwell检测结果(结晶紫×100);B:各组迁移细胞数  1:FoxM1-siRNA组;2:阴性对照组;3:空白对照组; a:P<0.01,与空白对照组和阴性对照组比较 图 6 下调FoxM1对各组5-8F细胞迁移能力的影响

2.6 下调FoxM1对Wnt通路下游蛋白表达的影响

Western blot检测各组细胞中Wnt通路相关蛋白的表达,结果显示,在细胞总蛋白水平,FoxM1-siRNA组C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表达较空白对照组、阴性对照组明显下调(P<0.05)。β-catenin蛋白表达量差异无统计学意义(P>0.05),而在细胞核中,FoxM1-siRNA组β-catenin蛋白表达水平明显下调(P<0.01,图 7)。

1:FoxM1-siRNA组;2:阴性对照组;3:空白对照组
A、C、E:Western blot检测5-8F细胞β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表达水平;B、D、F:5-8F细胞β-catenin、C-Myc、Cyclin D1、MMP-2、MMP-9表达水平半定量分析  a:P<0.05,b:P<0.01,与空白对照组和阴性对照组比较
图 7 下调FoxM1对Wnt通路下游蛋白表达的影响

3 讨论

鼻咽癌具有种族易感性与地域集中性。早期鼻咽癌患者以放疗为主,但有约30%的鼻咽癌患者出现复发或远处转移,严重影响预后及生存[2]。随着放化疗方案逐渐演变,靶向治疗、免疫抑制剂和其他免疫治疗陆续被提出,迫切要求研究鼻咽癌恶性生物学行为的分子机制,为鼻咽癌治疗提供新策略。

FoxM1又名HNF-3、HFH-11、MPP2、Win或者Trident[10],作为经典的增殖相关性转录因子,调控细胞周期G1/S、G2/M期与有丝分裂[11]。研究表明,FoxM1广泛高表达于多种恶性肿瘤,引起基因组失稳与细胞分裂失控,在胰腺、结肠、胃、肝脏、肺部、脑部、胸部、前列腺、神经系统和血液系统肿瘤中均有报道[12]

本研究首先利用RT-PCR与Western blot技术,验证课题组前期筛选出的最优FoxM1-siRNA序列,结果显示,FoxM1-siRNA实验组中FoxM1的mRNA、蛋白表达水平较对照组明显降低,提示FoxM1下调成功。随后对3组细胞行MTT实验,流式细胞术检测细胞凋亡与细胞周期,结果显示,下调FoxM1后人鼻咽癌5-8F细胞增殖能力明显减弱,细胞凋亡率上升,细胞周期阻滞在G0/G1期。与WEI等[13]在黑素瘤细胞A375和SK-MEL-2中,BARGER等[14]在卵巢癌细胞COV362中的研究结果一致。本课题组研究发现,叉头结构域抑制物6(FDI-6)通过下调细胞核FoxM1增加喉癌细胞凋亡并抑制其侵袭和迁移[15]。有研究表明,在三阴性乳腺癌中,FoxM1通过调节真核延伸因子2激酶eEF2K,促进肿瘤侵袭迁移[16]。MicroRNA630通过靶向调节FoxM1抑制胃癌细胞侵袭迁移[17]。FoxM1通过与HSPA5启动子结合提高其转录水平,促进结直肠癌的侵袭迁移[2]。本研究进一步行细胞迁移实验,结果显示,下调FoxM1表达后,5-8F细胞的迁移能力也明显减弱。

而FoxM1对人鼻咽癌5-8F细胞恶性生物学行为造成以上影响的机制如何呢?Wnt信号通路的失调已被证实与多种肿瘤恶性生物学行为密切相关,Wnt信号通路异常激活,通过GSK3-Axin复合体,抑制FoxM1磷酸化,使其与去泛素化酶USP5相互作用,从而导致FoxM1去泛素化并维持其稳定性[18]。FoxM1在细胞核中积累,并促进Wnt通路靶基因启动子招募β-catenin,通过使β-catenin/TCF4复合体免受ICAT竞争性抑制激活Wnt信号通路[18]。Wnt通路激活引起的FoxM1去泛素化,是调控经典Wnt信号通路与细胞增殖的重要机制。在骨肉瘤中,FoxM1与β-catenin可在细胞质与细胞核内直接结合,增强β-catenin核转录,促进其与TCF4形成复合物结合在Wnt靶基因启动子上,增强Wnt通路活性[19]。JIANG等[20]也报道,下调β-catenin可抑制人鼻咽癌细胞CNE2增殖、降低其侵袭能力、影响肿瘤干性。针对MNK-eIF4E轴的抑制剂CGP57380下调β-catenin入核后,可抑制鼻咽癌细胞增殖与细胞周期进展、降低其迁移、侵袭和转移能力[21]

