截至2016年10月底，我国已经有666 161位HIV感染者[1]。对大量的HIV-1感染者实行高效抗逆转录病毒治疗(highly active antiretroviral therapy，HAART)，可以增加患者的CD4淋巴细胞数量，降低病毒载量，减少HIV感染者的人数和HIV病毒的传播速度[2]。然而，HIV-1病毒极易突变，会选择性地改变药物作用靶点蛋白酶(protease，PR)和逆转录酶(reverse transcriptase，RT)的部分基因位点[3]。传播性耐药突变是指长期使用免费抗病毒药物后，HIV-1感染者会产生耐药病毒株，这些耐药病毒株在人群中传播，从而造成新确证未治疗的HIV-1感染者出现耐药[4]。目前还不能对每个患者进行个体化耐药基因型检测，而抗病毒治疗药物的种类和来源十分有限，一旦出现耐药株的流行，将对重庆市的抗病毒治疗产生不利影响。因此，在新确证未治疗患者中开展耐药的监测，对于抗病毒治疗以及艾滋病的防治工作有着十分重要的意义。在2013年的报告中，重庆市新确证未治疗的HIV感染者传播性耐药突变检出率是2.1%，耐药毒株的流行属于低水平流行(<5%)[5]。为了解现阶段重庆市HIV-1耐药病毒株的流行情况和亚型分布，本研究对重庆市公共卫生医疗救治中心2014年5月至2017年6月间新确证未治疗的175例HIV-1感染者进行耐药基因检测。
1 对象与方法 1.1 标本来源收集重庆市公共卫生医疗救治中心2014年5月至2017年6月间新确证的175例血浆标本。根据WHO关于HIV耐药性传播的检测标准，纳入本次研究的感染者年龄>18岁，病毒载量达103/mL以上，未服用抗逆转录病毒药物治疗，经艾滋病确认实验室用蛋白印迹(Western blotting，WB)实验确认为HIV-1阳性。当WB结果不确定或阴性时，进行HIV-1核酸检测，以确保每个样本均来自新确证未治疗HIV-1感染者。本研究已通过医院伦理委员会的批准(2016GWZX001)，不符合以上标准的样本均不纳入本次研究。
1.2 CD4+T细胞计数检测使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集静脉血2 mL，采用Trucount管及流式细胞检测仪(美国BD公司)进行分析检测标本的CD4+T细胞数量。
1.3 HIV-RNA载量检测使用乙二胺四乙酸(EDTA)抗凝管采集静脉血10 mL，全血离心留取血浆。冻存至-80 ℃冰箱中。采用Roche公司的COBAS® Ampliprep试剂盒检测HIV-RNA载量。
1.4 基因型耐药性检测采用QIAamp病毒核酸提取试剂盒(德国QIAGEN公司)，参照操作说明提取研究对象血浆中的RNA。使用一步法RT-PCR试剂盒和PCR试剂盒(中国大连TaKaRa公司)分别进行一步法RT-PCR和巢式PCR，扩增片段为HIV-1pol基因区的蛋白酶及逆转录酶区，片段长约1 300 bp，一步法RT-PCR将RNA逆转录为cDNA，使用巢式PCR扩增病毒蛋白酶全序列和逆转录酶前300个氨基酸序列基因DNA片段。两轮扩增均在GeneAmp® 9700PCR仪(美国ABI公司)上进行。扩增产物经1%琼脂糖凝胶电泳检测出目的条带后，送至北京安普生化科技有限公司测序，测序在3100测序仪(美国ABI公司)上完成。所得核苷酸序列结果经Contig Express软件进行拼接校对，再用Bio Edit软件进行比对。把所得核苷酸序列输入ViroSeqHIV-1基因分析系统软件V2.8(美国雅培公司耐药数据库)进行比较分析，得出药物的耐药性解释。
1.5 HIV亚型分析将最终所得核苷酸序列导入NCBI的病毒基因分型工具(Viral Genotyping Tool)，选取2009 Refset进行基因分型鉴定(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/projects/genotyping/formpage.cgi)。
2 结果 2.1 基本情况168例得到测序结果的研究对象中，感染者的年龄以中青年为主，年龄(31±7)岁，最小18岁，最大51岁；性别以男性居多，男女比例为3.8:1(133 :35)，传播途径经同性性传播占64.2%(108例)，异性性传播占35%(58例)，另有不详0.8%(2例)。研究对象系长期生活工作在重庆各个区县，感染地均在重庆。CD4+T细胞数量为(303±124)个/μL[(90~584)个/μL]，病毒载量为(4.56±0.62)log10copies/mL[(3.39~5.97)log10copies/mL]。
2.2 HIV亚型分析将168例HIV-1扩增成功的有效序列导入NCBI的Viral Genotyping Tool，选取2009Refset进行基因分型鉴定，共发现有CRF07_BC、CRF01_AE、CRF08_BC、B、C、CRF55_01B、CRF 62_BC和CRF57_BC等8种亚型。具体亚型分布见表 1。
