肿瘤微环境主要由肿瘤细胞、上皮细胞、间质细胞、免疫细胞、成纤维细胞、微血管、细胞因子及细胞外基质等共同组成，近年来的研究显示肿瘤微环境对肿瘤的发生、发展、转移具有重要的调控作用[1]。癌相关成纤维细胞（carcinoma-associate fibroblasts，CAFs）是肿瘤微环境中主要的基质细胞，它在表型和功能上都明显区别于正常的成纤维细胞，对肿瘤发生发展、血管形成、浸润转移、免疫抑制等有重要作用[2]。新近研究表明，CAFs的糖代谢方式亦发生了改变：肿瘤细胞的快速增殖是以大量的物质和能量代谢为基础，为了适应肿瘤细胞不受调控的快速生长及侵袭转移，CAFs细胞不再进行传统单纯的三羧酸循环，以维护自身的生长需求，而是以糖酵解的方式产生大量的乳酸（lactic acid，LD），供给肿瘤细胞进行代谢，肿瘤细胞相当于“寄生虫”[3]。
目前，针对CAFs糖代谢主要集中于乳腺癌、前列腺癌，其他肿瘤则研究相对较少，对口腔鳞癌CAFs糖代谢的相关研究就更少。本研究通过比较CAFs和NFs细胞线粒体的形态、膜电位、ATP浓度、葡萄糖（glucose，GLU）摄取、LD分泌情况，初步探讨口腔鳞癌相关成纤维细胞的糖代谢方式，为进一步研究口腔鳞癌-CAFs细胞代谢网络奠定基础, 为肿瘤治疗提供一个新思路。
1 材料与方法 1.1 主要材料与仪器H-DMEM培养基、胎牛血清、双抗(青链霉素)(HyClone公司，美国)；鼠抗人细胞角蛋白（cytokeratin，CK）单抗、兔抗人波形蛋白（vimentin，VIM）单抗、鼠抗人α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）单抗(北京中杉金桥生物技术有限公司)、0.2%詹纳斯绿B染色液（北京雷根生物技术有限公司）、四氯四乙基苯并咪唑基羰花青碘化物（JC-1）试剂盒（南京建成生物技术有限公司）、BCA蛋白定量试剂盒（北京百泰克公司）、ATP测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司）、葡萄糖测试盒（南京建成生物技术有限公司）、乳酸测定试剂盒（南京建成生物技术有限公司）、倒置荧光显微镜（Olympus，日本）、酶标仪（Tecan sunrise，奥地利）。
1.2 实验方法 1.2.1 CAFs和NFs的分离培养与鉴定无菌条件下收集川北医学院附属医院口腔颌面外科的口腔鳞癌患者手术切下的癌组织，包括癌邻近结缔组织和癌旁正常结缔组织，用于CAFs和NFs的分离培养，其分离及免疫组化鉴定参照前期研究[4]。采用第3代细胞进行研究。
1.2.2 线粒体活性染色CAFs和NFs消化后以3×104/孔的细胞数接种于24孔板，待细胞生长融合60%后，去掉培养基，PBS冲洗2遍，滴加0.2%詹纳斯绿B染色液1 mL，染色10 min，显微镜下观察细胞的染色情况并拍照记录。
1.2.3 线粒体JC-1荧光染色取无菌盖玻片放入6孔板内，CAFs和NFs消化后以3×104/mL均匀接种于盖玻片上，待细胞生长融合60%后终止培养，PBS洗涤细胞2次，滴加100 μL JC-1工作液（按照JC-1试剂盒说明进行JC-1工作液的制备），置于37 ℃、5%CO2、饱和湿度的培养箱中孵育20 min，1×Incubation Buffer洗涤2遍，于荧光显微镜下观察并拍照。
1.2.4 细胞ATP浓度测定CAFs和NFs消化后以3×104/孔的细胞数接种于24孔板，分别培养1、2、3、4 d后终止，用BCA蛋白定量法测定待测样本的蛋白浓度。测定ATP浓度的具体步骤：用0.25%胰酶消化细胞，600×g离心5 min，去上清，收集好的细胞沉淀加入300 μL热超纯水，置于100 ℃热水浴匀浆破碎，将细胞悬液于沸水浴中加热10 min，混匀。取样本30 μL，先后加入底物液Ⅰ100 μL、底物液Ⅱ 200 μL、促进剂30 μL，混匀，37 ℃水浴30 min，再加入沉淀剂50 μL，混匀后4 000 r/min离心5 min，取上清液300 μL，加入显色液500 μL，混匀，室温静置2 min，最后加入终止剂500 μL，混匀，室温静置5 min，在636 nm波长处测定各孔的光密度值。每组设3个复孔，另设空白管、标准管和对照管。
