2. 400037 重庆，第三军医大学新桥医院：内分泌科
2. Department of Endocrinology, Xinqiao Hospital, Third Military Medical University, Chongqing, 400037, China
YANG Shiming, E-mail:shimingyang@yahoo.com
随着生活质量的提高，非酒精性脂肪肝(non-alcoholic fatty liver disease, NAFLD)的发生率也越来越高，在正常人群的发生率为20%[1]，在肥胖人群发生率可高达75%[2]，其主要病理表现为肝细胞内脂质沉积[3]。NAFLD最终可能引起肝硬化，甚至肝脏肿瘤[4-5]，已严重威胁到人类健康。肝脏是调控机体脂代谢的重要器官[6]，参与脂质合成、脂质分解、脂蛋白合成与分泌等过程，而肝细胞脂代谢紊乱是导致NAFLD发生、发展的重要原因[7]。目前临床对肝脏脂代谢紊乱治疗并未获得良好的效果，因此，寻找新的干预措施成为今后研究的关键。
近年，研究发现自噬也参与肝脏脂代谢过程，且发挥着重要作用[8]。研究证实，细胞内脂滴与自噬标志分子LC3在饥饿状态下共定位于细胞溶酶体，提示自噬可以介导脂滴运输到溶酶体进行降解[9]。溶酶体是细胞内自噬完成的主要场所，其内含有高浓度的酸性水解酶，用以降解被包裹受损的细胞器、蛋白质等大分子物质。溶酶体相关膜蛋白家族(lysosome associated membrane proteins, LAMPs)参与维持溶酶体膜结构的完整性[10]。小鼠LAMP2基因缺陷能减少高脂饮食诱导的肥胖[11]，说明LAMP2在肝细胞脂代谢中具有重要作用。此外，LAMP2已被报道在甲状腺素诱导的肝细胞脂代谢中表达上调[12]；LAMP3是溶酶体相关膜蛋白家族成员之一，在氨基酸序列及结构上与LAMP2非常相似。正常情况下，LAMP3在内皮细胞、肺上皮细胞中表达[13]。近年研究表明，LAMP3在多种肿瘤中表达升高，且与肿瘤的不良预后密切相关[14-15]，但其在脂代谢中的作用并不清楚。缺氧诱导的PERK信号通路可显著上调LAMP3的表达，而PERK信号通路在脂质合成过程中具有重要作用[16]。这些研究结果提示，LAMP3在脂质代谢中可能具有重要作用。本研究检测高脂处理后肝细胞中LAMP3的表达变化，通过基因过表达手段检测LAMP3对肝细胞脂质合成、脂质分解水平，以及脂代谢过程中关键基因表达变化的影响，以期为肝脏脂代谢紊乱的治疗研究提供实验基础。
1 材料与方法 1.1 主要试剂棕榈酸(P5585-10G)、油酸(O1008-5G)、油红O(O0625)、苏木精(H9627)购于Sigma公司，无脂肪酸BSA(4197)购于Cell Maxx公司，Lipofectamin 3000(L3000015)购于Invitrogen公司，TRNzol总RNA提取试剂(DP405)购于天根生化科技有限公司，逆转录试剂盒(RR047A)及荧光定量PCR试剂盒(RR820A)购于TaKaRa公司，甘油三酯检测试剂盒(E1013-105)购于北京普利莱公司，ATP检测试剂盒(S0026B)购于碧云天公司，β-羟基丁酸检测试剂盒(69-98591)购于默沙克公司，BCA蛋白浓度测定试剂盒(P0010)、蛋白裂解液(P0013B)购于碧云天生物科技有限公司，用于免疫印迹的抗体anti-LAMP3(sc-98657)、anti-GAPDH (sc-47724)购于Santa Cruz公司，anti-PPARγ(C26H12)购于Cell Signaling Technology公司，anti-SCD-1(ab19862)购于Abcam公司。
1.2 细胞培养人肝癌细胞系Huh7购于上海中国科学院细胞库，用含10%胎牛血清的DMEM(Life technology)培养于37 ℃，5% CO2培养箱内。
