近年来，肿瘤组织新血管生成与肝癌发生、发展及转移的相关性成为研究热点，血管内皮生长因子(vascular endothelial growth factor, VEGF)、血小板-内皮细胞黏附分子(CD31)[1-2]。已有一部分临床研究对VEGF、CD31在乳腺癌、结直肠癌等恶性肿瘤疾病病理组织中的表达特征进行分析，并观察了化疗药物对两者表达水平的影响[3-4]。但关于VEGF、CD31在肝癌病理组织中表达特征的研究却鲜有报道。苦参素和顺铂均为现阶段我国临床上应用较为广泛的化疗药物。本研究对苦参素与顺铂合用对人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织VEGF、CD31表达的影响及临床意义进行探讨，现将研究内容进行以下报告。
1 资料与方法 1.1 一般资料细胞株：人肝癌细胞株HepG2，购自中科院上海细胞库。
实验动物：雄性SPF级雄性裸鼠40只，6周龄，体重18~22 g，由我院动物实验中心提供，饲养室温19~24 ℃，相对湿度30%~70%，每笼5只。
1.2 研究方法 1.2.1 人肝癌裸鼠模型建立将人肝癌细胞株HepG2培养至对数生长期后，加入25%胰酶消化后使用离心机进行离心，使用磷酸缓冲盐溶液制作成细胞悬液，细胞浓度为2.5×107 mL。对裸鼠右腋部进行消毒，使用带6号针头的注射器抽取0.2 mL细胞悬液给予裸鼠皮下注射，注射后定期观察肿瘤生长情况，当所有裸鼠肿瘤直径达到5 mm时，将40只裸鼠随机分为对照组、苦参素组、顺铂组、联合组，每组各10只。
1.2.2 给药方法苦参素组：给予该组裸鼠腹腔注射苦参素(批准文号：国药准字H20058750;生产单位：江西天施康中药股份有限公司; 药品特性：化学药品，2 mL :0.2 g)，剂量为100 mg/kg，每周连续给药5 d，用药2周。
顺铂组：给予该组裸鼠腹腔注射顺铂(批准文号：国药准字H20043889;生产单位：云南生物谷灯盏花药业有限公司; 药品特性：化学药品，2 mL :10 mg)剂量为2 mg/kg，每周连续给药5 d，用药2周。
联合组：给予该组裸鼠腹腔注射苦参素组(100 mg/kg)、顺铂(2 mg/kg)，每周连续给药5 d，用药2周。
对照组：给予该组裸鼠腹腔注射生理盐水，剂量为10 mg/kg，每周连续给药5 d，用药2周。
1.2.3 VEGF、CD31检测给药结束后第15天将4组裸鼠处死，分离皮下移植瘤组织，放置在液氮中，保存在-80 ℃的冰箱中。将肿瘤组织切成连续5 μm的切片，石蜡包埋，过夜后常规脱蜡，使用0.3%H2O2孵育30 min，将内源性过氧化物酶阻断，使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次5 min，将切片浸入pH值为6.0的柠檬酸盐抗原修复液中经微波加热至95 ℃，保温10 min，在室温中自然冷却，再次使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次5 min，滴加一抗(鼠抗人单克隆抗体)，放置在湿盒中，4 ℃孵育过夜。阴性对照，使用磷酸缓冲盐溶液代替一抗。过夜后使用磷酸缓冲盐溶液冲洗3次，每次5 min，滴加经生物素标记的二抗，室温中孵育30 min，再次冲洗。DAB显色，充分水洗，苏木液复染，充分水洗，酒精脱水，使用中性树脂封片，选择10个高倍镜视野进行计数，观察VEGF、CD31表达情况。
VEGF阳性判定标准：VEGF细胞质出现棕黄颗粒为阳性表达，阳性细胞所占比例≥10即判定为阳性表达。
CD31阳性判定标准：CD31细胞膜出现棕黄色为阳性表达，阳性细胞所占比例≥5即判定为阳性表达。
1.3 观察指标本研究对比4组裸鼠皮下移植瘤体积以及肿瘤组织中VEGF、CD31的表达情况。
皮下移植瘤体积计算公式为：V=1/2×a×b2，其中a、b分别为肿瘤长径和肿瘤短径。
1.4 统计学分析基于SPSS 22.0版本统计学软件建立数据统计分析模型，计数型资料采用例数和率(%)的形式描述，采用卡方(χ2)检验资料间差异，计量资料采用x±s的形式描述，采用配对t检验，P值小于0.05表示两者之间存在的差异具有统计学意义。
2 结果 2.1 4组裸鼠皮下移植瘤体积比较联合组裸鼠皮下移植瘤体积较其他3组裸鼠小(P < 0.05)，见图 1~3。
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| A：对照组，B：联合组 图 1 对照组与联合组裸鼠离体肿瘤体积比较 |
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| A：苦参素组(左)与联合组(右); B：联合组与(左)与顺铂组(右) 图 2 各组裸鼠给药后15 d在体肿瘤比较 |
