LIANG Houjie, E-mail: lianghoujie@sina.com
结肠癌是死亡率较高的疾病之一,发生转移是其致死的主要原因[1-3]。据统计,晚期结肠癌患者发生肝转移的比例高达50.94%,发生肺转移的比例达40.25%[4-6]。虽然目前对结肠癌的转移机制已有较深的认识,但有效防止结肠癌转移的措施依然不够完善[7]。近来研究表明:代谢重编程是肿瘤恶性进展的关键基础及重要特征[8]。糖脂代谢重编程对肿瘤恶性进展的调控作用已为人熟知[9],而氨基酸代谢对肿瘤进展的调控作用报道甚少。谷氨酰胺是人体内常见的一种氨基酸,广泛分布于全身各器官组织;谷氨酰胺不仅能被用来运输游离铵离子,达到解毒效果,还可以被用来合成蛋白质和核苷酸[10-13]。谷氨酰胺合成酶(glutamine synthetase,GS)可催化谷氨酸和铵离子合成谷氨酰胺,是体内合成谷氨酰胺的关键酶。新近研究表明:肿瘤细胞可以利用多种来源的谷氨酰胺来满足其代谢需求[14-16];且肿瘤细胞GS可以促使其核苷酸生物合成[17],促进肿瘤的发生、进展和转移,从而调控其恶性表型[18-20]。然而,脂肪细胞中谷氨酰胺代谢的改变对肿瘤恶性进展的影响尚不明确。本研究拟通过GS转基因条件性干预脂肪细胞谷氨酰胺代谢,进一步在细胞及小鼠移植瘤模型上,考察脂肪细胞GS对结肠癌肝、肺转移的调控作用,以期拓展对脂肪细胞GS新功能的认识,并有望为临床上防止结肠癌的转移提供潜在的干预策略。
1 材料与方法 1.1 主要材料结肠癌细胞系MC38、CT26由本实验室冻存,恒温、恒湿CO2培养箱(美国Thermo Forma公司),低速冷冻离心机(美国Backman公司),高速冷冻离心机(日立公司,TGL-16G-A),Western blot配胶、电泳、转膜、GelDoc2000凝胶成像系统及显色曝光装置(Bio-Rad公司),紫外分光光度计(美国Backman公司),微孔板读数仪(Biotech公司),光学显微镜(日本Olympus公司),金属浴加热装置(Fisher Sci),多功能酶标读数仪(美国Thermo Scientific公司),Calibur流式细胞仪(美国BD公司)。
主要试剂:DMEM高糖培养基(美国HyClone公司),胎牛血清(fetal bovine serum, FBS, 美国HyClone公司),0.25%胰蛋白酶(美国HyClone公司),DMSO(美国BIOSHARP公司),RIPA蛋白提取试剂盒、PIERCE BCA蛋白浓度测定试剂盒等Western blot相关试剂均由上海碧云天生物工程有限公司提供,CCK-8细胞增殖试剂盒(日本同仁公司),细胞凋亡试剂盒Annexin V-FITC(AO2001-02A-H,Sungene Biotech,China),Transwell小室(Corning公司),6孔板、24孔板、96孔板,结晶紫染料(上海碧云天生物工程有限公司)。
实验动物:TgGS小鼠(117只)由广州赛业公司提供,WT小鼠(57只)由第三军医大学实验动物中心提供,雄性,6周龄,体质量18~20 g。小鼠均正常饲养于第三军医大学中心实验室动物房,保持正常饮食、饮水及通风状态,12 h :12 h明暗交替。