1.3 游离脂肪酸配制使用0.1 mol/L氢氧化钠溶液配制100 mmol/L棕榈酸储存液与100 mmol/L油酸溶液，再配制10%无脂肪酸BSA溶液。将棕榈酸与油酸以1 :2的比例加入10% BSA得到5 mmol/L的游离脂肪酸(free fatty acids，FFAs)溶液。55 ℃水浴10 min，冷却至室温后用0.22 μm针头式滤器过滤，-20 ℃储存。
1.4 载体构建与转染PCR扩增LAMP3基因编码区1 250 bp，并通过酶切位点NheⅠ和BamHⅠ克隆到过表达载体pcDNA3.1上。LAMP3编码区扩增引物：5′-GCTAGCATGCCCCGGCAGCTCAGCGC-3′，5′-GAATTCTTAGATTCTCTGGT-ATCCAGA-3′。构建好的过表达载体pcDNA3.1-LAMP3由Sanger测序鉴定。Huh7细胞接种于6孔板中，细胞汇合度达80%后，使用试剂Lipofectamin 3000瞬时转染过表达质粒，转染剂量为质粒1 μg/孔。
1.5 荧光定量PCR(quantitative real-time PCR, qRT-PCR)采用TRNzol试剂提取细胞总RNA，通过NanoDrop2000检测RNA浓度后，取1 μg mRNA逆转录为cDNA。PCR反应程序：95 ℃预变性3 min，95 ℃变性10 s，57 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，循环数40。引物序列见表 1。
| 基因名 | 引物序列(5′→3′) | 片段大小(bp) |
| LAMP3 | 上游GGGAGCCTATTTGACCGTCT 下游AGGCTTGAAGTTGGACATCG |
170 |
| PPARγ | 上游CATAAAGTCCTTCCCGCTGA 下游CATAAAGTCCTTCCCGCTGA |
158 |
| SCD-1 | 上游GCACCACAGCATATCGCAAG 下游TCCAGAGGAGGTACTACAAACCT |
135 |
| CPT1A | 上游GCACATCGTCGTGTACCATC 下游AATAGGCCTGACGACACCTG |
160 |
| PGC-1α | 上游TCCTTTGGGGTCTTTGAGAA 下游GGCACGCAATCCTATTCATT |
117 |
| GAPDH | 上游CTCCTCCTGTTCGACAGTCAGC 下游CCCAATACGACCAAATCCGTT |
130 |
1.6 油红染色
称取0.5 g油红粉末溶于100 mL异丙醇中，配制为油红储存液。储存液使用前，以油红:水为3 :2的比例稀释，再用中性滤纸过滤备用。取出处理后的细胞，PBS洗两遍后使用4%多聚甲醛固定30 min；加入油红染液500 μL，染色15 min；再用苏木精复染60 s，PBS洗去多余染液，封片，10×光学显微镜下拍照。油红定量时，在油红染色结束后直接加入100%异丙醇溶液溶解脂滴，用酶标仪(SpectraMax i3x)进行油红量化检测[检测D(520)值]。
1.7 甘油三酯、ATP、β-羟基丁酸检测甘油三酯检测，使用裂解液冰上裂解细胞后，70 ℃水浴加热10 min，2 000 r/min离心5 min，取10 μL上清加入190 μL工作液后用酶标仪(550 nm)检测甘油三酯含量。ATP检测时，冰上裂解细胞，4 ℃ 12 000×g离心5 min，取20 μL上清加入100 μL工作液中，采用酶标仪测定细胞ATP浓度。使用人β-羟基丁酸ELIISA试剂盒检测细胞培养上清中β-羟基丁酸含量。
1.8 Western blot检测细胞转染质粒48 h后收集细胞，使用裂解液于冰上裂解细胞30 min。采用BCA法测定蛋白浓度，按体积加入5×上样缓冲液，100 ℃水浴加热5 min，再使用超声细胞破碎仪(SJIALAB)超声2 min(10%超声强度)破碎细胞，4 ℃ 12 000×g离心10 min取上清。Western blot具体操作如下：将提取蛋白进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(80~120 V)后，转移至PVDF膜上，封闭，加一抗(1 :500~1 :1 000)4 ℃孵育过夜，加二抗(1 :3 000)37 ℃孵育2 h，显色检测并使用化学发光成像分析系统(Vilber，Fusion FX5S)采集图片。
