结肠癌是较为常见的消化系统恶性肿瘤。结肠癌的治疗以外科手术为主,外科手术中以根治术应用最久,且疗效确切[1]。术后肠道菌群失调是结肠癌术后最常见的并发症。另外,肠道菌群失调介导的慢性和低炎症状与肿瘤发生密切相关,低炎性微环境下的免疫细胞及免疫细胞产生的生长因子,前者如白介素类,后者如血管内皮生长因子,可激活某些信号通路,抑制肿瘤免疫反应,抑制肿瘤细胞凋亡,促进肿瘤细胞增殖、新生及侵袭转移,为消化系统肿瘤发生和恶化提供物质基础;当除去感染致病菌,可预防炎症所引起的癌变[2-3]。因此,有研究显示结肠癌的预后与肠道菌群失调相关,其中益生菌数量显著降低,改变了肠道和机体的免疫功能。那么,肠道菌群失调程度是否也提示预后不同?给予益生菌干预是否有助于改善患者预后?上述问题少有研究报道。本研究以2010年4月至2013年4月在我院收治并确诊的Ⅱ期结肠癌患者为研究对象,分析术后菌群双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属表达与预后的关联,给予益生菌干预对结肠癌预后的影响,并探讨可能机制。
1 对象与方法 1.1 研究对象收集2010年4月至2013年4月在我院收治并确诊的Ⅱ期结肠癌患者185例,肿瘤部位均在升结肠,分化程度均为高分化,肿瘤直径为5~8 cm,均接受根治术。将术后患者根据实际接受的治疗方案分为2组:益生菌干预组(80例)和益生菌未干预组(105例),其中益生菌干预组给予口服双歧三联活菌胶囊(规格:210 mg/粒,国药准字:S10950032,上海信谊药厂有限公司)840 mg/次,2次/d。选择同期健康体检者20例为对照组。所有受试者均签署知情同意书并经院伦理委员会批准(泉一伦〔2010〕12号)。
1.2 纳入标准受试者均在本地工作或生活≥5年;预计术后生存时间≥5个月;术前和术后1个月内均未使用过抗生素和或肠道微生态制剂;未合并严重心脑血管疾病及其他危及生命的疾病史者;无克罗恩病癌变、家族性肠息肉性癌变、溃疡性结肠炎癌变和色素沉着息肉综合征癌变者;无根治术禁忌证者及哺乳或妊娠期女性。
1.3 样本收集术前和术后1个月收集清晨粪便,对照组留取清晨粪便1次。每次留取粪便标本0.5 g,采取无菌玻璃瓶留存并置于-80 ℃低温冰箱,备用。
1.4 主要仪器核酸电泳仪、DGGE电泳系统(美国Bio-Rad公司),PCR仪(英国Hybrid公司),UVI凝胶成像系统(英国UVItec公司),DyNA Quant 200浓度测定仪(美国Pharmacia Biotech公司)。
1.5 双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属定量检测[4-6] 1.5.1 标准菌株及粪便标本DNA提取分别称取嗜酸乳杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌标准菌的冻干粉0.1 g,用TIANamp Bacteria DNA试剂盒提取上述菌株的DNA。取0.5 g待测粪便,采用DNA缓冲液稀释,离心,取上清液500 μL,采用TIANamp Bacteria DNA试剂盒提取粪便的细菌基因组DNA,备用。
1.5.2 PCR引物设计参照文献[7]方法,根据乳酸杆菌、双歧杆菌、大肠杆菌和粪肠球菌基因序列设计双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属的特异PCR引物(表 1)。
细菌 | 引物序列(5′→3′) | 产物长度(bp) |
双歧杆菌属 | 上游:AGCAGTAGGGAATCTTCCA 下游:CACCGCTACACATGGAG |
245 |
乳酸杆菌属 | 上游:TCGCGTCCGGTGTGAAAG 下游:CCACATCCAGCATCCAC |
614 |
大肠杆菌 | 上游:CCCTTATTGTTAGTTGGCCATCATT 下游:ACTCGTTGTACTTCCCATTGT |
497 |
肠球菌属 | 上游:GTTATACCTTTGGCTCATTGA 下游:ACCAGGGTATCTTAATCCTGTT |
186 |
1.5.3 标准品的制备、浓度测定及拷贝数计算
将乳酸杆菌属、双歧杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属的标准菌株PCR产物DNA片段为荧光定量PCR标准品,以紫外分光光度计测定光密度值,记录相应的DNA浓度,计算标准品PCR片段的拷贝数。
1.5.4 标准曲线制作将各标准品稀释成为1×107~1×102拷贝/μL,行SYBR Green为荧光染料的RT-PCR反应并进行溶解曲线分析,自60 ℃升温到95 ℃, 以0.5 ℃逐渐加热,每次递增温度保持10 s,记录溶解曲线荧光数据。根据荧光数据,由软件iCycler Optical System Interface Software分析Ct值,制备标准曲线。