1.2 方法 1.2.1 PCR鉴定取1只6周龄的TgGS小鼠并将其固定,用打孔钳打耳标,记录编号。再用无菌剪刀剪2~3 cm鼠尾,置于离心管内,编号后备用。用打火机轻灼鼠尾残端数秒以止血,再将其放回笼子内继续饲养。依次重复上述步骤取完所有待测样品。将剪好的小鼠尾巴分别置于离心管内,依次向每管内加入0.5 mmol/L氢氧化钠溶液100 μL,放入95 ℃恒温箱内煮1 h,再依次加入1 mmol/L Tris-base溶液20 μL,放入离心机离心,取上清。按照试剂盒配置20 μL PCR体系,PCR仪内扩增100 min,琼脂糖凝胶电泳40 min,再置于GelDoc2000凝胶成像系统上分析处理(GS引物上游:5′-GACATGATGCAGGTCCTGATTGG-3′,下游:5′-GGG-TCTTGCAGCGCAGTCCTT-3′,退火温度:60 ℃,片段大小:248 bp)。实验重复3次。
1.2.2 Western blot检测将提取的新鲜小鼠内脏组织用碎组织机均匀磨碎,再加入适量RIPA蛋白裂解液充分裂解30 min(整个过程在冰上进行),然后放入离心机离心,将上清移入新的离心管内做好标记备用。按照PIERCE BCA蛋白定量试剂盒说明测定蛋白浓度,计算上样量。SDS-PAGE电泳分离蛋白(80 V跑浓缩胶,120 V跑分离胶),再用250 mA恒流转膜2 h。用5%BSA封闭液室温封闭1 h,孵育一抗(GS,1%BSA 1 :1 000稀释),4 ℃孵箱过夜。PBST洗膜3次,5 min/次。孵育二抗(1%BSA 1 :5 000稀释),室温孵育1 h。PBST洗膜3次,5 min/次。配置ECL显影液(白瓶:棕瓶=1 :1),将显影液均匀滴在膜上,置于GelDoc2000凝胶成像系统上曝光,保存实验结果。实验重复3次。
1.2.3 细胞培养将MC38结肠癌细胞及CT26结肠癌细胞接种于盛有适量10%DMEM培养基[DMEM培养基(无血清)+10%(体积比)FBS]的培养瓶, 在5%CO2、37℃恒温、恒湿培养箱中培养。
1.2.4 脂肪细胞条件培养基的制备分别选取6周龄雄性TgGS小鼠及WT小鼠各2只,颈椎脱臼法处死,剪刀剪开腹部皮肤,充分暴露腹膜,剪开腹膜,迅速找到附睾脂肪块并取出,放入盛有PBS的EP管内。用上述方法分别取出TgGS小鼠及WT小鼠的附睾脂肪块。将取出的脂肪块分别放入盛有5%DMEM培养基[DMEM培养基(无血清)+5%(体积比)FBS]中的6孔板内培养48 h,吸取6孔板内上清液分装于离心管内-20 ℃保存,此为脂肪细胞条件培养基(conditional media,CM)。
1.2.5 CCK-8检测细胞增殖在96孔板中分别接种处于对数生长期的MC38结肠癌细胞及CT26结肠癌细胞,加入100 μL 5%DMEM培养基培养,每孔100 μL培养基中含3 000个细胞,每组5个复孔。置于5%CO2、37 ℃恒温、恒湿培养箱中培养12 h,待细胞贴壁后除去原有培养基,再分别加入100 μL TgGS及WT脂肪细胞条件培养基继续培养,每隔24 h更换1次脂肪细胞条件培养基以保证细胞正常生长。于0、6、12、24、48 h分别测定细胞增殖活力:除去孔内培养基,于每孔内加入100 μL的CCK-8试剂混合液(5%DMEM 6 mL+CCK-8试剂600 μL),置于5%CO2、37 ℃恒温、恒湿培养箱中继续培养1 h, 之后取出96孔板,在酶标仪上测定波长450 nm处各孔光密度值[D(450)],绘制细胞增殖活力曲线。实验重复3次。
