骨髓增生异常综合征(myelodysplastic syndrome，MDS)是一种生物学和临床上的异质性克隆造血系统疾病，其特征是骨髓分化异常、无效造血和日益增加的基因组不稳定性，在临床表现为血细胞减少，髓系细胞一系或多系病态造血，高风险转化为急性髓系白血病等[1]。由于缺乏明确的分子靶点，前线的药理学疗法没有明显疗效，因而除了有资格进行干细胞移植的一小部分患者外，大多数MDS患者的预后都不良[2-3]。因此，迫切需要描述阐明MDS发病机制中涉及的分子机制，以便建立良好的诊断标准和具体有效的靶向治疗。
2006年STEINBACH等[4]研究发现在急性髓系白血病患者中SPAG6与WT1等7个基因表达明显增高，提示该基因在白血病中可能具促癌效应。本课题组前期研究表明SPAG6基因沉默后具有抑制MDS细胞生长，促进其凋亡的作用[5-6]。进一步研究提示SPAG6可能是通过抑制FADD的表达及其与死亡受体DR4/DR5之间的相互作用进而抑制TRAIL信号通路的线粒体途径和非线粒体途径来调控细胞凋亡[7]。而P53作为最重要的抑癌基因之一，在TRAIL信号通路中既可诱导TRAIL死亡受体DR4和DR5的表达调控线粒体通路；又可诱导Bax等凋亡蛋白的表白，抑制Bcl-2抗凋亡蛋白的表达调控非线粒体通路[8]。基于以上事实，本研究拟通过慢病毒载体介导的RNA干扰技术，降低SKM-1细胞中P53和SPAG6的表达，研究SPAG6基因是否以P53依赖方式促进TRAIL诱导的MDS细胞凋亡。为进一步阐明SPAG6在MDS发病中的作用机制提供理论依据和奠定实验基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂RPMI1640培养基、胰蛋白酶消化液(美国Corning公司)；胎牛血清(德国PAN-Biotech GmbH公司)；DMEM培养基(美国HyClone公司)；嘌呤霉素(Sigma公司)；RNA提取试剂盒、逆转录试剂盒、定量PCR试剂盒、SPAG6、P53及GAPDH上下游引物(日本TaKaRa公司)；BCA蛋白定量试剂盒(Beyotime)；P53、Caspase-8、PARP、cleaved-PARP等兔单克隆抗体及SPAG6兔多克隆抗体(美国Abcam公司)；GAPDH兔多克隆抗体、山羊抗鼠二抗(Beyotime)；山羊抗兔二抗(美国Abbkine公司)；CCK-8试剂盒(日本同仁化学DOJINDO)；人结肠癌细胞株HCT116来自本院消化内科实验室赠送；人MDS细胞株SKM-1细胞由本课题组冻存；上海吉凯基因化学技术有限公司提供包括质粒pHelper1.0、pHelper2.0及GV118载体和GV298载体等在内的慢病毒载体系统。
1.2 方法 1.2.1 细胞培养HCT116细胞和SKM-1细胞培养于含10%胎牛血清的RPMI1640培养基中；293T细胞培养于含10%胎牛血清的DMEM培养基中。
1.2.2 慢病毒载体的构建针对目的基因序列，根据RNAi序列设计原则设计3条RNA干扰P53基因的靶点序列及1条通用型阴性对照序列(表 1)。合成双链DNA寡核苷酸→转化感受态大肠杆菌DH5α→筛选阳性克隆并测序鉴定→感染293T细胞收集浓度慢病毒→测定慢病毒滴度[5]。
| 序列名称 | 靶序列(5′→3′) | 基因中的位置 | GC含量(%) |
| TP53-siRNA1 | GACTCCAGTGGTAATCTAC | 420~439 bp | 47.40 |
| TP53-siRNA2 | CCATCCACTACAACTACAT | 350~369 bp | 42.10 |
| TP53-siRNAi3 | GCACAGAGGAAGAGAAT | 375~392 bp | 47.10 |
| NC-siRNA | TTCTCCGAACGTGTCACGT | - | 52.63 |
1.2.3 P53kd RNA慢病毒感染HCT116
取对数期生长的HCT116细胞计数后以3×104/孔铺12孔板，实验分为1个阴性对照组和3个干扰组。24 h后细胞融合度在20%~30%时，用上述得到的经测序验证正常的对应慢病毒液按MOI=15分别加入上述对应组的孔板中，12 h后吸弃含病毒的上清培养液，添加新鲜完全培养基，于CO2孵箱中继续培养，隔天换液。5 d后荧光显微镜下观察红色荧光蛋白(RFP)的表达，并将细胞消化离心重悬混匀后取部分用流式细胞术检测转染率。