1.5.5 待测粪便样品乳酸杆菌属、双歧杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属DNA分析将待测粪便样品中提取的DNA行荧光定量PCR反应,反应体系和反应条件与1.5.4项相同。实验同时设标准品校正和ddH2O作为DNA阴性对照,每个样本做3个平行复孔。根据待测样本的荧光数据,以溶解曲线计算双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属的数量。
1.6 生存时间随访采用复检、电话、微信和邮件等方式随访105例结肠癌患者术后的生存情况,包括意外死亡。将双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属的数量取中位数以上为高含量,中位数以下(含中位数)为低含量,考察双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属数量与生存情况的关系。
1.7 统计学分析采用SPSS 21.0统计软件。先以K-S检验计量资料考察是否符合正态分布,当符合正态分布时,采用x±s表示,行单因素方差分析,计数资料采用χ2检验。采用Kaplan-Meier法进行生存期分析,采用Log-rank法进行生存比较。检验水准:α=0.05。
2 结果 2.1 两组一般情况比较两组性别、年龄和体质量指数等一般情况比较差异均无统计学意义(P>0.05,表 2),具有可比性。
组别 | n | 性别(男/女) | 年龄(岁) | 体质量指数 |
健康对照组 | 20 | 15/5 | 42.6±8.9 | 22.6±1.6 |
结肠癌组 | 185 | 120/65a | 45.7±10.5b | 22.9±1.8c |
a:χ2=0.825,P=0.364,b:t=1.271,P=0.205,c:t=0.715,P=0.475,与健康对照组比较 |
2.2 结肠癌根治术后肠道菌群的数量
采用定量PCR检测粪便样品的菌属DNA,并与标准品进行对比,计算菌群数量(图 1)。与健康对照组比较,结肠癌组术前双歧杆菌属、乳酸杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属差异无统计学意义(P>0.05),根治术后,双歧杆菌属、乳酸杆菌属、双歧杆菌属、大肠杆菌和肠球菌属均明显降低(P < 0.05,表 3)。益生菌干预组和益生菌未干预组术前、术后的肠道菌群差异均无统计学意义(P>0.05,表 4)。
组别 | n | 双歧杆菌属 | 乳酸杆菌属 | 大肠杆菌 | 肠球菌属 |
健康对照组 | 20 | 9.2±1.3 | 8.6±1.5 | 7.5±1.9 | 9.5±2.1 |
结肠癌组 | 185 | ||||
术前 | 9.3±1.6 | 8.2±1.8 | 7.9±2.0 | 9.8±2.6 | |
术后 | 8.1±1.0a | 7.1±1.2b | 5.8±1.6c | 7.6±1.9d | |
a:t=4.529, P < 0.01,b:t=5.176, P < 0.01,c:t=4.430, P < 0.01,d:t=4.205, P < 0.01, 与术前比较 |
组别 | n | 双歧杆菌属 | 乳酸杆菌属 | 大肠杆菌 | 肠球菌属 |
益生菌干预组 | 80 | ||||
术前 | 9.4±1.7 | 8.1±1.9 | 7.8 ±2.1 | 9.9±2.7 | |
术后 | 8.2±0.9 | 7.0±1.1 | 5.7±1.5 | 7.7±2.0 | |
益生菌未干预组 | 105 | ||||
术前 | 9.2±1.5 | 8.3±1.6 | 8.0±1.9 | 9.7±2.5 | |
术后 | 8.0±1.2 | 7.2±1.3 | 5.9±1.7 | 7.5±1.8 |
2.3 患者4年生存情况及与肠道菌群数量的关系
4年随访,无1例失访。105例益生菌未干预组中存活90例,15例患者死亡,存活率和死亡率分别为85.71%(90/105)和14.29%(15/105),其中14例为结肠癌转移死亡,1例为心血管病死亡。乳酸杆菌属(χ2=6.700, P=0.035)和双歧杆菌属(χ2=5.777, P=0.016)数量越高,大肠杆菌(χ2=3.301, P=0.069)和肠球菌属(χ2=4.780, P=0.029)数量越低,结肠癌患者4年生存时间越高(图 2)。80例益生菌干预组中存活76例,4例患者死亡,存活率和死亡率分别为95.00%(76/80)和5.00%(4/80),其中3例为结肠癌转移死亡,1例交通意外死亡。与益生菌未干预组比,益生菌干预组的存活例数较多(χ2=4.248, P=0.039),因结肠癌转移死亡例数较少(χ2=4.997, P=0.025)。