1.2.6 Annexin V-FITC法检测细胞凋亡在6孔板中分别接种处于对数生长期的MC38结肠癌细胞及CT26结肠癌细胞,加入2 mL 5%DMEM培养基培养,每孔2 mL培养基中含2×105个细胞,每组3个复孔。置于5%CO2、37 ℃恒温、恒湿培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后除去原有培养基,再分别加入2 mL TgGS及WT脂肪细胞条件培养基继续培养24 h。除去脂肪细胞条件培养基,0.25%胰酶消化后收集细胞悬液,离心后弃上清液,用PBS洗2次,再加入100 μL标记液常温避光孵育15 min,用PBS再洗涤1次后再加入100 μL荧光(SA-FLOUS)溶液4℃避光孵育20 min,流式细胞仪分析细胞凋亡情况。实验重复3次。
1.2.7 细胞划痕实验在6孔板内分别接种处于对数生长期的MC38结肠癌细胞及CT26结肠癌细胞,加入2 mL 5%DMEM培养基培养,每孔2 mL培养基中含1×105个细胞,每组3个复孔,置于5%CO2、37 ℃恒温、恒湿培养箱中培养24 h,待细胞贴壁后除去原有培养基。用200 μL枪头均匀在每个孔内划痕,加入PBS洗3遍,尽量洗去被划落的细胞。再分别加入2 mL TgGS及WT脂肪细胞条件培养基,拍照。继续在5%CO2、37 ℃恒温、恒湿培养箱中培养,每隔24 h换液1次。分别在12、24、48 h后拍照。用Image J软件处理图片,计算细胞迁移面积。实验重复3次。
1.2.8 Transwell实验取1块24孔板,加入10个Transwell小室,每组5个复孔,依次向每个小室内加入150 μL无血清的DMEM培养基,再依次于小室内接种对数生长期的MC38结肠癌细胞及CT26结肠癌细胞,每孔150 μL培养基中含2×104个细胞。分别沿24孔板孔壁缓慢加入脂肪细胞条件培养基500 μL,置于5%CO2、37℃恒温、恒湿培养箱中培养8 h。待细胞贴壁后依次除去Transwell小室及孔内培养基,PBS清洗3遍,10 min/次。沿着孔壁依次加入500 μL多聚甲醛固定30 min后,除去多聚甲醛。再沿着孔壁依次加入500 μL结晶紫染色10 min,除去结晶紫染料。将Transwell小室置于蒸馏水内漂洗3次,用棉签轻轻将小室内壁的水珠擦干,将小室置于通风处待其风干(2~3 d)。用刀片轻轻挂下已风干的小室底膜,置于玻片上封片,注意不要产生气泡,将封片置于通风处待其风干(1~2 d)后显微镜下拍照,处理图片及数据。实验重复3次。
1.2.9 标本采集分别选取6周大小的雄性TgGS小鼠及WT小鼠各15只,按随机数字表法分成3组,每组5只。取待注射小鼠1只,用固定装置将其固定好,将其尾巴拉直,绷紧。酒精擦拭尾巴,使其尾部血管扩张。在距尾尖1/4或1/3处进针,针头与桌面平行,针尖稍朝下,注射MC38结肠癌细胞(1×106/只)。完成注射后观察10 min。于尾静脉注射4周后处死所有小鼠,依次分别取出TgGS小鼠及WT小鼠的肺脏及肝脏,观察两组小鼠肺脏及肝脏的大体形态及转移情况,再依次取出肺转移瘤,观察并对比其大小,记录其质量;最后用多聚甲醛固定肺脏及肝脏,2周后做HE染色切片,观察转移瘤病理特征。
1.3 统计学分析计量资料以x±s表示,采用SPSS 18.0统计软件,组间比较采用t检验。以P < 0.05表示差异有统计学意义。
2 结果 2.1 TgGS小鼠基因型的鉴定采用PCR技术鉴定TgGS小鼠的DNA表达。除5、7、8、13、17为GS阴性小鼠外,其余小鼠均为GS阳性小鼠(图 1)。
2.2 TgGS小鼠脂肪组织GS蛋白表达明显上调
采用Western blot检测WT小鼠及TgGS小鼠各器官组织的GS蛋白表达,结果显示:与WT小鼠比较,TgGS小鼠的脂肪组织GS蛋白表达明显升高(P < 0.05,图 2),而其他重要脏器GS蛋白表达差异无统计学意义(P>0.05)。表明TgGS小鼠较之WT小鼠的脂肪组织GS蛋白表达明显上调。