1.2.4 RT-PCR分析成功感染后于第8天分别提取细胞总RNA，测浓度后反转录为cDNA，再利用特异性引物(表 2)进行定量PCR扩增反应，以GAPDH为内参，2-ΔΔCt法分析P53 mRNA的相对表达水平。
| 基因 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度(bp) |
| P53 | 上游5′-GAGGTTGGCTCTGACTGTACC-3′ 下游5′-TCCGTCCCAGTAGATTACCAC-3′ |
133 |
| SPAG6 | 上游5′-CCTTTCAGCTCTCAGTCAGGTTTC-3′ 下游5′-TCTTCACGTTTCATCCTTGTCCTT-3′ |
119 |
| GAPDH | 上游5′-CTTTGGTATCGTGGAAGGACTC-3′ 下游5′-GTAGAGGCAGGGATGATGTTCT-3′ |
132 |
1.2.5 Western blot检测P53 mRNA的干扰效果
成功感染后于第8天提取细胞总蛋白，测浓度后按最低浓度配平并按比例加上样缓冲液煮沸3~5 min变性后于－20 ℃保存。制备10%的凝胶，取50 μg总蛋白进行SDS-PAGE电泳2 h后湿转1 h到PVDF膜上，用含5%牛血清白蛋白(BSA)的TBST封闭液封闭4 h。TBST洗3次后孵育一抗4 ℃过夜。第2天TBST洗涤5次，与二抗室温孵育1 h。TBST洗涤3次。Quantity One软件分析灰度值，以目的蛋白灰度值/GAPDH灰度值表示目的蛋白的相对表达量，结果以3次及以上取平均值表示。
1.2.6 SKM-1 P53kd细胞株的建立 1.2.6.1 SKM-1细胞的P53慢病毒感染将P53kd RNA和P53kd RNA慢病毒载体取MOI=20感染SKM-1细胞，每组加入终浓度为5 μg/mL的polybrene感染增强剂。12 h后离心弃上清，添加新鲜培养液。48 h后更换含有终浓度0.5 μg/mL嘌呤霉素的培养基进行筛选。15 d后荧光显微镜下观察RFP表达情况。
1.2.6.2 RT-PCR和Western blot检测P53的表达方法同1.2.4和1.2.5。
1.2.7 SPAG6kd RNA慢病毒的感染将SPAG6慢病毒以MOI=20感染SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞，每组均加入终浓度5 μg/mL的polybrene，不加嘌呤霉素。6 d后在荧光显微镜下观察绿色荧光(GFP)表达情况，取部分细胞用流式细胞术检测转染效率。
1.2.8 RT-PCR和Western blot检测SPAG6的干扰情况方法同1.2.4和1.2.5。
1.2.9 CCK-8检测细胞增殖在SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞中成功干扰SPAG6第6天后，取细胞接种于96孔板，每孔100 μL培养液中接种1×104个细胞，接种24 h后分别加入0、10、30、100、300、1 000 ng/mL不同浓度的rTRAIL蛋白，12 h后每孔加入10 μL CCK-8试剂，37 ℃孵育3.5 h后在酶标仪上测定光密度值D (450)。绘制细胞生长曲线并按照公式计算出能明显引起细胞抑制的rTRAIL蛋白浓度。
1.2.10 rTRAIL诱导细胞凋亡用上述实验得到的rTRAIL蛋白浓度处理成功干扰SPAG6的SKM-1细胞和SKM-1P53kd细胞12 h后，提取总蛋白，Western blot检测各组细胞Caspase-8、cleaved-PARP、PARP的表达变化。方法同1.2.5。