3 讨论
肠道的定植菌可与肠黏膜上皮表面特异性受体结合,形成菌膜结构,成为抵御过路菌对机体侵袭的生物屏障中不可缺少的一部分。手术干预和围术期应用多种抗生素均可抑制肠道正常菌群,致使耐药菌及其他有害菌株大量繁殖,打破菌群平衡,造成菌群失调;菌群失调是文献中提及最多的导致术后预后不良的原因[8]。正如本研究结果所示:与健康对照组比较,结肠癌组术前的乳酸杆菌属、双歧杆菌属、大肠杆菌和肠球菌差异无统计学意义,提示结肠癌组术前的菌群处于动态平衡,而术后上述细菌的数量明显降低,菌群数量及平衡均被破坏。
结肠癌的病因和发病机制虽然不明确,但大量研究显示肠道微环境在消化道恶性肿瘤的发生、发展和转移中发挥重要作用,超过1/5的恶性肿瘤与细菌感染相关,肠道细菌直接或间接参与宿主食物代谢,同时产生致癌性代谢产物而使得恶性肿瘤发生、发展。
对于结肠癌,肠道微生物种群丰度变化不仅可引起肠道内正常存在的致病性共生菌群占优势,而且还会引起菌群代谢改变,有毒的肠道代谢产物增多,诱发肠道上皮细胞癌变。对于如大肠杆菌和肠球菌等有害菌,肠腔致病菌或细菌产物与髓样细胞Toll样受体结合,促进IL-1、IL-6和IL-23等致炎因子释放,激活下游Th17细胞,进而活化STAT3,被激活的STAT3可调节血管内皮生长因子(VEGF)表达进而促进上皮细胞的增殖、侵袭[9]。动物实验结果也表明:诱癌剂二甲基肼(dimethlhydrazine, DMH)干预大肠癌大鼠,肠道菌群检测证实Ruminococcus和Allobaculum菌属在DMH干预的大鼠粪便的丰度显著增加[10]。肠道炎症IL-10-/-小鼠分别接种含有浆酮合酶(pdyketone synthase,PKS)的大肠杆菌突变株NC101和肠道粪肠球菌,小鼠均发生严重的结肠炎,其中80%接种大肠杆菌的小鼠患结肠肿瘤[11]。大肠杆菌优先定植在肠道损伤处,大肠杆菌携带编码细胞毒性坏死因子-1(CNF1)基因,激活Rho GTP酶,活化Rho下游的信号元件,抑制细胞凋亡,促进细胞运动和侵袭[12-14]。正如本研究结果显示:大肠杆菌(χ2=3.301, P=0.069)和肠球菌属(χ2=4.780, P=0.029)数量越低,结肠癌患者4年生存时间越高,提示粪便大肠杆菌和肠球菌属有助于评估结肠癌的预后。
对于如双歧杆菌和乳酸杆等有益菌,体内研究显示有益菌具有明确的抗肿瘤作用,给予大鼠双歧杆菌和乳酸杆菌,结肠的隐窝异常病灶等癌前病变可降低约50%。体外研究也显示有益菌能够抑制结肠癌细胞增殖黏附,促进其凋亡,如乳酸菌衍生的聚磷酸酯可剂量依赖性地诱导结肠癌细胞凋亡,双歧杆菌可抑制结肠癌细胞如Caco2、HT-29和SW480等增殖[15-18]。本研究结果显示:乳酸杆菌属(χ2=6.700, P=0.035)和双歧杆菌属(χ2=5.777, P=0.016)数量越高,结肠癌患者4年生存时间越高,可见粪便乳酸杆菌属和双歧杆菌属数量越高,结肠癌预后越好。另外,即使结肠癌术后肠道菌群存在失调状况,给予双歧杆菌三联活菌胶囊的益生菌干预,显著提高存活率并降低结肠癌的转移发生情况,与益生菌未干预组差异有统计学意义,且患者对益生菌的耐受性较好,无明显的不良反应,该结果与文献[19-20]报道类似。可能的机制有以下几点[19-21]:改变肠道微生物的代谢活动,改变肠道菌群,改变肠道的物理化学环境,黏附和降解潜在的致癌物质,产生抗癌-抗诱变的物质,提高宿主的免疫应答,发酵难以被消化的食物,影响宿主的生理活动。由此可见益生菌干预可安全和显著地改善结肠癌根治术后患者的生存情况,值得临床推广。
本课题存在的局限性:①虽然数据显示肠道内菌群结构受年龄、地域、社会及文化等多种因素影响,不同人在不同时期,其肠道内菌群也存在差异。但相关研究也显示不同儿童肠道菌落的种系构成与成人相比存在差异,但3岁后的菌落种系构成接近成人[22];健康成人结肠的升结肠、横结肠、降结肠和乙状结肠的菌群分布差异研究后发现,同一个体内不同结肠部位的黏膜菌群分布相当[23],因此,检测结肠癌术后粪便菌群仍有重要的临床价值。②结肠的不同解剖部位存在不同菌群,沿结肠纵轴方向存在有序的梯度分布,检测粪便菌群是否能够直接用以评估预后,尚需进一步研究确认。③粪便细菌种类超过300种,本课题研究的菌属非常局限,有限的数据可能产生评估误差。④本研究纳入的病例数较少,尤其给予双歧杆菌三联活菌胶囊干预的结肠癌患者例数也较少,结果可能因此而存在偏差,因此,有必要在进一步的研究中扩大服用双歧杆菌三联活菌胶囊的例数,探讨和确定益生菌在改善患者生存情况中的作用。
综上所述,结肠癌根治术后肠道菌群结构变化与结肠癌的预后密切相关,根治术后,双歧杆菌属和乳酸杆菌属数量越高,大肠杆菌和肠球菌属数量越低,结肠癌的预后越好。给予双歧杆菌三联活菌胶囊可明显改善结肠癌根治术后患者的生存情况。
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