1.9 统计学方法使用SPSS 13.0软件分析，计量资料数据以x±s表示，两组间比较采用t检验，检验水准α=0.05。
2 结果 2.1 高脂处理后肝细胞LAMP3表达上调为了观察肝细胞在高脂条件下LAMP3在肝细胞中的表达变化，我们用游离脂肪酸0.4 mmol/L处理肝癌细胞系(Huh7)24 h，采用qRT-PCR及Western blot法检测Huh7细胞中LAMP3表达变化。结果显示高脂处理Huh7细胞后，LAMP3表达显著上调(图 1)，表明LAMP3在肝细胞脂代谢中可能具有调节作用。
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| 1：对照组(10% BSA)；2：0.4 mmol/L FFAs A：qRT-PCR检测LAMP3 mRNA表达水平；B：Western blot检测LAMP3蛋白表达水平a:P < 0.05，与对照组比较 图 1 LAMP3在高脂环境下的表达水平增高 |
2.2 过表达LAMP3促进FFAs诱导的肝细胞脂质沉积
为了阐明LAMP3在肝细胞脂质代谢中的作用，Huh7细胞分别在正常环境(10% BSA)及高脂环境下(0.4 mmol/L FFAs)外源性过表达LAMP3，使用油红染色及甘油三酯试剂盒检测细胞内脂质变化。结果显示，在高脂环境下(0.4 mmol/L FFAs)，Huh7细胞过表达LAMP3 24 h，收集细胞，Huh7细胞中脂滴沉积显著增加(P < 0.05，图 2A、B)，细胞内甘油三酯含量也明显升高(P < 0.05，图 2C)，说明过表达LAMP3促进FFAs诱导的肝细胞脂质沉积。
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| A：油红染色检测细胞内脂滴沉积；B：油红定量分析；C：甘油三酯水平a:P < 0.05，与10% BSA比较 图 2 LAMP3促进FFAs诱导的肝细胞脂质沉积 |
2.3 LAMP3对肝细胞脂质分解无明显作用
由于肝细胞脂质沉积可由脂质合成增加和脂质分解减少引起，所以我们在Huh7细胞中LAMP3表达后，检测了脂质分解代谢产物ATP和β-羟基丁酸的含量变化。结果显示，Huh7细胞转染pcDNA3.1或pcDNA3.1-LAMP3 6 h后，加10% BSA或0.4 mmol/L FFAs处理24 h，细胞中ATP和β-羟基丁酸的含量均无显著变化(图 3)，表明LAMP3对肝细胞脂质分解代谢无明显作用，其过表达引起的细胞脂质沉积主要由脂质合成增加导致。
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| A：ATP含量；B：β-羟基丁酸含量 图 3 LAMP3对肝细胞脂质分解的影响 |
2.4 过表达LAMP3促进肝细胞脂合成基因表达
为了进一步阐明LAMP3在脂质代谢过程中的作用，我们在Huh7细胞过表达LAMP3后，用qRT-PCR检测Huh7细胞脂质合成与分解代谢过程中重要基因的表达水平变化。Huh7细胞转染pcDNA3.1或pcDNA3.1-LAMP3 6 h后，加入0.4 mmol/L FFAs处理24 h。检测结果显示，pcDNA3.1-LAMP3转染组细胞中LAMP3 mRNA和蛋白表达水平显著升高(P < 0.01，图 4A、F)；qPCR筛选发现脂合成重要基因PPARγ和SCD-1的表达升高(P < 0.05，图 4B、C)。LAMP3过表达对脂肪酸分解代谢重要基因CPT1A、PGC-1α的表达无明显调控作用(图 4D、E)。为了进一步验证LAMP3对脂合成基因的促进作用，采用Western blot法检测PPARγ和SCD-1的蛋白表达水平，发现过表达LAMP3后，二者的蛋白表达水平均显著升高(图 4F)。以上结果表明LAMP3主要调控脂质合成代谢。