1.3 统计学方法采用SPSS 18.0统计软件，多组间数据的差异采用单因素方差分析，两独立样本组间比较采用t检验，计量资料以x±s表示，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 HCT116细胞中P53kd RNA慢病毒载体的转染率及敲低P53基因有效靶点的确定在P53kd RNA慢病毒载体转染HCT116后，荧光显微镜下可见：与白光下对比，几乎所有细胞均表达红色荧光，流式细胞术检测转染率均在85%以上。提示P53kd RNA慢病毒载体成功转染了HCT116细胞。qRT-PCR检测结果显示，3条靶序列均能有效降低P53 mRNA表达水平(P < 0.01)；Western blot检测结果也提示，相对于阴性对照组(0.68±0.01)，3条干扰序列均能有效抑制P53蛋白表达(分别为0.09±0.01，0.17±0.04，0.17±0.04，P < 0.01)，其中P53kd RNA1的干扰效率最高，定为后续实验使用序列(图 1)。
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| A:白光观察干扰组HCT116细胞变化(×40)；B:荧光观察干扰组HCT116细胞变化(×40)；C:流式细胞术检测转染率；D:实时定量RT-PCR检测P53 mRNA表达；E:Western blot检测P53蛋白表达；1:阴性对照组；2:P53kd RNA1干扰组；3:P53kd RNA2干扰组；4:P53kd RNA3干扰组；a:P < 0.01，与阴性对照组比较 图 1 P53kd RNA慢病毒的干扰序列在HCT116细胞中筛选及验证 |
2.2 SKM-1 P53kd细胞模型的建立
在P53kd RNA1慢病毒载体转染SKM-1，经嘌呤霉素筛选后，荧光显微镜下见：与白光下对比，细胞几乎都表达RFP，转染率均在95%以上。提示P53kd RNA1慢病毒载体成功转染了HCT116细胞。qRT-PCR检测结果显示，干扰组中P53 mRNA表达水平显著降低(0.11±0.01，P < 0.01)；Western blot检测结果也提示，相对于阴性对照组(0.74±0.02)，干扰组能明显抑制P53蛋白表达(0.10±0.01，P < 0.01，图 2)。
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| A:白光观察干扰组SKM-1细胞变化(×40)；B:荧光观察干扰组SKM-1细胞变化(×40)；C:流式细胞术检测转染效率；D:Western blot检测P53蛋白表达；1:阴性对照组；2:P53kd RNA1干扰组 图 2 P53kd RNA慢病毒载体转染SKM-1细胞的转染效率及效果验证 |
2.3 在SKM-1和SKM-1 P53kd
细胞中敲低SPAG6基因的表达在SPAG6kd RNA慢病毒载体感染SKM-1和SKM-1 P53kd细胞，第6天后荧光显微镜下观察：与白光下细胞对比，绿光下大部分细胞均表达GFP，转染率在90%以上。RT-PCR检测结果显示，SPAG6kd RNA慢病毒载体能有效降低SKM-1和SKM-1 P53kd细胞中SPAG6 mRNA表达水平(分别为0.24±0.02，0.16±0.03，P < 0.01)；Western blot检测结果显示，在两种细胞中相对于阴性对照组(分别为1.54±0.09，0.87±0.13)，干扰组均能有效抑制SPAG6蛋白表达(分别为0.41±0.03，0.25±0.03，P < 0.01，图 3)。
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| A:白光观察干扰组SKM-1细胞变化(×40)；B:绿色荧光观察干扰组SKM-1细胞变化(×40)；C:Western blot检测SPAG6蛋白表达；1:阴性对照组；2:SPAG6kd RNA慢病毒干扰组 图 3 SPAG6kd RNA慢病毒载体转染SKM-1及SKM-1 P53kd细胞的转染效率及效果验证 |
2.4 不同浓度rTRAIL蛋白激活细胞TRAIL凋亡通路
CCK-8法检测结果显示，TRAIL处理细胞12 h后，30 ng/mL TRAIL诱导的细胞凋亡与对照组差异没有统计学意义，100 ng/mL和300 ng/mL TRAIL显著诱导SPAG6kd细胞凋亡，而P53基因沉默与否并没有影响该结果(P < 0.05，图 4)。
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| a：P < 0.05，与NCkd RNA比较 图 4 CCK-8检测SKM-1细胞(A)和SKM-1 P53kd细胞(B)转染慢病毒SPAG6后第6天用不同浓度rTRAIL处理后细胞的增殖变化 |