| 亚型 | 样本量(例) | 构成比(%) |
| CRF07_BC | 72 | 42.8 |
| CRF01_AE | 65 | 38.7 |
| CRF08_BC | 17 | 10.1 |
| B | 5 | 3.0 |
| C | 4 | 2.4 |
| CRF55_01B | 2 | 1.2 |
| CRF62_BC | 2 | 1.2 |
| CRF57_BC | 1 | 0.6 |
| 合计 | 168 | 100 |
2.3 基因型耐药突变位点
168例得到测序结果的标本中，有16例标本在RT区发现主要耐药突变位点，总的突变率为9.5%。其中NRTIs耐药相关突变位点有4例，突变率为2.4%(4/168)，M184V是出现最多的NRTI耐药突变位点(4例，2.4%)。NNRTIs耐药相关突变位点有16例标本，突变率9.5%(16/168)，V179D/E是出现最多的NNRTI耐药突变位点(12例，7.1%)。在PR区有4例标本检出次要突变位点，未发现主要耐药突变位点，突变率为0%。突变位点分布情况见表 2。
| RT区 | PR区a | |||||
| NRTI突变 位点 |
突变频数 (%) |
NNRTI突变 位点 |
突变频数 (%) |
次要突变 | 突变频数 (%) |
|
| M184V | 4(2.4) | V179D/E | 12(7.1) | A71V | 2(1.2) | |
| K65R | 3(1.8) | K103N | 4(2.4) | L10I | 1(0.6) | |
| A62V | 3(1.8) | G190A | 3(1.8) | Q58E | 1(0.6) | |
| D67N | 1(0.6) | Y181C | 3(1.8) | L10V | 1(0.6) | |
| T69D | 1(0.6) | K101E/P | 3(1.8) | |||
| V106M | 1(0.6) | |||||
| Y188L | 1(0.6) | |||||
| K238T | 1(0.6) | |||||
| a:在PR区未发现主要耐药突变位点 | ||||||
2.4 基因突变引起的耐药情况
本研究168例得到测序结果的标本中，检出16例耐药病毒株，总耐药比例为9.5%(16/168)，非核苷类反转录酶抑制剂(NNRTIs)、核苷类反转录酶抑制剂(NRTIs)和蛋白酶抑制剂(PIs)耐药突变率分别为9.5%、2.4%和0%。在NRTIs中，有3例标本检出对3TC、FTC、DDI、ABC和TDF中高度耐药，1例标本对3TC和FTC中高度耐药，由M184V单一突变引起。在NNRTIs中，有8例表现出对DLV及NVP的潜在低度耐药，8例表现出对DLV、NVP及EFV的中高度耐药。而由于目前的治疗方案中较少应用PIs药物，仅检出了PR区的次要突变位点，尚未检出主要突变位点，因此患者对PIs药物仍敏感。各亚型之间的耐药比例分别为CRF07_BC亚型9.7%(7/72)、CRF01_AE亚型9.2%(6/65)、CRF08_BC5.9%(1/17)、C亚型25% (1/4)、CRF55_01B亚型50%(1/2)。耐药情况见表 3。
| 亚型 | 非核苷类反转录酶抑制剂 | 核苷类反转录酶抑制剂 |
| CRF07-BC | 3TC, FTC, DDI, ABC, TDF | DLV, EFV, NVP |
| CRF07-BC | DLV, EFV, NVP | |
| CRF07-BC | DLV, NVP | |
| CRF07-BC | DLV, EFV, NVP | |
| CRF07-BC | DLV, NVP | |
| CRF07-BC | DLV, NVP | |
| CRF07-BC | DLV, EFV, NVP | |
| CRF08-BC | 3TC, FTC, DDI, ABC, TDF | DLV, EFV, NVP |
| CRF01-AE | 3TC, FTC, DDI, ABC, TDF | DLV, EFV, NVP |
| CRF01-AE | DLV, NVP | |
| CRF01-AE | DLV, EFV, NVP | |
| CRF01-AE | DLV, NVP | |
| CRF01-AE | 3TC, FTC | DLV, EFV, NVP |
| CRF01-AE | DLV, NVP | |
| CRF55-01B | DLV, NVP | |
| C | DLV, NVP | |
| 3TC：拉米夫定，FTC：恩曲他滨，DDI：去羟肌苷，ABC：阿巴卡韦，TDF：替诺福伟酯，DLV：地拉韦啶，NVP：奈韦拉平，EFV：依非韦仑 | ||
2.5 HIV-1耐药传播情况
根据美国雅培公司耐药数据库分析，2014年检测获得的57例序列中，发现4例针对RT区的主要耐药突变，耐药比例为7.0%(4/57)，2015年耐药比例为8.0%(2/25)，2016年耐药比例为9.1%(2/22)，2017年耐药比例为12.5%(8/64)，按WHO组织耐药警戒线推荐标准，总体上属于中度水平的耐药流行率(5%~15%)[6]。
