2. 550004 贵州，贵州医科大学附属医院呼吸科
2. Department of Respiratory Diseases, Affiliated Hospital of Guizhou Medical University, Guiyang, Guizhou Province, 550004, China
细菌耐药性问题已成为全球公共医疗卫生的难题，细菌产β内酰胺酶主要有AmpC酶、超广谱β内酰胺酶、耐酶抑制剂的β内酰胺酶和碳青霉烯酶等，其中超广谱β-内酰胺酶(extended spectrum β-lactamase，ESBLs)是细菌产生耐药的重要机制和环节，ESBLs基因可通过质粒、转座子、插入序列等在菌株间水平传播。目前亚洲地区及中国流行的产ESBLs大肠埃希菌菌株仍以携带CTX-M型、TEM型、SHV型耐药基因为主。这3型中以CTX-M型占主导，并且有多个亚型发现，本研究针对CTX-M-9变异亚型进行基因序列分析，了解本市该基因型的特点。
1 资料与方法 1.1 菌株来源74株大肠埃希菌分离自贵阳市多家医院2015年6月1日至2015年12月31日住院患者痰标本，培养按《全国临床检验操作规程》第4版要求进行[1]，分离得到菌株接种于NC50复合板中拟行ESBLs表型筛选。质控菌株：大肠埃希菌ATCC25922、大肠埃希菌ATCC35218。
1.2 菌株鉴定及药敏试验MicroScan-WalkAway-96-Plus微生物鉴定仪进行细菌鉴定及药敏分析，根据2014年版CLSI[2]推荐的标准微量肉汤稀释法测定产ESBLs大肠埃希菌对常用抗菌药物的最小抑菌浓度值。
1.3 PCR反应条件基因型CTX-M-9，引物序列：上游：5′-TATTGGGAGT-TTGAGATGG-3′，下游：5′-TCCTTCAACTCAGCAAAAGT-3′，产物大小933 bp。PCR扩增的循环参数为94 ℃预变性5 min，94 ℃ 50 s，55 ℃ 45 s，72 ℃ 50 s，循环35次，最后72 ℃延伸6 min。
1.4 质量控制琼脂糖凝胶电泳鉴定PCR产物时设CTX-M-9标准产酶株为阳性对照，大肠埃希菌ATCC25922为阴性对照。
1.5 测序随机选取部分PCR产物送大连宝生物有限公司纯化后进行DNA双向测序，测序结果用NCBI上的BLAST进行比对分析。
2 结果 2.1 产ESBLs大肠埃希菌耐药基因PCR检测分型结果47株ESBLs基因阳性菌株中33株携带CTX-M-9组基因，产ESBLs大肠埃希菌耐药基因PCR电泳图谱见图 1。
|
| M：标准；1~13：临床标本；N：阴性对照；P：阳性对照 图 1 CTX-M-9型基因PCR扩增产物 |
2.2 PCR扩增产物测序结果
从痰液标本中随机选取CTX-M-9型耐药菌株10株；送大连宝生物有限公司纯化后进行DNA测序，并将测序结果与BLASTN比对，结果显示：CTX-M-9型耐药基因，基因亚型为CTX-M-14型(图 2)。
|
| 图 2 痰液标本CTX-M-9型基因PCR产物测序峰图 |
3 讨论
ESBLs存在于细菌中，由细菌丝氨酸蛋白酶衍生而来，可以水解抗菌药物(如广谱头孢菌素、大部分青霉素及单环类抗生素β内酰胺环)，使抗菌药物失效，也可以通过质粒、转座子、插入序列等在菌株间水平传播，造成耐药菌株不断增长，从而导致ESBLs在医院的广泛流行。各个国家、地区、医院的环境因素及临床抗生素的使用剂量及频度不同致使ESBLs检出率、耐药性及基因型存在地区差异[3]，本市产ESBLs大肠埃希菌以CTX-M为主，与我国其他地区报道一样[4-6]，宁夏、天津、内蒙古等地区报道的CTX-M型基因所占比率分别为35.5%、67.9%、100%，本研究中47株产ESBLs大肠埃希菌中CTX-M型占93.62%，低于浙江温州地区报道数据(95.0%)及王喜仁等[7]研究数据(100%)，反映不同地区、不同医院基因流行特点不同；47株基因阳性ESBLs大肠埃希菌中CTX-M-9型占70.2%，反映本市产ESBLs大肠埃希菌耐药基因流行特点，也说明CTX-M-9为本市产ESBLs大肠埃希菌的主要耐药基因。文献报道，CTX-M型基因在中国大陆地区所占比率为35.5%~93.6%，CTX-M型ESBLs检出率高于SHV和TEM[8-10]。近年来国内相关文献报道CTX-M-14、3、15占主导地位，也有其他基因型如CTX-M-13、12、24、1、22等散发报道[11-12]。本研究结果显示产ESBLs大肠埃希菌主要的耐药基因为CTX-M-9型(70.2%)，而CTX-M-9型测序结果显示基因亚型为CTX-M-14，说明CTX-M-14型为本市产ESBLS大肠埃希菌流行基因，与国内相关文献报道相符。
| [1] |
叶应妩, 王毓三. 全国临床检验操作规程[M]. 南京: 东南大学出版社, 1997: 1-621.