2.3 两种脂肪细胞条件培养基对结肠癌细胞增殖的影响
分别用TgGS小鼠及WT小鼠的脂肪细胞条件培养基处理MC38和CT26结肠癌细胞,CCK-8法检测细胞增殖活力。结果显示:两种结肠癌细胞在两种处理条件下的增殖活力差异无统计学意义(P>0.05,图 3),提示脂肪细胞GS对结肠癌细胞的增殖无明显影响。
2.4 两种脂肪细胞条件培养基对结肠癌细胞凋亡的影响
分别用TgGS小鼠及WT小鼠的脂肪细胞条件培养基处理MC38和CT26结肠癌细胞,采用流式细胞仪检测细胞凋亡情况(图 4)。结果显示:两种结肠癌细胞在两种处理条件下的凋亡率差异均无统计学意义(MC38:8.81±1.78 vs 8.98±0.98,CT26:9.33±0.89 vs 9.26±1.01,P均>0.05),提示脂肪细胞GS对结肠癌细胞的凋亡无明显影响。
2.5 脂肪细胞GS抑制结肠癌细胞的迁移能力
分别用TgGS小鼠及WT小鼠脂肪细胞条件培养基处理MC38结肠癌细胞和CT26结肠癌细胞,通过划痕实验及Transwell实验检测两种细胞在不同处理条件下的迁移能力。划痕实验(图 5)结果显示:TgGS小鼠脂肪细胞条件培养基可以抑制结肠癌细胞的迁移能力(MC38:68.91±1.68 vs 38.58±2.57,CT26:71.95±2.09 vs 39.25±2.18,P均<0.05);Transwell实验(图 6、7)结果显示:TgGS小鼠脂肪细胞条件培养基可以抑制结肠癌细胞的迁移能力(MC38:67.33±5.69 vs 25.00±9.17,CT26:82.67±6.51 vs 31.00±6.56,P < 0.05)。划痕实验及Transwell实验均提示脂肪细胞GS可以抑制结肠癌细胞的迁移能力。
2.6 脂肪细胞GS抑制结肠癌细胞的肺、肝转移
通过尾静脉分别对TgGS小鼠及WT小鼠注射MC38结肠癌细胞建立肿瘤血行转移小鼠模型,4周后处死所有小鼠,通过HE病理切片观察肺、肝转移瘤的病理特点。与WT小鼠比较,TgGS小鼠肺转移瘤的数量明显较少,体积明显较小(图 8A),HE病理切片可见TgGS小鼠肺转移瘤的大小及数量均小于WT小鼠(图 8B、C),且发生肺转移的数量明显减少[(3.33± 0.58) vs (4.67±0.58)只,P < 0.05],肺转移瘤的质量明显降低[(201.83±10.51) vs (404.12±17.64)mg,P < 0.01];部分WT小鼠的肝脏大小、颜色、质地均发生肉眼改变(图 9A),HE病理切片可见肝脏转移瘤的存在(图 9B、C),与WT小鼠比较,TgGS小鼠肝脏质量明显较小[(2.16±0.07) vs (2.90±0.22)g,P < 0.05],未发生肝转移[0 vs(1.33±0.58)只,P < 0.05]。提示脂肪细胞GS可以抑制结肠癌细胞的肺、肝转移。
3 讨论
结肠癌致死率高居肿瘤类第4位,并且仍有逐年上升趋势[21]。尽管外科手术和内科辅助化疗在疾病早期有效,但是肿瘤复发和发生转移时常发生, 且此时传统治疗效果往往不佳[22]。结肠癌患者发生转移往往是其死亡的主要原因,其中又以肝、肺转移最为常见[5-7]。所以对肿瘤转移相关通路的研究就显得尤为重要。已有研究报道:肿瘤的代谢重编程能够改变肿瘤的代谢微环境,在肿瘤的进展过程中有着至关重要的作用,主要包括肿瘤细胞的代谢重编程和肿瘤间质细胞的代谢重编程[8]。其中,糖类及脂类代谢重编程对肿瘤恶性进展的相关研究日趋成熟。