ATP浓度（μmol/g）=[D(636)测定-D(636)对照]/[D(636)标准-D(636)空白]×标准品浓度（1×103 μmol/L）×样本测定前稀释倍数/待测样本蛋白浓度（g/L）
1.2.5 葡萄糖氧化酶-过氧化物酶法检测细胞葡萄糖浓度CAFs和NFs消化后以3×104/孔的细胞数接种于24孔板，等量加入H-DMEM 1 mL培养。检测时吸取培养液，2 500 r/min，离心10 min，取上清0.01 mL，加入工作液1 mL，混匀，37 ℃ 5 min，在505 nm波长处测定各孔的光密度值。连续检测4 d，每组设3个复孔，另设空白管和标准管。
葡萄糖浓度（mmol/L）=[D(505)样本-D(505)空白]/[D(505)校准-D(505)空白]×校准品浓度（5.55 mmol/L）
1.2.6 乳酸酶法检测细胞乳酸浓度CAFs和NFs消化后以3×104/孔的细胞数接种于24孔板，等量加入H-DMEM 1 mL培养。检测时吸取培养液，2 500 r/min，离心10 min，取0.02 mL上清，加入1 mL酶工作液, 显色剂0.2 mL，混匀，37 ℃水浴10 min，加入终止液2 mL，混匀，在530 nm波长处测定各孔的光密度值。连续检测4 d，每组设3个复孔，另设空白管和标准管。
乳酸浓度（mmol/L）=[D(530)测定-D(530)空白/[D(530)标准-D(530)空白]×标准品浓度（3 mmol/L）×样本测试前稀释倍数
1.3 统计学方法采用SPSS 17.0统计软件进行分析，数据以x±s表示，两组间比较采用独立样本t检验。
2 结果 2.1 线粒体活性染色詹纳斯绿B是线粒体的专一染色剂，可特异性地使具有活性的线粒体呈现蓝绿色。蓝绿色强度减弱或呈现无色，表明线粒体细胞色素氧化酶系统功能不全或功能丧失。从图 1可以看出，CAFs细胞中蓝绿色较NFs细胞中明显减少，提示CAFs细胞的线粒体功能出现下降。
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| 图 1 两组细胞线粒体形态学观察结果 |
2.2 线粒体JC-1荧光染色
JC-1是一种检测线粒体膜电位的特异性荧光探针。当细胞中线粒体膜电位较高时，JC-1被摄入线粒体内并形成聚合物，发出红色荧光；当膜电位较低时，JC-1从线粒体内释放，在线粒体基质中浓度降低则不能形成聚合物，以单体形式存在而发出绿色荧光。由图 1可见，NFs细胞红色荧光较强，表明线粒体膜电位正常，CAFs细胞红色荧光明显减弱，说明线粒体的膜电位下降，其功能减弱。詹纳斯绿B染色的结果在JC-1荧光染色观察中得到了进一步证实。
2.3 细胞ATP浓度随着细胞的增殖生长，ATP浓度在第2天和第3天上升，到第4天时，由于细胞开始衰老，细胞分泌ATP减少。与NFs组比，CAFs组在培养的第2、3、4天产生的ATP浓度低，即产能减少，差异有统计学意义（P < 0.05, 图 2A）。
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| a :P < 0.05，与NFs组相比 图 2 两组不同培养时间细胞内ATP（A）、葡萄糖（B）、乳酸（C）浓度的变化 |
2.4 细胞摄取葡萄糖功能的改变