3 讨论根据HIV-1的pol区亚型分型结果，通常将HIV-1分为3个组：M、O组和N组。目前流行的大部分HIV-1病毒株为M组，M组又可以分为多种亚型，其中我国主要流行的3种HIV-1亚型分别为B亚型、CRF07-BC亚型和CRF01-AE亚型 。从本研究结果可以看出，在重庆市流行多种HIV-1亚型，以CRF07_BC、CRF01_AE和CRF08_BC亚型占绝大部分比例，以上3种亚型属非B型，这可能与传播途径有关。B型主要通过输血传播，而非B型则通过性行为和静脉吸毒传播。由于本研究所收集的标本的传播途径主要是经性行为传播，其中以同性性行为传播为最主要，占比例为64.3%(108/168)，故应加强对该类人群的监测。
2005年欧洲一项多个国家参与的新发现HIV感染样本的调查研究中，耐药发生率为10%[9]。在2007年美国40个城市进行的一项研究表明，14%的新发HIV-1感染者至少存在一个耐药突变[10]。2009-2011年，我国深圳地区新发HIV-1耐药性毒株的流行率为17.2%[11]。本次研究中，我们对重庆市2014-2017年间部分未经治疗的新确证HIV-1感染者进行耐药检测，发现耐药比例有逐年上升的趋势，原发耐药比例增加可能有以下原因：①某些患者虽然系新确证感染HIV，但可能感染时间已经很长，病毒株已经在体内发生自发性突变，产生变异，引起原发性耐药，这种情况较少；②随着接受免费抗病毒治疗的人数增加，长期使用一线抗病毒药物，导致病毒学治疗失败的人数也会增加。这些治疗失败的患者中绝大部分发生耐药位点基因突变，产生耐药病毒株，这些耐药毒株传播给新的感染者，引起原发性耐药。这种情况占大部分[12]。在下一步的研究中，我们将对重庆市新确证病例中原发耐药毒株的耐药突变与重庆市HAART治疗失败患者的耐药突变模式进行比较，以印证新确证病例中原发耐药毒株的来源主要是治疗失败出现耐药的患者。
HIV是一种RNA逆转录病毒，其RNA逆转录酶具有复制能力却没有校正功能。病毒RNA逆转录到DNA本就容易出错，在药物的选择压力下，HIV更易出现变异，产生耐药突变，这是导致HIV耐药的根本因素[13]。本研究对耐药突变的发生情况进行了分析，发现NNRTIs耐药突变的病例最多。与NNRTI相关的耐药突变包括V179D/E、K103N、G190A、Y181C、K101E/P、V106M、Y188L及K238T，突变位点V179D/E在未治疗患者中出现频率最高，其次分别为K103N、G190A、Y181C和K101E/P。V179D是一种具有辅助作用的多态性突变，能降低患者对每一种NNRTIs药物的敏感性。当V179D和K103R联合可协同降低对NVP和EFV的敏感性[14]。V179D在Tibotec公司对依曲韦林(ETR)基因易感性评分中所占权重较低。V179E对NNRTIs药物的作用上与V179D相似。V179D/E不会降低对含有EFV一线治疗方案的病毒学反应[15-16]。K103N可引起全部NNRTIs高度耐药，主要引起EFV的相关耐药，G190A可导致NVP的高度耐药，Y181C单独突变即可引起对NVP的高度耐药，不需要其他耐药位点的积累[17-18]。K101E/P可引起NNRTIs的潜在耐药。研究中针对NRTIs的耐药突变位点包括M184V、K65R、A62V、D67N、T69D，检出频率最高的是M184V突变，其次为K65R。M184V引起患者对3TC和FTC耐药，使用3TC作为单一药物进行治疗时，M184V突变可以在几周内取代野生毒株，并且当3TC作为HARRT中的一种药物时，M184V突变总是首先出现。国内外的研究也发现M184V是最常见的NRTIs耐药突变位点[19-20]。K65R突变降低病毒对NRTIS的敏感性，引起除AZT以外的所有NRTIs药物的交叉耐药[21]。1例患者出现胸苷类似物耐药突变(thymidine analog mutation, TAM)：D67N，这类突变可以影响大多数NRTIs的敏感性，同时具有高度的交叉耐药性[22]。TAM的积累会导致对几乎所有NRTIs的耐药。PIs药物在重庆市使用时间较少，时间也较晚，本研究所统计出的突变位点是次要位点，包括A71V、A71I、L10I、Q58E、L10V等，尚未检出主要突变，因此未经治疗的新确证HIV感染者对PIs药物敏感。
综上所述，我们在进行扩大治疗的同时需要做好相应的耐药监测，防止耐药病毒株在人群中的传播。对新确证HIV感染者进行耐药性检测是必要的，以便准确了解患者在用药前的耐药情况，指导临床合理选择药物，防止交叉感染和多重耐药病毒株的产生。同时，我们建议重庆市应定期开展新确证未治疗患者的HIV耐药性监测，保证重庆市HAART的有效进行。
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