2.5 rTRAIL诱导细胞凋亡在SKM-1细胞和SKM-1 P53kd细胞中相似
100 ng/mL和300 ng/mL的rTRAIL处理细胞后，能显著诱导SPAG6kd细胞凋亡，取差异相对最显著的100 ng/mL TRAIL处理细胞后，Western blot检测细胞凋亡标志分子，Quantity One分析结果提示：SKM-1细胞中，与对照组相比，SPAG6kd细胞组Caspase-8和cleaved-PARP的蛋白表达较对照组显著升高，PARP表达差异无统计学意义(P < 0.05, P < 0.01，图 5A、B)。SKM-1 P53kd细胞和SKM-1细胞结果相似(P < 0.05，P < 0.01，图 5C、D)。
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| 1:SPAG6kd RNA+ rTRAIL组；2:SPAG6kd RNA组；3：NCkdRNA+ rTRAIL组；4:NCkdRNA组；a：P < 0.05, 与NCkdRNA+ rTRAIL组比较；b：P < 0.05，与NCkdRNA组比较 图 5 Western blot检测SKM-1细胞(A、B)和SKM-1 P53kd细胞(C、D)中PARP、cleaved-PARP及Caspase-8的表达 |
3 讨论
SPAG6基因是NEILSON等[9]在1999年首次成功克隆出来的，该基因位于10p12.3。目前对该基因的认识还比较局限，既往研究表明SPAG6基因高度保守，主要在睾丸中高度表达，在具有运动纤毛的组织中少量表达，其他正常组织几乎不表达，当其缺失或沉默时，小鼠表现为精子鞭毛运动能力下降[10-11]，所以一般认为SPAG6主要与生殖相关。2011年SILINA等[12]研究发现在包括胃癌、肺癌等多种实体瘤患者癌组织中SPAG6表达明显增高，提示SPGA6可能与肿瘤的形成有关。在采用SNP芯片技术研究中发现，半数以上的MDS病例，包含SPAG6等7个基因在内的UPD区域仅出现于MDS髓系细胞，而在对应T细胞中并未出现，并且该研究组在检测MDS患者所有基因组mRNA表达情况时发现SPAG6基因在MDS患者中表达较正常对照组明显增高[13-14]，表明SPAG6可能在MDS的发病机制中起重要的促癌作用。
RNA干扰技术是一个强大的抑制特定基因的表达工具，慢病毒载体是以人类免疫缺陷型病毒(HIV)为基础发展起来的基因治疗载体，可以将外源基因特异地整合至宿主染色体上从而达到持久性表达[15]。因此我们采用RNA干扰的方式建立P53基因低表达的SKM-1 P53kd模型，并且成功创建SPAG6和P53双基因敲低模型。在TRAIL凋亡通路中，TRAIL结合死亡受体DR4和DR5通过衔接蛋白FADD产生启动型Caspase-8，启动型Caspase-8可以通过线粒体介导及非线粒体介导两种凋亡途径引起细胞凋亡[8]。多聚ADP核糖聚合酶(poly ADP-ribose polymerase，PARP)是Caspase-3的经典产物之一，它被启动型Caspase-3切割后功能丧失，进而引起细胞凋亡[16]。因此，我们选取PARP、cleaved-PARP及Caspase-8作为监测TRAIL信号通路中细胞凋亡的指标分子。
本研究用rTRAIL诱导细胞后，发现随着rTRAIL浓度的增加，细胞凋亡也在增加，而沉默SPAG6基因后的细胞对rTRAIL的刺激更为敏感，说明SPAG6基因具有抵抗凋亡效应。进一步研究发现，rTRAIL诱导后，SPAG6kd组细胞凋亡显著高于对照组，而P53基因沉默与否并没有影响该结果。结合前期研究结果SPAG6调控细胞TRAIL凋亡机制可能是通过抑制FADD的表达及其与死亡受体间的相互作用[13]，说明SPAG6可能以非P53依赖的方式促进TRAIL诱导的MDS细胞凋亡，补充阐明MDS在TRAIL信号通路中的作用机制，为后续深入的MDS机制研究提供理论参考依据。不足之处在于本研究主要是在体外细胞水平完成，缺乏相应的体内动物实验和临床实验数据支持，我们将在后续的实验中进一步验证。
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