YE Y W, WANG Y S. National guide to clinical laboratory procedures[M]. Nanjing: Southeast University Press, 1997: 1-621. |
| [2] | Clinical and Laboratory Standards Institute (CLSI).Performance Standards for Antimicrobial Susceptibility Testing[S]. 2014, M100-S24, 102-103. |
| [3] | JEAN S S, HSUEH P R. High burden of antimicrobial resistance in Asia[J]. Int J Antimicrob Agents, 2011, 37(4): 291–295. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2011.01.009 |
| [4] |
潘玫, 李稳, 王靖男, 等. 产CTX型超广谱β-内酰胺酶的大肠埃希菌基因分析及耐药特征[J].
山东大学学报(医学版), 2013, 51(11): 61–65.
PAN M, LI W, WANG J N, et al. Resistance and genotyping of producing CTX-type extended-spectrum β-Lactamase Escherichia coli isolates[J]. J Shandong Univ (Health Sci), 2013, 51(11): 61–65. |
| [5] |
陈栎江, 吴庆, 徐春泉, 等. 大肠埃希菌超广谱β-内酰胺酶的基因分布和流行特性[J].
中华传染病杂志, 2015, 33(2): 106–110.
CHEN L J, WU Q, XU C Q, et al. Investigation of distribution of drug resistant-related genes in Super-Broad-Spectrum β-Lactamases Producing Bacteria and its epidemiology[J]. Chin J Infect, 2015, 33(2): 106–110. DOI:10.3760/cma.j.issn.1000-6680.2015.02.013 |
| [6] |
张晓丽, 张吉生, 斗章, 等. 产超广谱β-内酰胺酶细菌耐药性基因型分析[J].
微生物学杂志, 2010, 30(1): 51–55.
ZHANG X L, ZHANG J S, DOU Z, et al. Genotype Analysis of Drug Resistance of Super-Broad-Spectrum β-Lactamases Producing Bacteria[J]. J Microbiol, 2010, 30(1): 51–55. DOI:10.3969/j.issn.1005-7021.2010.01.011 |
| [7] |
王喜仁, 王笑峰, 赵淑堂. 某院分离的大肠埃希菌和肺炎克雷伯菌ESBLs基因检测及分型[J].
中国感染控制杂志, 2013, 12(5): 339–343.
WANG X R, WANG X F, ZHAO S T. Detection and genotyping of extended-spectrum β-lactamases in Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae isolated from a hospital[J]. Chin J Infec Contl, 2013, 12(5): 339–343. DOI:10.3969/j.issn.1671-9638.2013.05.005 |
| [8] | BEDENIC B, GOIC-BARISIC I, BUDIMIR A, et al. Antimicrobial susceptibility and beta-lactamase production of selected gram-negative bacilli from two Croatian hospitals: MYSTIC study results[J]. J Chemother, 2010, 22(3): 147–152. DOI:10.1179/joc.2010.22.3.147 |
| [9] | PEIRANO G, COSTELLO M, PITOUT J D. Molecular characteristics of extended-spectrum beta-lactamase-producing Escherichia coli from the Chicago area: high prevalence of ST131 producing CTX-M-15 in community hospitals[J]. Int J Antimicrob Agents, 2010, 36(1): 19–23. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2010.02.016 |
| [10] | LUO Y, YANG J, ZHANG Y, et al. Prevalence of β-lactamases and 16S rRNA methylase genes amongst clinical Klebsiella pneumoniae isolates carrying plasmid-mediated quinolone resistance determinants[J]. Int J Antimicrob Agents, 2011, 37(4): 352–355. DOI:10.1016/j.ijantimicag.2010.12.018 |
| [11] |
杨启文, 徐英春, 王辉, 等. CTX-M酶在北京协和医院临床分离大肠埃希菌中的流行[J].
中国感染与化疗杂志, 2006, 6(1): 1–6.
YANG Q W, XU Y C, WANG H, et al. Prevalence of clinically isolated Escherichia coli producing CTX-M-type β-lactamases in Peking Union Medical College Hospital[J]. Chin J Infec Chemother, 2006, 6(1): 1–6. DOI:10.3321/j.issn:1009-7708.2006.01.001 |
| [12] |
苏丹虹, 卢鉴财, 卓超, 等. 广州地区大肠埃希菌与肺炎克雷伯菌CTX-M型产超广谱β-内酰胺酶基因分型的研究[J].
中华医院感染学杂志, 2009, 19(22): 3004–3006.
SU D H, LU J C, ZHUO C, et al. Antibiotic Resistance of ESBLs-producing Escherichia coli and Klebsiella pneumoniae Isolates with CTX-M Genotypes in Guangzhou: Analysis of Their Genotyping[J]. Chin J Nosocomiol, 2009, 19(22): 3004–3006. DOI:10.3321/j.issn:1005-4529.2009.22.002 |