随着细胞的生长，消耗的葡萄糖增加，导致培养液中葡萄糖浓度降低。与NFs组比较，CAFs组在培养的第2、3、4天细胞培养液中葡萄糖的浓度明显降低，差异有统计学意义（P < 0.05, 图 2B），表明CAFs摄取葡萄糖较NFs多。
2.5 细胞代谢产乳酸作用的变化培养1、2、3、4 d后，CAFs和NFs细胞分泌乳酸均增加。与NFs组比，CAFs组在培养的第2、3、4天细胞乳酸分泌增加，差异有统计学意义（P < 0.05, 图 2C）。
3 讨论著名的生物化学家Otto Warburg在20世纪30年代提出了经典的瓦伯格效应(Warburg effect)：癌细胞即使在氧充足的情况下仍偏好于糖酵解的方式进行葡萄糖代谢，生成乳酸，而不是利用线粒体氧化磷酸化[5]。该假说还认为，肿瘤从某种意义上而言，是线粒体缺陷进而引起细胞代谢异常导致的。然而越来越多的证据显示，肿瘤细胞中的线粒体并没有完全丧失功能。MARIN-VALENCIA等[6]采用原发性胶质瘤原位小鼠模型研究了肿瘤细胞体内的代谢特征，发现同时存在糖酵解和线粒体呼吸增强。此外，临床上将糖酵解抑制剂用于肿瘤化疗，希望切断肿瘤细胞的能量来源，但未取得很好的效果[3, 7]。
近来越来越多的研究发现, 肿瘤生长与肿瘤细胞所处的微环境关系密切，肿瘤细胞快速增殖需要大量的合成物质，整个代谢网络在癌基因、抑癌基因主导下发生重编程，能量、营养物质在肿瘤-间质中被合理有效的重新分配，以利于肿瘤细胞的增殖[8]。有研究[9-11]发现，CAFs具有与NFs不同的糖代谢方式，通过糖酵解进行能量代谢，将摄取的葡萄糖转化为乳酸，供给肿瘤细胞进行物质合成，而肿瘤细胞直接用乳酸进行三羧酸循环（tricarboxylic acid cycle，TCA），即癌细胞的营养物质及能量来源主要依赖于CAFs，称之为反瓦伯格效应。
细胞的能量主要来自于糖代谢。葡萄糖在体内氧化分解的途径主要有两种，糖酵解和氧化磷酸化。糖酵解是指葡萄糖在细胞质中被分解为丙酮酸的过程，在缺氧的情况下，丙酮酸转化为乳酸，此过程仅产生2个ATP。在有氧条件下，丙酮酸转运入线粒体进一步氧化生成乙酰辅酶A，后者进入三羧酸循环彻底氧化成水、二氧化碳，此过程为氧化磷酸化，是糖代谢的主要方式。通常情况下，正常细胞通过氧化磷酸化消耗1摩尔的葡萄糖产生38摩尔的ATP来维持细胞正常的生命需要。
线粒体是细胞进行有氧呼吸的主要场所，是细胞生成ATP的“能量工厂”。本实验采用詹纳斯绿B染色和JC-1荧光染色，对CAFs线粒体功能的完整性进行判断，从结果看出，CAFs细胞的线粒体活性较NFs有所下降，表明CAFs细胞的线粒体功能存在缺陷，细胞的氧化磷酸化途径可能存在异常。进一步检测对比CAFs和NFs的葡萄糖浓度、代谢产生的ATP浓度，在相同的培养条件下，发现CAFs较NFs细胞摄取更多的葡萄糖，但是产生的ATP更少。同时测定了培养基中的乳酸浓度，证实CAFs细胞较NFs产生更多的乳酸，而乳酸正是糖酵解的终产物。综合本实验的结果得出，来源于口腔鳞癌的CAFs细胞出现了线粒体功能减弱、葡萄糖摄取量增高、ATP产能减少和乳酸产生增加的现象，说明CAFs发生了有氧糖酵解。
通过糖酵解代谢葡萄糖产生ATP是一种低效的产能方式，为什么CAFs细胞会选择这种糖代谢方式？一个显而易见的问题是，CAFs细胞糖代谢的意义有着比提供能量更为重要的作用。肿瘤细胞的快速增殖需要的绝不仅仅是ATP，还需要构成细胞结构的生物大分子材料。而CAFs分泌的大量乳酸，可以被肿瘤细胞直接摄取作为肿瘤细胞快速生长增殖的物质来源。目前人们对这一代谢改变的分子机制还知之甚少[3, 12]。本课题组将进一步探究口腔CAFs糖酵解的分子机制及信号通路，确定CAFs与口腔鳞癌能量代谢的关系，以期对肿瘤-间质代谢网络有更深入和清晰的认识，为肿瘤的治疗找到新的靶点。
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