作为三大营养物质之一的蛋白质,其前体氨基酸与肿瘤代谢相关方面的研究也逐渐成为近年来的研究热点。谷氨酰胺广泛分布于全身各器官组织内,虽然不是人体内的必需氨基酸,但却功能多样:能被细胞用来运输游离铵离子,达到解毒效果;在摄取必需氨基酸和激活TOR样因子的过程中起重要作用;能够保持线粒体膜蛋白的稳定性和完整性;能被用来合成蛋白质和核苷酸等[10-13]。已有研究报道:某些肿瘤细胞可以通过利用谷氨酰胺来满足其生长、增殖;还有一些肿瘤细胞能够大量摄入和合成谷氨酰胺来为自身三羧酸循环提供原料,进而为肿瘤的生长提供能量。GS可催化谷氨酸和铵离子合成谷氨酰胺,是体内合成谷氨酰胺的关键酶。相关研究报道:通过抑制某些肿瘤模型中的谷氨酰胺酶,使谷氨酰胺分解成谷氨酸,能够抑制肿瘤的增殖和恶性进展[23]。这里的谷氨酰胺酶催化的反应正是谷氨酰胺合成酶催化反应的逆反应。并且许多肿瘤相关信号通路都能调控GS的表达[20]。所以,探讨GS与肿瘤恶性进展的相关研究成为当下研究热点之一。
本研究首先分别从DNA水平和蛋白表达水平上鉴定TgGS小鼠,证实已成功构建脂肪细胞GS蛋白高表达的TgGS小鼠。接着通过TgGS小鼠脂肪细胞条件培养基处理结肠癌细胞,检测肿瘤相关生物学特性(增殖、迁移、凋亡等),发现脂肪细胞GS能够抑制结肠癌细胞的迁移能力,而对其增殖和凋亡却无明显影响。进一步的体内实验发现,TgGS小鼠肺转移瘤的大小和数量明显少于WT小鼠,且TgGS小鼠更不易发生肝转移。至此,从体内实验与体外实验两个方面证明了我们的猜想:脂肪细胞GS能够抑制结肠癌细胞的肝、肺转移。本研究以GS为切入点,从谷氨酰胺代谢的角度寻找GS对结肠癌血行转移的调控作用,提出GS可以调控结肠癌的恶性表型,并鉴定了GS能够抑制结肠癌细胞的侵袭转移能力,旨在阐明GS是如何调控结肠癌的恶性进展,对于临床发生转移的晚期结肠癌患者的治疗有着重要意义。
本研究只初步鉴定了脂肪细胞GS能够抑制结肠癌细胞的迁移及转移能力,而对其如何调控结肠癌细胞迁移及转移的机制却尚未阐明。相关研究表明:GS参与调控了多种肿瘤相关重要的途径:参与介导炎症因子的释放过程;参与调控mTOR受体的激活;参与调控B细胞的自噬;参与调控T细胞的募集等[24]。新近研究表明:肿瘤发生代谢重编程是其恶性进展的重要环节,例如:卵巢癌能获取脂肪细胞来源的脂肪酸作为能量底物,从而促进其生长、转移[9];前列腺癌相关的成纤维细胞发生糖代谢及氨基酸代谢重编程,可促进炎症反应及肿瘤生长[25];间充质干细胞可以分泌特异的脂肪酸引起化疗抵抗[26]。本课题组前期研究也发现,肿瘤相关巨噬细胞的ABHD5可以通过抑制亚精胺的生成从而促进结肠癌的生长[8]。作为体内重要内分泌器官之一,脂肪组织能够分泌多种“因子”,为肿瘤的生长、转移提供必要的能量和原料,是肿瘤代谢重编程的重要一环。所以,我们大胆猜测脂肪细胞GS抑制结肠癌细胞肝、肺转移的机制可能为:脂肪细胞GS可能引起谷氨酰胺代谢的上游底物或者下游产物发生改变,进而影响脂肪细胞的分泌活性,导致脂肪来源的某种“因子”水平紊乱,进而改变肿瘤的代谢微环境,导致肿瘤细胞的迁移和转移活性发生改变。下一步研究将探索谷氨酰胺代谢过程中是何种物质的改变影响了肿瘤的代谢重编程,从而影响了肿瘤细胞的迁移和转移能力。同时,在体内和体外使用该“物质”重复之前的实验,并且希望能够找到该“物质”的抑制剂加以干预,从正反两个方面验证已有结论,为临床上发生转移的晚期结肠癌患者提供一种新的治疗途径。
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