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| a：t=11.926，P=0.000，与苦参素组比较; b：t=10.450，P=0.000，与顺铂组比较; c: t=17.583，P=0.000，与对照组比较 图 3 四组裸鼠皮下移植瘤体积比较 |
2.2 4组裸鼠皮下移植瘤组织中VEGF的表达情况
联合组裸鼠的VEGF阳性表达率明显低于其他3组裸鼠(P < 0.05)，具体数据见表 1所示，免疫组化分析结果见图 4所示。
| 组别 | 阳性 | 阴性 |
| 苦参素组 | 8(80.00) | 2(20.00) |
| 顺铂组 | 7(70.00) | 3(30.00) |
| 联合组 | 2(20.00)a | 8(80.00) |
| 对照组 | 10(100.00) | 0(0.00) |
| a：联合组VEGF阳性检出率与苦参素组比较χ2=7.200;P=0.007，与顺铂组比较χ2=5.051;P=0.025，与对照组比较比较χ2=13.333;P=0.000 | ||
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| A：苦参素组; B：顺铂组; C：联合组; D：对照组 图 4 各组裸鼠皮下移植瘤组织VEGF表达的免疫组化观察 (×200) |
2.3 四组裸鼠皮下移植瘤组织中CD31的表达情况
联合组裸鼠的CD31阳性表达率明显低于其他3组裸鼠(P < 0.05)，具体数据见表 2所示，免疫组化分析结果见图 5所示。
| 组别 | 阳性 | 阴性 |
| 苦参素组 | 9(90.00) | 1(10.00) |
| 顺铂组 | 7(70.00) | 3(30.00) |
| 联合组 | 3(30.00)a | 7(70.00) |
| 对照组 | 10(100.00) | 0(0.00) |
| a：联合组CD31阳性检出率与苦参素组比较χ2=7.500;P=0.006，与顺铂组比较χ2=4.967;P=0.031，与对照组比较比较χ2=10.769;P=0.001 | ||
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| A：苦参素组; B：顺铂组; C：联合组; D：对照组 图 5 各组裸鼠皮下移植瘤组织CD31表达的免疫组化观察 (×200) |
3 讨论
虽然世界各国医疗领域在肝癌方面已经取得了可喜的研究进展，但现阶段肝癌仍是危害人类生命健康的主要恶性肿瘤疾病，距统计全球范围内每年约有69万人死于肝癌，其中约有50%的患者在我国[5-6]。目前，被世界广泛认可的肝癌治疗方式为手术、放疗、化疗等。由于受多种因素的影响，一部分患者难以耐受手术，多选择接受化疗，常用的药物包括顺铂、苦参素等[7-9]。
顺铂是现阶段我国临床上应用较广泛的一线抗癌药物，抗癌功效可靠，当大剂量使用易发生毒副反应。苦参素为从中药中提取的以红车轴草苷、黄酮类化合物、氧化苦参碱为主要成分的生物碱。大量药理研究已经证实，该药物对直肠癌、肝癌、胃癌等细胞均具有较强的杀伤力，且与顺铂联合应用能够发挥中和药性的效果，在不影响患者化疗疗效的同时，能够减轻顺铂的毒副作用。
本研究分析苦参素与顺铂合用对人肝癌裸鼠皮下移植瘤组织VEGF、CD31表达的影响。我国医疗领域关于VEGF的研究较多，关于CD31的研究相对较少。VEGF是血管生成过程中的主要促进因子，肿瘤细胞产生的VEGF能够以自分泌的方式作用于肿瘤细胞半身，促进肿瘤细胞增生，或通过旁分泌的方式促进血管内皮分裂，增加血管通透性。研究证实该因子在多种恶性肿瘤病理组织有表达，其阳性表达率升高往往代表恶性肿瘤细胞的血管生成能增强，发生细胞转移的风险增大[10-11]。CD31主要分布在脉管细胞上，既往研究证实CD31与内皮细胞运动及血管生成均存在密切关系，参与和介导了多种肿瘤细胞黏附在内皮细胞上的过程，其阳性表达能够促进恶性肿瘤细胞的转移[12-13]。多数研究学者认为，两者的表达变化能够在一定程度上反映肿瘤在机体内的生长情况[14-15]。为进一步验证苦参素与顺铂联合对肝癌细胞的作用，并初步探讨其机制是否是通过影响肿瘤血管生成而发挥，明确两者在肿瘤组织中表达的临床意义，我院开展了动物研究。
本研究结果显示联合组裸鼠的给药15 d后的移植瘤体积明显小于其他3组裸鼠，VEGF、CD31阳性表达率均较苦参素组、顺铂组和对照组裸鼠低，存在的差异具有统计学意义。分析得到上述研究结果的原因可能为：顺铂对肿瘤DNA的复制作用并无特异性，在发挥抑制肿瘤增殖作用的同时，也会造成正常细胞的死亡，故VEGF、CD31的阳性表达率仍然较高。苦参素的肿瘤抑制作用不及顺铂，但两者联合应用能够发挥协同作用。对上述研究结果进行分析和总结，本研究得出苦参素与顺铂联合应用，能够有效抑制VEGF、CD31的表达，发挥良好的抗肝癌效果。
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