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| 1：pcDNA3.1；2：LAMP3 A：qRT-PCR检测LAMP3过表达效率检测；B、C：qRT-PCR检测脂肪合成代谢基因PPARγ、SCD-1表达；D、E：q-PCR检查脂肪酸分解代谢基因CPT1A、PGC-1α的表达水平；F：Western blot检测LAMP3、PPARγ、SCD-1蛋白表达a:P < 0.05，b:P < 0.01，与pcDNA3.1比较 图 4 过表达LAMP3促进脂合成相关基因表达 |
3 讨论
本研究初步探索LAMP3在肝细胞脂质代谢中的调控作用，发现在高脂环境下，肝细胞LAMP3的表达显著上调；而上调LAMP3可促进肝细胞Huh7内脂质沉积，进而发现上调LAMP3可显著促进脂合成基因PPARγ与SCD-1的表达。然而LAMP3上调后，Huh7细胞中脂质分解代谢产物ATP[17]和β-羟基丁酸[18]的含量无显著变化，脂肪分解过程重要基因CPT1A、PGC-1α的表达也无明显变化。说明LAMP3可能主要通过促进脂肪合成从而促进肝细胞脂质沉积，而对脂质分解代谢无明显影响。目前，关于LAMP3的研究较为单一，主要集中在对肿瘤转移与预后的作用研究[14, 19-20]。本研究发现LAMP3在促进肝细胞脂质合成代谢中具有重要的调控作用，为该基因在未来的研究中开拓了新的方向，同时也为肝脏脂代谢调控网络的相关研究提供新的思路。
本研究发现，LAMP3上调脂质合成相关基因(PPARγ及SCD-1)的表达。其中PPARγ属于核受体超家族PPARs成员之一，该家族主要调控糖脂代谢中多种基因的表达及细胞增殖、分化等过程。PPARγ主要调控脂肪细胞分化，促进脂合成[21]。研究发现，PPARγ在ob/ob肥胖小鼠肝脏及肥胖NAFLD患者肝脏中表达升高[22-23]。PPARγ基因缺陷的ob/ob小鼠肝脏脂滴与甘油三酯均较AlbCre转基因ob/ob-PPARγ(fl/fl)小鼠明显降低[24]，说明PPARγ在肝脏脂质合成中发挥重要作用。另外，SCD-1参与单不饱和脂肪酸的合成，在瘦素基因缺陷的ob/ob肥胖小鼠肝脏中SCD-1表达显著升高，SCD-1基因突变的ob/ob小鼠与正常ob/ob小鼠相比体质量、肝脏甘油三酯、低密度脂蛋白均显著降低，说明SCD-1在肝脏脂合成中也具有重要调控作用[25]。实验结果显示上调LAMP3能显著促进PPARγ与SCD-1表达，进一步证实LAMP3在调控脂质合成中的重要作用。
本研究目前未能对LAMP3促进肝细胞脂质合成的分子机制进行深入探索。在NAFLD中，肝细胞内质网应激也是促进疾病进展的重要因素[26-27]。内质网应激调控的PERK信号通路在肥胖小鼠及肥胖者肝脏中显著激活[28-29]，另外，PERK磷酸化水平的升高可促进脂合成重要基因FASN、SCD-1、ACL等的表达，促进脂质合成[30]。近年有研究表明缺氧诱导内质网应激的激活可通过PERK/eIF2a/ATF4信号通路显著上调LAMP3表达[16, 31-32]。因此，LAMP3促进肝细胞脂质合成的作用可能与内质网应激有关。此外，Akt/mTOR信号通路是促进肝细胞脂质合成的重要途径[33]，使用雷帕霉素抑制mTOR信号通路能明显改善高脂饮食诱导的小鼠肝脏脂质沉积[34]。激活Akt/mTOR信号通路可显著促进脂合成基因PPARγ与SCD-1的表达[35-36]，而本研究发现LAMP3过表达在促进肝细胞脂质合成的同时，也显著上调肝细胞PPARγ与SCD-1表达(图 4F)。那么LAMP3促进肝细胞脂质合成的作用是否与Akt/mTOR信号通路有关，后续研究将进一步探讨。
总之，本研究发现，LAMP3基因表达升高可以促进肝细胞脂质合成，但其具体的调控机制尚需进一步研究。
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