本实验Western blot检测发现,成功下调FoxM1后β-catenin核蛋白表达明显降低,并伴随Wnt通路靶基因C-Myc、Cyclin D1蛋白表达下降,提示FoxM1可能通过影响β-catenin入核,异常激活Wnt信号通路,影响鼻咽癌恶性生物学行为。Cyclin D1作为Wnt通路下游靶基因,是调节细胞周期的关键蛋白,可与CDK4/CDK6结合,在细胞周期G1到S期转换中起重要作用[22]。而C-Myc是MYC癌基因家族中的一员,其在多种肿瘤细胞中高表达,并可促进细胞周期由静止期向S期转换[23-24]。又有研究表明,MMP-2、MMP-9为Wnt/β-catenin信号通路下游靶基因[25],而本实验成功下调FoxM1后,MMP-2、MMP-9蛋白表达明显降低,进一步说明FoxM1可通过Wnt/β-catenin通路调节5-8F细胞侵袭迁移能力。

肿瘤的发生、发展是多因素共同作用的结果,本实验表明,FoxM1可能通过Wnt/β-catenin通路调节5-8F细胞的恶性生物学行为,而FoxM1又与多条肿瘤相关信号通路的异常激活相关,FoxM1是EGF-P13K-AKT-FOXO信号轴增殖和化疗药物相关的重要下游效应因子[4],FoxM1可激活SMAD3/SMAD4信号通路,促进TGF-β依赖的肿瘤侵袭[26],FoxM1参与多行性胶质母细胞瘤的发展,MELK-FOXM1信号轴是潜在的治疗目标[27]。此外,FoxM1还与NF-κB、P53、JNK、MAPK、RAF等信号通路关系密切[4, 28-29]。Wnt通路也能够协同或拮抗其他信号通路调节肿瘤的增殖,迁移和侵袭[30]。鼻咽癌中FoxM1与多条通路之间的相互关联有待进一步研究。

总之,通过siRNA下调FoxM1,可抑制鼻咽癌细胞5-8F的增殖、诱导细胞凋亡、降低细胞迁移能力,使细胞周期阻滞于G0/G1期。其机制可能是通过抑制Wnt通路关键蛋白β-catenin的核转位,抑制其与下游启动子结合而抑制下游基因的转录水平实现的。本实验表明,可通过影响Wnt/β-catenin通路靶向FoxM1,从而为鼻咽癌治疗提供新思路。研究鼻咽癌中Wnt-FoxM1相关性,进一步深入β-catenin作为转录因子与下游启动子的相关关系研究,筛选主要靶基因和靶向药物,成为课题组后续主要目标。

参考文献
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http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201709189
中国人民解放军总政治部、国家科技部及国家新闻出版署批准,
由第三军医大学主管、主办

文章信息

万婕, 祝琳, 雷越, 刘亚男, 文韬宇, 李丹丹, 叶琳, 陈鸿雁.
WAN Jie, ZHU Lin, LEI Yue, LIU Yanan, WEN Taoyu, LI Dandan, YE Lin, CHEN Hongyan.
FoxM1通过Wnt/β-catenin信号通路对鼻咽癌细胞5-8F增殖、迁移的影响
Effect of siRNA mediated FoxM1 silencing on proliferation and migration of nasopharyngeal carcinoma 5-8F cells via Wnt/β-catenin signaling pathway
第三军医大学学报, 2018, 40(5): 380-386, 414
Journal of Third Military Medical University, 2018, 40(5): 380-386, 414
http://dx.doi.org/10.16016/j.1000-5404.201709189

文章历史

收稿: 2017-09-24
修回: 2017-11-06

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